光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

要約

ここでは、光学的光熱赤外蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)、別名中赤外光熱魚(MIP-FISH)を使用して、個々の細胞を特定し、その代謝を理解するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、単一細胞分解能による細胞代謝のマッピングなど、さまざまなアプリケーションに幅広く適用できます。

要約

複雑なコミュニティ内の個々の細胞の代謝活性を理解することは、ヒトの疾患におけるそれらの役割を解明するために重要です。ここでは、rRNAタグ付きFISHプローブと同位体標識基質を組み合わせることにより、OPTIR-FISHプラットフォームを使用した細胞同定と代謝解析を同時に行うための包括的なプロトコールを紹介します。蛍光イメージングは、rRNAタグ付きFISHプローブの特異的結合による細胞同定を提供し、OPTIRイメージングは、OPTIRスペクトル上の同位体誘導赤方偏移による単一細胞内の代謝活性を提供します。 ¹³C-グルコースで培養した細菌をテストベッドとして使用して、プロトコールでは、同位体標識、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)、サンプル調製、OPTIR-FISHイメージングセットアップの最適化、およびデータ取得による微生物培養の概要を説明します。また、画像解析を実行し、シングルセルレベルでスペクトルデータを高スループットで解釈する方法も示します。このプロトコルの標準化された詳細な性質は、広範な単一細胞代謝研究コミュニティ内の多様な背景や分野の研究者による採用を大幅に促進します。

概要

細胞代謝は、細胞生物学の基本的な柱であり、細胞の健康、機能、および環境との相互作用を決定する多くのプロセスを導いています。個々の細胞レベル、特に天然環境における代謝の解析は、生体システムにおける不均一で複雑な活動を明らかにするための貴重な洞察を提供します¹。これは、多くの微生物が従来の栽培方法に挑戦する独自の成長要件または環境依存性を示すため、微生物の研究において特に重要です²。例えば、ある種は、実験室の設定では容易に再現できない特定の栄養組成や共生関係を必要とする場合があり、したがって、^{標準的な技術では}培養不可能になる3。さらに、特定の種の培養に必要な長期化は、微生物学研究にとって大きな課題となり、多くの場合、研究と分析の実際の時間枠を超えて延長されます。これらの制限を回避するために、ポリメラーゼ連鎖反応や蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)などの代替法により、培養を必要とせずに微生物種を同定^{することができ4、}これにより、微生物生態系のより正確で全体的なビューを達成することができます。しかし、これらの解析技術では細胞代謝を解明する能力が不足しています。このギャップは、微生物学分野で進行中の課題、つまり細胞の同一性を分化し、単一細胞レベル....

プロトコル

この研究での細菌標本の使用は、ボストン大学の治験審査委員会(IRB)および国立衛生研究所のガイドラインに従っています。

注:このプロトコルで従う一般的なワークフローを 図2にまとめます。

1. 細菌培養と同位体標識(図2A)

注:ここに示す例は、純粋な細菌培養物を標識するためのものです。このプロトコルを多微生物群集に適用する場合、培地と標識時間は、関心のある生物の群集と生理機能に応じて調整する必要があります。

1. 単一のコロニーから目的の細菌株を接種し、トリプシン大豆ブロス(TSB)やルリアベルタニブロス(LB)などの栄養豊富な培地で3時間前培養して、指数関数的増殖(log)段階に到達します。 大腸菌 BW25113は、このプロトコルの例として菌株として使用されます。
   注意: ログフェーズに到達するまでの時間は、使用するひずみによって異なります。この時間は、各系統に適合させる必要があります。
2. 600nmの光学密度を測定して、細菌濃度を推定します。
....

ディスカッション

ここでは、OPTIR-FISHプラットフォームを適用して、微生物種の同定と代謝活性の定量をシングルセル分解能で同時に行うための詳細なプロトコールについて説明しました。重要なステップには、特定の代謝活性を研究するための安定同位体標識による培養と、標的微生物種を特定するための蛍光 in situ ハイブリダイゼーションが含まれます。選択した波数での?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G