Assemblaggio modulare basato su CRISPR per la costruzione ad alto rendimento di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per l'assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass), un metodo per la costruzione ad alto rendimento di librerie plasmidiche UAS-cDNA/ORF in Drosophila utilizzando risorse cDNA/ORF disponibili pubblicamente. CRISPRmass può essere applicato alla modifica di varie librerie di plasmidi.

Abstract

Lo screening genomico funzionale offre un approccio potente per sondare la funzione genica e si basa sulla costruzione di librerie di plasmidi a livello di genoma. Gli approcci convenzionali per la costruzione di librerie di plasmidi richiedono molto tempo e laboriosità. Pertanto, abbiamo recentemente sviluppato un metodo semplice ed efficiente, l'assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass), per la costruzione ad alto rendimento di una libreria di plasmidi di DNA attivante sequenziale complementare a livello di genoma/open reading frame (UAS-cDNA/ORF). Qui, presentiamo un protocollo per CRISPRmass, prendendo come esempio la costruzione di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF basata su GAL4/UAS. Il protocollo include reazioni in provetta in due fasi massicciamente parallele seguite da trasformazione batterica. Il primo passo consiste nel linearizzare il DNA complementare (cDNA) esistente o i plasmidi della libreria ORF o del cDNA a telaio di lettura aperto (ORF) tagliando le sequenze vettoriali condivise a monte adiacenti all'estremità 5' dei cDNA o degli ORF utilizzando CRISPR/Cas9 insieme all'RNA guida singola (sgRNA), mentre il secondo passo consiste nell'inserire un modulo UAS nei plasmidi linearizzati del cDNA o dell'ORF utilizzando una reazione a passo singolo. CRISPRmass consente la costruzione semplice, veloce, efficiente ed economica di varie librerie di plasmidi. La libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF può essere utilizzata per lo screening del guadagno di funzione in cellule in coltura e per la costruzione di una libreria UAS-cDNA/ORF transgenica a livello di genoma in Drosophila.

Introduzione

Lo screening genetico imparziale dell'intero genoma è un approccio potente per identificare i geni coinvolti in un determinato processo biologico e chiarirne il meccanismo. Pertanto, è ampiamente utilizzato in vari campi della ricerca biologica. Circa il 60% dei geni di Drosophila sono conservati nell'uomo ^1,2 e ~75% dei geni delle malattie umane hanno omologhi in Drosophila³. Lo screening genetico si divide principalmente in due tipi: perdita di funzione (LOF) e guadagno di funzione (GOF). Gli screening genetici LOF in Drosophila hanno svolto un ruolo fondame....

Protocollo

1. Determinazione del sito di scissione ottimale di Cas9/sgRNA a monte del cDNA/ORF

1. Preparazione di plasmidi di cDNA o ORF con backbone vettoriale identico
   1. Acquista cloni di cDNA/ORF disponibili in risorse pubbliche, come il Drosophila genome resource center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, la collezione di geni dei mammiferi topi (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) e la libreria di espressione lentivirale umana^{CCSB 12}. In questo protocollo, prendiamo come esempio i cloni cDNA/ORF basati su vettori pOT2, d....

Discussione

Le fasi più critiche di CRISPRmass sono la progettazione degli sgRNA e la valutazione degli sgRNA. La selezione di sgRNA altamente efficienti per Cas9 è la chiave del successo di CRISPRmass. Se si osservano pochissime o nessuna colonia sulla maggior parte delle piastre LB contenenti antibiotici dopo la trasformazione di E. coli con prodotti di assemblaggio della reazione in un'unica fase, controllare la digestione plasmidica mediante elettroforesi su gel di agarosio. Se i plasmidi non sono ben digeriti, controllare l'a.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA