광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

요약

여기에서는 MIP-FISH(mid-infrared photothermal-FISH)라고도 하는 광학 광열 적외선 형광 in situ hybridization(OPTIR-FISH)을 사용하여 개별 세포를 식별하고 세포의 신진대사를 이해하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 single-cell resolution으로 세포 대사를 매핑하는 것을 포함하여 다양한 응용 분야에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

초록

복잡한 군집 내에서 개별 세포의 대사 활동을 이해하는 것은 인간 질병에서 세포의 역할을 밝히는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 rRNA 태그가 지정된 FISH 프로브와 동위원소 표지 기질을 결합하여 OPTIR-FISH 플랫폼을 사용한 동시 세포 식별 및 대사 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 형광 이미징은 rRNA 태그가 지정된 FISH 프로브의 특정 결합을 통해 세포를 식별하는 반면, OPTIR 이미징은 OPTIR 스펙트럼에서 동위원소 유도 적색 편이를 통해 단일 세포 내에서 대사 활동을 제공합니다. 이 프로토콜은 ¹³C-glucose로 배양된 박테리아를 테스트 베드로 사용하여 동위원소 라벨링, FISH(fluorescence in situ hybridization), 시료 전처리, OPTIR-FISH 이미징 설정 최적화 및 데이터 수집을 통한 미생물 배양을 간략하게 설명합니다. 또한 이미지 분석을 수행하고 높은 처리량으로 단일 셀 수준에서 스펙트럼 데이터를 해석하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 표준화되고 상세한 특성은 광범위한 단일 세포 대사 연구 커뮤니티 내에서 다양한 배경과 분야의 연구자들이 채택하는 데 큰 도움이 될 것입니다.

서문

세포 대사는 세포 생물학의 기본 기둥으로서 세포 건강, 기능 및 환경과의 상호 작용을 결정하는 많은 과정을 주도합니다. 개별 세포 수준, 특히 자연 환경 내에서 신진대사를 분석하면 생물학적 시스템의 이질적이고 복잡한 활동을 밝힐 수 있는 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다¹. 이는 미생물 연구에서 특히 중요한데, 많은 미생물이 전통적인 재배 방법에 도전하는 고유한 성장 요구 사항 또는 환경 의존성을 나타내기 때문이다². 예를 들어, 일부 종은 실험실 환경에서 쉽게 복제할 수 없는 특정 영양소 조성 또는 공생 관계를 필요로 할 수 있으므로 표준 기술로 배양할 수 없게 만들 수 있다³. 더욱이, 특정 종의 배양에 필요한 연장된 기간은 미생물 연구에 상당한 도전을 제기하며, 종종 연구 및 분석을 위한 실제 시간 프레임을 넘어서게 됩니다. 이러한 제한을 피하기 위해, 중합효소 연쇄 반응 및 형광 현장 교잡화(FISH)와 같은 대체 방법을 사용하면 배양 4 없이 미생물 종을 식별할 수^{있으며, 이를} 통해 미생물 생태계에 대한 보다 정확하고 전체적인 관점을 얻을....

프로토콜

이 연구에서 박테리아 표본의 사용은 Boston University의 IRB(Institutional Review Board)와 National Institute of Health의 지침에 따릅니다.

참고: 이 프로토콜에서 따르는 일반적인 워크플로는 그림 2에 요약되어 있습니다.

1. 박테리아 배양 및 동위원소 라벨링(그림 2A)

참고: 여기에 제공된 예는 순수 박테리아 배양액에 라벨을 부착하기 위한 것입니다. 이 프로토콜을 다미생물 군집에 적용하는 경우, 배지 및 라벨링 시간은 군집 및 관심 유기체의 생리학에 따라 조정되어야 합니다.

1. 트립틱 대두 육수(TSB) 또는 Luria-Bertani 육수(LB)와 같은 영양이 풍부한 배지에 단일 콜로니 및 사전 배양에서 관심 있는 박테리아 균주를 3시간 동안 접종하여 기하급수적 성장(log) 단계에 도달합니다. 대장균 BW25113는 이 프로토....

토론

여기에서는 단일 세포 분해능에서 미생물 종의 동시 식별과 대사 활동의 정량화를 위해 OPTIR-FISH 플랫폼을 적용하기 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 중요한 단계에는 특정 대사 활동을 연구하기 위한 안정 동위원소 표지를 사용한 배양과 표적 미생물 종을 식별하기 위한 형광 in situ hybridization이 포함됩니다. 선택한 파수에서 다중 채널 형광 이미징 및 O.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G