تجميع معياري قائم على كريسبر لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF

Summary

نقدم بروتوكولا للتجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) ، وهي طريقة لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF في ذبابة الفاكهة باستخدام موارد cDNA / ORF المتاحة للجمهور. يمكن تطبيق CRISPRmass لتحرير مكتبات البلازميد المختلفة.

Abstract

يوفر فحص الجينوم الوظيفي نهجا قويا لفحص وظيفة الجينات ويعتمد على بناء مكتبات البلازميد على مستوى الجينوم. الأساليب التقليدية لبناء مكتبة البلازميد تستغرق وقتا طويلا وشاقة. لذلك ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة ، التجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) ، لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد على مستوى الجينوم على مستوى المنبع لتنشيط تسلسل الحمض النووي / إطار القراءة المفتوحة (UAS-cDNA / ORF). هنا ، نقدم بروتوكولا ل CRISPRmass ، مع الأخذ على سبيل المثال إنشاء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF قائمة على GAL4 / UAS. يتضمن البروتوكول تفاعلات أنبوب اختبار متوازية على نطاق واسع من خطوتين يتبعها تحول بكتيري. تتمثل الخطوة الأولى في خطي الحمض النووي التكميلي الحالي (cDNA) أو إطار القراءة المفتوح (ORF) cDNA أو بلازميدات مكتبة ORF عن طريق قطع تسلسلات متجهات المنبع المشتركة المجاورة لنهاية 5 'من cDNAs أو ORFs باستخدام CRISPR / Cas9 جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) ، والخطوة الثانية هي إدخال وحدة UAS في بلازميدات cDNA أو ORF الخطية باستخدام تفاعل خطوة واحدة. يسمح CRISPRmass ببناء بسيط وسريع وفعال وفعال من حيث التكلفة لمكتبات البلازميد المختلفة. يمكن استخدام مكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF لفحص اكتساب الوظيفة في الخلايا المستزرعة ولبناء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة.

Introduction

يعد الفحص الجيني الكامل غير المتحيز نهجا قويا لتحديد الجينات المشاركة في عملية بيولوجية معينة وتوضيح آليتها. لذلك ، يستخدم على نطاق واسع في مختلف مجالات البحوث البيولوجية. يتم حفظ ما يقرب من 60 ٪ من جينات ذبابة الفاكهة في البشر^1،2 ، و ~ 75 ٪ من جينات الأمراض البشرية لها متجانسات في ذبابة الفاكهة³. ينقسم الفحص الجيني بشكل أساسي إلى نوعين: فقدان الوظيفة (LOF) واكتساب الوظيفة (GOF). لعبت الفحوصات الجينية LOF في ذبابة الفاكهة دورا حاسما في توضيح الآليات التي تحكم كل جانب من جوانب علم الأحياء تقريبا. ومع ذلك ، فإن غالبية جينات ذبابة الفاكهة لا تحتوي على أن....

Protocol

1. تحديد موقع الانقسام الأمثل Cas9 / sgRNA في المنبع من cDNA / ORF

1. تحضير بلازميدات cDNA أو ORF مع العمود الفقري المتجه المتطابقة
   1. قم بشراء استنساخ cDNA / ORF المتوفرة في الموارد العامة ، مثل مركز موارد جينوم ذبابة الفاكهة (DGRC ، https://dgrc.bio.indiana.edu/) المجموعة الذهبية^10,11 ، ومجموعة جينات الثدييات الفأرية (MGC ، https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) ، ومكتبة التعبير البشري على نطاق CCSB¹². في هذا البروتوكول ، نأخذ كمثال استنساخ cDNA / ORF القائم على المتجهات pOT2 ، والذي يتوفر في مجموعة DGRC الذهبية.
   2. استخراج الحمض النووي ....

النتائج

قمنا بتطبيق CRISPRmass لإنشاء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF على مستوى الجينوم باستخدام 3402 نسخة cDNA / ORF تحمل العمود الفقري المتجه pOT2 من مجموعة DGRC الذهبية. قمنا بتحليل مستعمرة واحدة فقط بشكل عشوائي لكل بنية UAS-cDNA / ORF ، وأشار تحليل التقييد اللاحق باستخدام PstI إلى أن 98.6٪ من تركيبات UAS-cDNA / ORF تم إنشاؤها بنجاح

Discussion

أهم خطوات كريسبر ماس هي تصميم sgRNAs وتقييم sgRNAs. يعد اختيار sgRNAs عالية الكفاءة ل Cas9 أمرا أساسيا لنجاح CRISPRmass. إذا لوحظت مستعمرات قليلة جدا أو معدومة على غالبية ألواح LB المحتوية على المضادات الحيوية بعد تحول الإشريكية القولونية مع منتجات تجميع التفاعل أحادية الخطوة ، تحقق من هضم البلازميد عن طر?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA