광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

요약

여기에서는 MIP-FISH(mid-infrared photothermal-FISH)라고도 하는 광학 광열 적외선 형광 in situ hybridization(OPTIR-FISH)을 사용하여 개별 세포를 식별하고 세포의 신진대사를 이해하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 single-cell resolution으로 세포 대사를 매핑하는 것을 포함하여 다양한 응용 분야에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

초록

복잡한 군집 내에서 개별 세포의 대사 활동을 이해하는 것은 인간 질병에서 세포의 역할을 밝히는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 rRNA 태그가 지정된 FISH 프로브와 동위원소 표지 기질을 결합하여 OPTIR-FISH 플랫폼을 사용한 동시 세포 식별 및 대사 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 형광 이미징은 rRNA 태그가 지정된 FISH 프로브의 특정 결합을 통해 세포를 식별하는 반면, OPTIR 이미징은 OPTIR 스펙트럼에서 동위원소 유도 적색 편이를 통해 단일 세포 내에서 대사 활동을 제공합니다. 이 프로토콜은 ¹³C-glucose로 배양된 박테리아를 테스트 베드로 사용하여 동위원소 라벨링, FISH(fluorescence in situ hybridization), 시료 전처리, OPTIR-FISH 이미징 설정 최적화 및 데이터 수집을 통한 미생물 배양을 간략하게 설명합니다. 또한 이미지 분석을 수행하고 높은 처리량으로 단일 셀 수준에서 스펙트럼 데이터를 해석하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 표준화되고 상세한 특성은 광범위한 단일 세포 대사 연구 커뮤니티 내에서 다양한 배경과 분야의 연구자들이 채택하는 데 큰 도움이 될 것입니다.

서문

세포 대사는 세포 생물학의 기본 기둥으로서 세포 건강, 기능 및 환경과의 상호 작용을 결정하는 많은 과정을 주도합니다. 개별 세포 수준, 특히 자연 환경 내에서 신진대사를 분석하면 생물학적 시스템의 이질적이고 복잡한 활동을 밝힐 수 있는 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다¹. 이는 미생물 연구에서 특히 중요한데, 많은 미생물이 전통적인 재배 방법에 도전하는 고유한 성장 요구 사항 또는 환경 의존성을 나타내기 때문이다². 예를 들어, 일부 종은 실험실 환경에서 쉽게 복제할 수 없는 특정 영양소 조성 또는 공생 관계를 필요로 할 수 있으므로 표준 기술로 배양할 수 없게 만들 수 있다³. 더욱이, 특정 종의 배양에 필요한 연장된 기간은 미생물 연구에 상당한 도전을 제기하며, 종종 연구 및 분석을 위한 실제 시간 프레임을 넘어서게 됩니다. 이러한 제한을 피하기 위해, 중합효소 연쇄 반응 및 형광 현장 교잡화(FISH)와 같은 대체 방법을 사용하면 배양 4 없이 미생물 종을 식별할 수^{있으며, 이를} 통해 미생물 생태계에 대한 보다 정확하고 전체적인 관점을 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 분석 기술로는 세포 대사를 규명할 수 있는 능력이 부족합니다. 이러한 격차는 미생물학 분야에서 진행 중인 과제, 즉 단일 세포 수준에서 세포 정체성을 구별하고 신진대사를 규명하는 동시 과제를 강조합니다. 안정 동위원소와 결합된 이미징 질량분석법(IMS)과 같은 기술의 발전은 단일 세포 대사 분석을 위한 강력한 도구로 부상했습니다⁵. 이 실험에서, 세포는 ¹³C 또는 ¹⁵N과 같은 동위 원소를 포함하는 기질로 배양되었습니다. 새로 동화 작용한 생체 분자는 이러한 동위 원소를 운반하여 m / z 스펙트럼에서 구별 할 수 있습니다. 그러나 IMS는 고가의 계측 장비, 복잡한 시료 전처리, 상대적으로 낮은 처리량 및 m/z 스펙트럼 분석에 필요한 전문 지식으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. molecular marker-specific fluorescence imaging과 결합하면 특이성이 증가하여 세포 대사를 규명하는 데 진전이 이루어졌습니다⁶. 그럼에도 불구하고 이 두 가지 방식을 연결하는 데는 여전히 어려움이 있습니다. IMS와 형광 이미징 간의 해상도 차이와 서로 다른 작동 설정으로 인해 결과를 정렬하고 상관 관계를 파악하기가 어렵습니다⁷.

진동 분광 이미징과 안정 동위원소 라벨링의 통합은 단일 세포 대사 연구를 위한 새로운 솔루션을 제공합니다. 더 무거운 동위원소의 결합은 화학 결합의 진동을 늦추어 진동 스펙트럼⁸에서 적색 편이 피크를 유발합니다. 특히 진동 이미징은 형광 이미징에 필적하는 공간 해상도를 제공하며, 대사 정량화와 세포 식별을 단일 설정으로 수행할 수 있어 이미지 정합 및 상관 관계를 단순화할 수 있습니다. 당사의 최근 연구는 고급 진동 이미징 플랫폼인 광학 광열 적외선(OPTIR)과 형광 현장 혼성화(FISH)의 조합을 입증하여 박테리아 군집의 포도당 대사를 조사합니다⁹ (그림 1). OPTIR은 가시광선 변화를 감지하여 중적외선 흡수의 광열 효과를 활용하는 진동 분광 현미경 시스템으로, 광학 현미경에서와 같이 마이크로미터 미만의 해상도를 제공하지만 중적외선 흡수에서 발생하는 추가 진동 분광 정보를 제공합니다. FISH는 단일 세포 수준에서 미생물 신원을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 기술입니다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 서로 다른 분류군의 특정 16S 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있으며, 서로 다른 형광단을 부착할 수 있습니다. 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브와 표적 rRNA의 특이적 교잡은 개별 세포 내에서 표적 종의 강력한 형광 신호를 유도하며, 다중 채널 형광 이미징을 수행하여 집단 내에서 여러 종을 식별할 수 있습니다. OPTIR과 형광 이미징은 모두 광학 검출을 기반으로 하기 때문에 OPTIR과 FISH 형광을 결합하는 것은 간단하게 구현할 수 있습니다. 두 가지 방식은 단일 세포 분석을 위해 동일한 광학 해상도를 공유하며 추가 정렬 또는 공동 정합 없이 편리하게 전환할 수 있습니다.

이 프로토콜은 고급 단일 셀 구조-기능 분석을 위해 OPTIR-FISH 플랫폼을 활용하는 방법에 대한 자세한 가이드를 제공합니다. ¹³C-glucose 함유 배지에서 성장한 박테리아 샘플을 테스트 베드로 사용하고 ¹³C-glucose에서 de novo 단백질 합성을 정량화했습니다. 세포를 식별하는 플랫폼의 능력을 입증하기 위해 rRNA 표적 FISH 프로브를 사용하여 각 종을 라벨링하는 박테리아 혼합물을 사용했습니다. 이 접근법은 대장균(E. coli) 및 박테로이데스 테타이오오미크론(B. theta)과 같은 특정 박테리아 균주와 이들의 대사를 정밀하게 단일 세포에서 식별할 수 있도록 했습니다. 이 프로토콜은 연구자들에게 단일 세포 수준에서 대사 프로파일링 및 종 식별을 동시에 수행할 수 있는 강력한 도구를 제공하며, 세포 상호 작용, 생리학 및 복잡한 환경에서의 역할에 대한 이해를 증진할 것을 약속합니다.

프로토콜

이 연구에서 박테리아 표본의 사용은 Boston University의 IRB(Institutional Review Board)와 National Institute of Health의 지침에 따릅니다.

참고: 이 프로토콜에서 따르는 일반적인 워크플로는 그림 2에 요약되어 있습니다.

1. 박테리아 배양 및 동위원소 라벨링(그림 2A)

참고: 여기에 제공된 예는 순수 박테리아 배양액에 라벨을 부착하기 위한 것입니다. 이 프로토콜을 다미생물 군집에 적용하는 경우, 배지 및 라벨링 시간은 군집 및 관심 유기체의 생리학에 따라 조정되어야 합니다.

1. 트립틱 대두 육수(TSB) 또는 Luria-Bertani 육수(LB)와 같은 영양이 풍부한 배지에 단일 콜로니 및 사전 배양에서 관심 있는 박테리아 균주를 3시간 동안 접종하여 기하급수적 성장(log) 단계에 도달합니다. 대장균 BW25113는 이 프로토콜에서 변형의 예로 사용됩니다.
   참고: 로그 단계에 도달하는 시간은 사용 중인 변형률에 따라 다릅니다. 이 시간은 각 균주에 맞게 조정해야 합니다.
2. 600nm에서 광학 밀도를 측정하여 박테리아 농도를 추정합니다.
3. 동위원소 표지된 기질로 보충된 최소 성장 배지를 준비합니다. E. coli BW25113의 경우 최종 농도 0.2%(w/v)에서 M9 최소 배지에 13C-glucose를 보충합니다.
   참고 : 사용 된 ¹³C- 포도당 (D- 포도당 U−¹³C₆, 99 %)은 모든 탄소 원자가 ¹³C 원자로 대체된 보편적으로 표시되었습니다. 최소 성장 배지의 선택은 박테리아 균주에 따라 달라집니다. 동위원소 기질의 선택은 관심 있는 특정 대사 과정에 따라 달라집니다. 전반적인 목표는 동위원소 기질이 라벨이 부착되지 않은 기질에 비해 주요 영양 공급원 역할을 하는 것입니다.
4. 동위원소 표지된 기질을 포함하는 최소 성장 배지에서 박테리아를 최종 농도 5 × 10⁵ CFU/mL로 희석합니다.
   참고: 일반적으로 1:100과 같은 높은 희석 비율이 사용되며 풍부한 배지의 라벨되지 않은 영양은 무시할 수 있습니다. 대안적으로, 영양이 풍부한 배지의 완전한 제거를 보장하기 위해, 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용한 세척을 14,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 PBS에서 재현탁한 후 최소 성장 배지에서 두 번째 원심분리 및 최종 재현탁을 수행할 수 있습니다.
5. 최적의 성장 조건에서 궤도 진탕 인큐베이터에서 박테리아 샘플을 성장시킵니다. 일반적으로 궤도 진탕 인큐베이터를 220rpm의 속도와 37°C의 온도로 설정하고 호기성 배양을 위해 배양 튜브를 느슨한 캡으로 기울여 놓습니다. 대장균의 경우, 37°C에서 24시간의 호기성 배양은 일반적으로 ^{최대 13}°C의 라벨링에 도달하기에 충분합니다.
   참고: 배양 시간은 관심 있는 대사 과정에 따라 다릅니다. 배양 시간이 길면 일반적으로 동위원소 라벨링이 높아집니다. 라벨링되지 않은 기질로 동일한 조건에서 성장 곡선을 측정하면 적절한 수집 시점을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
6. 4°C에서 10분 동안 14,000 x g 에서 원심분리하여 원하는 시점에 박테리아 세포를 수집합니다.
7. 상층액을 제거하고 PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)의 동일한 부피로 재현탁합니다. PFA 용액에 세포를 실온(RT)에서 10분 동안 또는 4°C에서 2시간 동안 고정합니다. 장기 보관을 위해 PBS로 세포를 두 번 세척하고 PBS 50%(v/v) 및 96% 에탄올 1mL에 세포를 재현탁하고 추가 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.

2. 형광 in situ hybridization (FISH) (그림 2B)

1. 표준 FISH 프로토콜에 따라 시아닌5(Cy5) 형광단(Gam42a-Cy5)으로 표지된 Gam42a¹⁰ 올리고뉴클레오티드 프로브와 대장균 세포를 하이브리드화하고, B. 세타 세포를 시아닌3(Cy3) 형광단(Bac303-Cy3)으로 표지된 Bac303¹¹ 올리고뉴클레오티드 프로브와 교성화합니다.
   참고: 식별을 위한 rRNA-FISH의 기본 사항: rRNA 분자는 미생물 세포 내에서 유비쿼터스 분포하고 자연적으로 증폭되기 때문에 FISH의 이상적인 표적입니다. rRNA는 또한 보존된 염기서열 영역과 다양한 염기서열 영역을 모두 포함하므로 표적 그룹의 계통발생 깊이는 올리고뉴클레오티드 프로브의 보존 정도에 따라 결정될 수 있습니다. 설계된 프로브를 타겟 염기서열에 특이적으로 결합함으로써 태그된 형광단은 개별 세포에 대한 형광 신호를 표시합니다.
2. 형광 in situ hybridization에 대한 자세한 프로토콜은 이전에 발표된 문헌 12,13,14를 참조하십시오. 아래 단계는 미생물 세포에 대한 표준 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
   1. 탈수:
      1. 고정 셀(100μL)을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 100μL의 96% 분석 등급 에탄올에 재현탁하고, RT에서 1분 동안 배양합니다.
      2. 그 후, 세포를 다시 14,000 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 에탄올을 제거하고 세포 펠릿을 공기 중에서 건조시킵니다.
   2. 혼성화: 용액(100μL)의 세포를 46°C에서 3시간 동안 혼성화합니다.
      참고: 혼성화 완충액은 900mM NaCl, 20mM 트리스-(하이드록시메틸)-아미노 메탄 HCl, 1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산, 0.01% 소듐 도데실설페이트, 100ng의 각각의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성되며 엄격한 조건을 얻기 위해 필요한 포름아미드 농도가 필요합니다.
   3. 원심분리기: 혼성화 직후 46°C에서 예열된 로터와 14,000 x g 에서 최대 허용 온도(보통 40°C)에서 15분 동안 원심분리기를 사용하여 샘플을 원심분리기로 옮깁니다.
   4. 세척 및 보관:
      1. 48°C에서 15분 동안 적절한 강도의 완충액에서 샘플을 세척합니다. 그런 다음 46°C에서 예열된 로터가 있는 원심분리기에서 최대 허용 온도에서 14,000 x g 에서 15분 동안 셀을 원심분리합니다.
      2. 마지막으로 500μL의 얼음처럼 차가운 PBS로 셀을 세척하고 20μL의 1x PBS에 재현탁시킨 다음 추가 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
         알림: 프로브의 특정 바인딩은 올바른 hybridization 엄격성에 의해 보장됩니다. 높은 엄격성은 교잡 온도를 높이거나, 염 농도를 낮추거나, 변성제 포름아미드를 첨가함으로써 달성될 수 있습니다. 포름아미드는 핵산 이중체를 안정화하는 수소 결합을 방해합니다. 여기서, 온도 및 염 농도는 포름아미드 농도를 조정하는 동안 혼성화에서 수정되지 않는다. 새로 설계된 프로브에 대한 최적의 포름아미드 농도는 포름아미드 해리 곡선¹⁰을 사용하여 실험적으로 결정됩니다. 발표된 프로브에 필요한 포름아미드 농도는 probeBase¹⁵ 또는 문헌 검색을 통해 확인할 수 있습니다. 또는 mathFISH¹⁶을 사용한 인실리코(in-silico) 분석에서 예측된 포름아미드 농도를 얻을 수 있습니다. 세척 단계에서, 약간 더 높은 온도는 약간 더 엄격한 조건으로 이어지고, 이는 더 높은 결합 특이성으로 이어진다.

3. 시료 전처리(그림 2C)

1. 슬라이드 청소 및 코팅:
   1. 표준화된 CaF₂ 슬라이드(기기 시료 홀더와의 호환성을 위해 직경 10mm, 두께 350μm)를 사용합니다. CaF₂ 를 70 % 에탄올에 15 분 동안 담그고 DI 물로 두 번 헹굽니다.
   2. 세척한 슬라이드를 0.1% 폴리-L-라이신 용액으로 옮기고 4°C에서 밤새 배양합니다. 슬라이드를 DI 물로 한 번 헹구고 공기 중에서 말리십시오.
2. 준비된 세포 샘플을 빛으로부터 보호하면서 RT에서 해동합니다.
3. 샘플 건조 중 PBS의 과도한 염 결정을 방지하려면 3.3.1-3.3.2단계를 따르십시오.
   1. 탈이온수(DI)로 세포를 두 번 세척합니다. 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
   2. DI 물과 소용돌이의 원래 부피를 부드럽게 다시 추가하십시오. 원심분리를 반복하고 DI 물 세척을 다시 추가합니다.
4. (선택 사항) 혼합물 샘플의 경우 각 샘플에서 동일한 부피를 옮기고 하나의 원심분리기 튜브에 혼합합니다.
5. 박테리아 세포 샘플을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 농축하고 상층액을 제거합니다.
6. 남은 용액을 ~ 30 초 동안 부드럽게 소용돌이 치고 준비된 CaF₂ 슬라이드에 1-2 μL의 용액을 추가합니다. 빛으로부터 보호하면서 샘플을 30분 동안 자연 건조합니다.
   알림: 공기 건조 후 슬라이드에 작은 둥근 점이 나타나야 합니다. "커피 링" 효과로 인해 점의 가장자리는 박테리아 세포의 밀도가 더 높아집니다. 이 원심분리기 단계는 효율적인 단일 세포 박테리아 이미징을 위한 적절한 밀도에 도달하는 것입니다. 이상적인 농도는 현미경 아래에서 개별 박테리아 세포의 균일하고 조밀한 층으로 이어져야 합니다. 원심분리기 후 육안으로 볼 수 있는 투명한 펠릿이 있으면 와류 후 용액이 거의 투명하게 보이도록 상층액을 제거하십시오. 대조군에 대한 빠른 테스트를 수행하여 상층액 제거 부피를 추정할 수 있습니다. 서로 다른 양의 상층액이 남아 있는 일련의 액적을 현미경 유리 슬라이드에 증착하여 명시야 현미경에서 최적의 희석 부피를 검사할 수 있습니다. 원심분리 후 눈에 보이는 펠릿이 없으면 대부분의 상층액을 제거하여 샘플을 최대한 농축합니다. 비결은 펠릿이 튜브 힌지의 같은 쪽에 나타나도록 고정각 로터에서 바깥쪽에 힌지가 있는 원심분리기 튜브를 배치하는 것입니다. 또한 펠릿을 온전하게 유지하기 위해 상층액 제거 시 정밀도를 높이기 위해 피펫 크기(P1000, P200, P10)를 등급을 낮춥니다.
7. 제공된 샘플 홀더에 슬라이드를 장착하고 측정 중에 슬라이드를 고정하기 위해 작은 폴리에스테르 테이프 점을 사용합니다.

4. OPTIR-FISH 이미징

참고: 형광 이미징 및 OPTIR 이미징은 OPTIR 시스템에서 수행됩니다.

1. 시스템 형상:
   1. 이 프로토콜로 mid-IR 펌프와 가시광선 프로브의 역전파, 가시광선의 역방향(epi) 감지를 사용하십시오.
   2. 가시광선의 초점을 맞추고 역반사 및 산란된 가시광선을 수집하려면 공기 대물렌즈(50x 0.8NA)를 사용하십시오. 중적외선의 초점을 맞추려면 Cassegrain 대물렌즈(40x 0.78NA)를 사용하십시오.
   3. 또한 시스템에 여러 형광 필터 세트가 있는 광시야 epi-fluorescence module이 장착되어 있는지 확인합니다. 이 프로토콜에 사용된 형광단의 경우 Cy3 검출을 위한 녹색 형광 단백질(GFP) 필터 세트와 Cy5 검출을 위한 Alexa Fluor 647 필터 세트를 선택합니다.
2. 측정 준비:
   1. 시스템 전원을 켜고 기기 제어 소프트웨어를 엽니다. 초기화 후 Counterprop and Fluorescence(카운터프롭 및 형광) 슬라이더를 켜짐 위치로 전환합니다.
   2. 대물렌즈를 50x로 설정한 다음 자동 배경을 수행하여 IR 파워 스펙트럼을 획득합니다. 파워 스펙트럼을 사용하여 획득한 샘플 스펙트럼을 정규화하거나 다른 파수에서 OPTIR 이미지를 정규화할 수 있습니다. 이는 mid-IR 레이저 출력 차이가 데이터 분석 및 정량화에 미치는 영향을 제외합니다.
      참고: 측정된 강도가 IR 전력과 선형적으로 관련되어 있기 때문에 정규화를 위한 IR 전력 스펙트럼을 획득하는 것은 다운스트림 정량 분석에 필수적입니다. 자동 배경을 수행한 후 소프트웨어는 사용자를 위해 OPTIR 스펙트럼 및 OPTIR 이미지를 IR 전력 스펙트럼으로 자동으로 정규화합니다. N₂ 로 시스템을 퍼지하면 수증기의 영향을 최소화하고 실험 간 재현성을 높일 수 있습니다.
3. 샘플을 로드하려면 Unload 버튼을 사용하여 샘플 스테이지를 밖으로 이동합니다. 10x와 같은 저배율 대물렌즈를 사용하여 시료 영역을 찾고 최적의 시료 밀도를 가진 영역으로 이동합니다. 제어 소프트웨어에서 대물렌즈 높이를 조정하여 샘플의 초점을 맞춥니다. 목표 선택을 50x로 변경합니다.
4. 이미지 취득
   참고: 사용된 샘플은 다음과 같습니다: i) 대장균 (¹³C-포도당 배양); ii) 대장균 (¹²C-글루코스 배양); iii) B. 세타 (¹²C-포도당 배양); iv) E. coli (¹³C-glucose incubated) 및 B. theta (¹²C-glucose incubated)의 혼합물.
   1. 명시야 이미지(그림 2D): 명시야 이미지를 보고 샘플에 초점을 맞춥니다.
   2. 형광 이미지(그림 2E): 필터 이름 버튼(Cy3의 경우 GFP , Cy5의 경우 Alexa Fluor 647 )을 클릭하여 필터 세트를 변경하여 설계된 FISH 프로브와 관련된 형광단을 감지하고 소프트웨어의 형광 모듈을 사용하여 형광 이미징을 순차적으로 획득합니다. 형광단을 표백하기 전에 적절한 신호 대비를 얻기 위해 빛의 강도와 노출 시간을 조정하십시오.
      참고: OPTIR 측정에 사용되는 프로브는 형광단을 광표백할 수 있으므로 항상 OPTIR 이미지보다 형광 이미지를 먼저 획득하십시오. 형광 마커가 OPTIR 검출에 미치는 영향에 대한 우려는 Cy5가 표적 박테리아 단백질⁹에 비해 크기가 작고 풍부하지 않기 때문에 Cy5 형광단을 사용한 FISH가 OPTIR 이미지를 기반으로 한 다음 정량화에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한 이전에 발표된 연구를 참조하십시오.
   3. OPTIR 이미지(그림 2F):
      1. 정상 피크와 동위원소 유도 적색 편이 피크 위치를 결정합니다. ¹³C-glucose에서 단백질 합성의 경우, 정상 아미드 I 피크는 약 1656 cm-1에서 검출되고 적색 편이 피크는 약 1612 ^cm-1 에서 검출됩니다(그림 3A).
         참고: 정상 피크 위치는 생화학적 구성 요소 및/또는 관심 대사 산물에 따라 다릅니다. 이동된 피크 위치는 또한 라벨링에 사용되는 동위원소에 따라 달라집니다. 이 두 파수는 라벨링되지 않은 세포와 최대로 라벨링된 세포의 전체 스펙트럼을 측정하여 실험적으로 결정할 수도 있습니다(단계 4.5 참조)
      2. 소프트웨어를 사용하여 IR 펌프 파장을 1656cm-1로 조정합니다. DC 신호(8V)의 포화를 피하기 위해 프로브 전력과 검출기 게인을 적절하게 수정합니다. AC 신호를 최대화하기 위해 하단 Cassegrain 대물렌즈 높이를 미세 조정합니다.
         참고: 샘플의 일반적인 IR 전력은 약 5mW이고 샘플의 프로브 전원은 샘플에 따라 약 3-15mW입니다. 제어 소프트웨어를 사용하여 IR 및 프로브 전력을 모두 조정하여 전력 수준을 최적화하여 셀의 손상을 방지하면서 높은 이미지 대비를 보장할 수 있습니다.
      3. OPTIR 이미지를 200 x 200 픽셀을 포함하도록 설정하고 스캔 속도를 100μm/s로 설정합니다. X 및 Y 방향의 단계 크기를 150nm로 설정하여 이미지 크기가 약 30 x 30μm²가 되도록 합니다.
      4. 이미지를 획득합니다.
      5. IR 펌프 파장을 1612cm-1로 조정하고 이 파수에서 동일한 시야에서 이미지를 획득합니다.
      6. 각 샘플에 대해 통계 분석을 위해 최소 3개의 시야를 이미지화합니다.
5. (선택 사항) 스펙트럼 측정: 이미지 획득 후 관심 있는 공간 특징이 있는 경우 스펙트럼 측정을 수행합니다.
   1. 위치 선택: 단일 점을 선택하거나 소프트웨어의 스펙트럼 모듈에서 분석할 점 배열을 지정합니다.
   2. 스펙트럼 스캐닝 매개변수를 설정합니다. 요구 사항에 따라 파수 적용 범위, 스캔 속도 및 데이터 출력 간격을 선택합니다.
      참고: 스캔 속도 및 데이터 출력 간격이 백그라운드 획득 단계(단계 4.2)에서 사용된 것과 다른 경우 올바른 정규화를 위해 현재 스펙트럼 스캐닝 매개변수를 기반으로 하는 새 백그라운드가 필요합니다.
   3. 코애버리징 수를 설정하고 스펙트럼 측정을 시작합니다. 또한 코에이징(co-averaging)을 늘리면 스펙트럼의 신호 대 잡음비도 증가하지만 수집 시간이 더 길어집니다.
      참고: co-averaging 중에 상당한 변동이 관찰되면 레이저 가열로 인한 샘플 불안정성을 나타낼 수 있습니다. 이것은 종종 IR 전력을 낮추거나 가시 프로브 전력을 낮추어 해결할 수 있습니다.

5. 단일 세포 수준에서의 데이터 처리 및 분석

1. 동위원소 기질에서 대사 합성을 정량화합니다(그림 2G).
   참고: 동위원소 기질의 대사 통합에 대한 다음 정량화는 표적 거대분자의 정상 및 이동된 피크에 해당하는 2파수 OPTIR 이미지를 기반으로 합니다. 전체 초분광 스택과 비교했을 때, 2파수 이미징은 각 FOV에 필요한 시간을 크게 줄이고 처리량을 개선하는 동시에 대사 정량화에 중요한 동위원소 효과를 완전히 다시 캡처할 수 있습니다.
   1. 정상 피크 OPTIR 이미지에서 이동된 피크 OPTIR 이미지를 빼면 동위원소 기판에서 합성 활성의 시각적 맵이 생성됩니다. 예를 들어(그림 3C), ¹³C-glucose로 배양한 E. coli의 경우 (1656 ^{cm-1-1612 cm-1}) 이미지의 양성 픽셀은 ¹³C가 단백질에 활발하게 결합되어 더 높은 단백질 합성 수준을 나타냅니다.
      참고: 뺄셈은 ImageJ 이미지 계산기 기능을 사용하여 수행할 수 있습니다. 대안적으로, 뺄셈은 배치 처리를 위해 선호하는 프로그래밍 언어로 쉽게 수행될 수 있습니다.
   2. single-cell metabolic activity의 정량화
      1. 계수(그림 2G에서 h로 표시)를 라벨링되지 않은 참조 샘플과 완전히 라벨링된 참조 샘플에서 얻습니다. 동위원소에 의해 유도된 적색편이 피크가 정상 피크와 부분적으로 겹치기 때문에 표지되지 않은 샘플과 표지된(동위원소 표지된 기질에서 새로 합성된) 샘플 모두 정상 및 이동된 피크에서 OPTIR 신호에 기여합니다. 라벨링되지 않은 참조 샘플과 완전히 레이블이 지정된 참조 샘플의 정상 및 이동된 피크에서 정규화된 OPTIR 신호 강도를 사용하여 이러한 다양한 기여도를 정량화할 수 있습니다.
         참고: 참조 샘플의 경우, 라벨링되지 않은 참조 샘플은 동위원소 라벨링된 기질 없이 성장(또는 배양)됩니다. 완전히 라벨링된 참조 샘플은 일반적으로 배양 시간이 가장 긴 동위원소 라벨링된 기질의 최고 농도로 성장합니다.
      2. single-cell 분석의 경우, bright-field 이미지를 기반으로 single-cell mask를 얻습니다.
         참고: 블롭 분석과 같은 다양한 입자 검출 및 유역과 같은 세포 분할 방법을 포함하여 이 마스크를 생성하기 위해 이미지 처리의 다양한 기술을 여기에 적용할 수 있습니다.
      3. 개별 셀에서 OPTIR 신호 강도를 측정합니다. 획득한 단일 셀 마스크를 두 개의 OPTIR 이미지(정상 피크 및 이동된 피크)에 적용하고, 각 단일 셀에 대해 단일 셀 마스크 영역의 픽셀 값을 평균화합니다. 개별 셀의 평균값은 정량화에 사용됩니다.
      4. 각 셀에 대해 5.1.2.1 단계의 계수와 5.1.2.3 단계의 신호를 기반으로 라벨링되지 않은 바이오 구성 요소와 라벨링된 바이오 구성 요소의 상대적 기여도를 계산합니다.
         참고: 동위원소 치환 비율은 라벨링된 바이오 성분과 라벨링되지 않은 바이오 성분의 합에 대한 라벨링된 바이오 성분의 상대적 기여도로 정의됩니다(그림 2G). 이 비율은 0에서 1 사이여야 합니다. 동위원소 치환 비율은 ¹³C-glucose 대 ¹²C-glucose 비율(고정된 총 포도당 양)⁹에 선형적으로 비례합니다. 대장균 세포에 대해 5% ¹³C-glucose의 높은 검출 감도가 입증되었습니다.
2. 다중 채널 형광 이미지에서 박테리아 종 식별(그림 2H)
   1. ImageJ(Image > Color > Merge Channels)를 사용하여 다양한 박테리아 종에 대한 시각적 지침을 생성하기 위해 다중 색상 형광 채널을 병합합니다.
   2. 단일 세포 분석의 경우 각 형광 채널에 대해 개별 세포에 대한 관심 영역(ROI) 세트를 생성합니다.
      참고: 다양한 자동 임계값 설정 방법 및 셀 분할 방법을 포함하여 이미지 처리의 다양한 기술을 여기에 적용하여 마스크를 생성할 수 있습니다.
3. FISH 정체성과 OPTIR 대사 활동의 상관 관계(그림 2I)
   1. ROI의 위치를 상호 연관시켜 FISH 형광 이미지의 단일 세포 수준 박테리아 ID를 OPTIR 이미지의 대사 활동에 직접 연결합니다.
   2. 다른 종의 대사 활동을 비교하기 위해 통계 분석을 수행합니다.
      참고: 마스크는 OPTIR 이미지의 모든 세포에 대해 대사 활동을 분석할 수 있는 반면 알 수 없는 세포는 형광 채널에 표시되지 않기 때문에 형광 이미지 및 OPTIR 이미지와 별도로 생성됩니다. 이렇게 하면 모든 세포가 대사 분석에 포함될 수 있습니다. 미확인 세포가 많은 경우 관심 분류군이 다른 rRNA를 표적으로 하는 다양한 FISH 프로브를 고려해야 할 수 있습니다.

결과

OPTIR-FISH에 의한 유전자 식별을 통한 단세포 미생물 대사 분석을 위한 일반적인 워크플로우는 다음과 같이 요약됩니다. 그림 2. OPTIR의 단세포 대사 이미징 능력을 보여주는 대표적인 결과는 다음과 같습니다. 그림 3. 이 예에서는 다음과 같이 배양된 대장균 세포를 사용했습니다. ¹²C- 또는 ¹³24시간 동안 C-포도당....

토론

여기에서는 단일 세포 분해능에서 미생물 종의 동시 식별과 대사 활동의 정량화를 위해 OPTIR-FISH 플랫폼을 적용하기 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 중요한 단계에는 특정 대사 활동을 연구하기 위한 안정 동위원소 표지를 사용한 배양과 표적 미생물 종을 식별하기 위한 형광 in situ hybridization이 포함됩니다. 선택한 파수에서 다중 채널 형광 이미징 및 O...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G