Assemblaggio modulare basato su CRISPR per la costruzione ad alto rendimento di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per l'assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass), un metodo per la costruzione ad alto rendimento di librerie plasmidiche UAS-cDNA/ORF in Drosophila utilizzando risorse cDNA/ORF disponibili pubblicamente. CRISPRmass può essere applicato alla modifica di varie librerie di plasmidi.

Abstract

Lo screening genomico funzionale offre un approccio potente per sondare la funzione genica e si basa sulla costruzione di librerie di plasmidi a livello di genoma. Gli approcci convenzionali per la costruzione di librerie di plasmidi richiedono molto tempo e laboriosità. Pertanto, abbiamo recentemente sviluppato un metodo semplice ed efficiente, l'assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass), per la costruzione ad alto rendimento di una libreria di plasmidi di DNA attivante sequenziale complementare a livello di genoma/open reading frame (UAS-cDNA/ORF). Qui, presentiamo un protocollo per CRISPRmass, prendendo come esempio la costruzione di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF basata su GAL4/UAS. Il protocollo include reazioni in provetta in due fasi massicciamente parallele seguite da trasformazione batterica. Il primo passo consiste nel linearizzare il DNA complementare (cDNA) esistente o i plasmidi della libreria ORF o del cDNA a telaio di lettura aperto (ORF) tagliando le sequenze vettoriali condivise a monte adiacenti all'estremità 5' dei cDNA o degli ORF utilizzando CRISPR/Cas9 insieme all'RNA guida singola (sgRNA), mentre il secondo passo consiste nell'inserire un modulo UAS nei plasmidi linearizzati del cDNA o dell'ORF utilizzando una reazione a passo singolo. CRISPRmass consente la costruzione semplice, veloce, efficiente ed economica di varie librerie di plasmidi. La libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF può essere utilizzata per lo screening del guadagno di funzione in cellule in coltura e per la costruzione di una libreria UAS-cDNA/ORF transgenica a livello di genoma in Drosophila.

Introduzione

Lo screening genetico imparziale dell'intero genoma è un approccio potente per identificare i geni coinvolti in un determinato processo biologico e chiarirne il meccanismo. Pertanto, è ampiamente utilizzato in vari campi della ricerca biologica. Circa il 60% dei geni di Drosophila sono conservati nell'uomo ^1,2 e ~75% dei geni delle malattie umane hanno omologhi in Drosophila³. Lo screening genetico si divide principalmente in due tipi: perdita di funzione (LOF) e guadagno di funzione (GOF). Gli screening genetici LOF in Drosophila hanno svolto un ruolo fondamentale nel chiarire i meccanismi che governano quasi ogni aspetto della biologia. Tuttavia, la maggior parte dei geni di Drosophila non ha evidenti fenotipi LOF⁴ e, pertanto, lo screening GOF è un metodo importante per studiare la funzione di quei geni ^4,5.

Il sistema binario GAL4/UAS è comunemente usato per l'espressione genica tessuto-specifica in Drosophila⁶. In questo sistema, il tessuto esprime specificamente l'attivatore della trascrizione del lievito GAL4 che si lega all'elemento responsivo GAL4 (UAS) e quindi attiva la trascrizione dei componenti genetici a valle (ad esempio, cDNA e ORF)⁶. Per eseguire screening GOF a livello di genoma in Drosophila, abbiamo bisogno di costruire una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF a livello di genoma e, successivamente, una libreria transgenica UAS-cDNA/ORF in Drosophila.

La costruzione di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF a livello di genoma con metodi convenzionali a partire da cloni di cDNA/ORF disponibili al pubblico richiede tempo e laboriosità, poiché ogni gene richiede progetti individualizzati, tra cui la progettazione e la sintesi di primer, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e la purificazione del gel, il sequenziamento, la digestione di restrizione e così via ^7,8. Pertanto, la costruzione di una tale libreria plasmidica è un passo limitante nella creazione di una libreria UAS-cDNA/ORF transgenica a livello di genoma in Drosophila. Recentemente, abbiamo risolto con successo questo problema sviluppando un nuovo metodo, l'assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass)⁹. Il cuore di CRISPRmass è quello di manipolare le sequenze vettoriali condivise di una libreria di plasmidi attraverso una combinazione di tecnologia di editing genetico e tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità.

Qui, presentiamo un protocollo per CRISPRmass, che include reazioni in provetta in due fasi massicciamente parallele seguite da trasformazione batterica. CRISPRmass è un metodo semplice, veloce, efficiente ed economico che, in linea di principio, può essere utilizzato per la costruzione ad alto rendimento di varie librerie di plasmidi.

Strategia CRISPRmass
La procedura di CRISPRmass inizia con reazioni parallele in provetta in due fasi prima della trasformazione di Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). La fase 1 è la scissione delle ossa vettoriali identiche dei plasmidi cDNA/ORF da parte di Cas9/sgRNA. Un sito di scissione ideale è adiacente all'estremità 5' del cDNA/ORF. I prodotti per la scollatura non devono essere purificati. La fase 2 consiste nell'inserimento di un modulo UAS vettorialmente specifico nei plasmidi cDNA/ORF linearizzati Cas9/sgRNA mediante assemblaggio di Gibson (di seguito denominata reazione a passo singolo), con conseguente produzione di plasmidi UAS-cDNA/ORF. Le sequenze terminali 5' e 3' di un modulo UAS si sovrappongono a quelle dei plasmidi cDNA/ORF linearizzati, consentendo la reazione a passo singolo.

I prodotti di reazione a passo singolo sono direttamente sottoposti alla trasformazione di E. coli . In teoria, solo le colonie di UAS-cDNA/ORF desiderate possono crescere su piastre Luria-Bertani (LB) che contengono antibiotici di selezione corrispondenti al gene di resistenza agli antibiotici del modulo UAS. Il modulo UAS è composto da un modulo UAS principale, un gene di resistenza agli antibiotici distinto da quello del cDNA o dei plasmidi ORF e dalle sequenze terminali 5' e 3'. Un modulo UAS principale comprende 10 copie di UAS, un promotore minimo Hsp70, una sequenza attB per l'integrazione genomica mediata da phiC31 e un marcatore di trasformazione mini-bianco per Drosophila⁷.

Protocollo

1. Determinazione del sito di scissione ottimale di Cas9/sgRNA a monte del cDNA/ORF

1. Preparazione di plasmidi di cDNA o ORF con backbone vettoriale identico
   1. Acquista cloni di cDNA/ORF disponibili in risorse pubbliche, come il Drosophila genome resource center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, la collezione di geni dei mammiferi topi (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) e la libreria di espressione lentivirale umana^{CCSB 12}. In questo protocollo, prendiamo come esempio i cloni cDNA/ORF basati su vettori pOT2, disponibili nella DGRC Gold Collection.
   2. Estrarre il DNA plasmidico utilizzando un mini-kit di preparazione plasmidica. Misurare la concentrazione di plasmidi con uno spettrofotometro.
2. Progettazione di sgRNA
   1. Visita il sito web di CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Fare clic sul pulsante Incolla target e quindi inserire la sequenza di DNA di interesse. La sequenza di interesse è una regione di 20-100 bp situata nella dorsale del vettore pOT2 a monte dell'estremità 5' del cDNA/ORF.
   2. Scegli la specie Drosophila melanogaster. Fare clic sul pulsante Trova siti di destinazione. Scegli candidati sgRNA con un'efficienza prevista superiore all'80%.
3. Preparazione di sgRNA
   1. Ordina PAGE-purified oligos, un primer diretto (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′) dove (N)₂₀ è la sequenza bersaglio di un sgRNA e di un primer inverso dell'impalcatura sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      NOTA: Si consiglia di utilizzare oligonucleotidi di alta qualità purificati con PAGE.
   2. Preparare un modello di DNA mediante PCR per la trascrizione in vitro (IVT) di sgRNA. Impostare una reazione PCR da 100 μL come segue: 5 μL di modello pX330 (plasmide Addgene 42230, un dono di Feng Zhang; 0,1 ng/μL), 5 μL di primer diretto (10 μM), 5 μL di sgRNA-REV (10 μM), 50 μL di 2x miscela master PCR ad alta fedeltà e 35 μL di acqua trattata con pirocarbonato di dietil (DEPC) in una provetta PCR.
   3. Eseguire la PCR utilizzando le seguenti condizioni di termociclo: 1 ciclo di 98 °C per 30 s; 5 cicli di 98 °C per 10 s, 51 °C per 10 s, 72 °C per 5 s; 30 cicli a 98 °C per 10 s, 72 °C per 15 s; 1 ciclo a 72 °C per 2 min. Incubare le reazioni in un termociclatore.
   4. Separare i prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. Un frammento di DNA di ~120 bp dovrebbe essere visibile sul gel sotto UV. Purificare il frammento di DNA da ~120 bp utilizzando un kit di estrazione con gel. Il frammento di DNA purificato funge da modello per l'IVT di sgRNA.
   5. Impostare una reazione IVT da 5 μl come segue: 165 ng di frammento di DNA su gel purificato da ~120 bp, 1,65 μl di miscela tampone NTP, 0,33 μl di miscela di RNA polimerasi T7 e acqua trattata con DEPC. Incubare le reazioni a 37 °C per 4 ore. Seguire le istruzioni del manuale di un kit di trascrizione in vitro .
   6. Aggiungere 45 μl di acqua trattata con DEPC al prodotto di reazione IVT. Trattare i prodotti della reazione IVT come RNA e utilizzare acqua trattata con DEPC come controllo in bianco. Misurare la concentrazione di sgRNA con uno spettrofotometro. La concentrazione di sgRNA diluito è di circa 870 ng/μL.
   7. Diluire il prodotto di reazione IVT a 20 ng/μL con acqua trattata con DEPC. Aliquotare e conservare l'sgRNA direttamente a -80 °C.
      NOTA: Dopo la reazione IVT, la rimozione del DNA stampo mediante digestione DNasi non è necessaria per misurare la concentrazione precisa di sgRNA, poiché la quantità del DNA stampo è inferiore allo 0,4% di quella di sgRNA e il DNA stampo non influisce sulla successiva reazione di massa CRISPR. Pertanto, la purificazione dell'sgRNA non è necessaria.
4. Valutazione degli sgRNA
   1. Digerire un plasmide cDNA/ORF contenente la spina dorsale del vettore pOT2 con un enzima di restrizione. Separare i frammenti di DNA risultanti mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. Purificare il substrato del DNA con un kit di estrazione in gel.
      NOTA: Un frammento di DNA risultante contenente le sequenze di targeting dell'sgRNA della spina dorsale del vettore pOT2 funge da substrato di DNA di Cas9/sgRNA. I siti di scissione dei Cas9/sgRNA sono situati in modo asimmetrico nel substrato del DNA e, quindi, la scissione del substrato del DNA da parte dei Cas9/sgRNA produce due frammenti di DNA di dimensioni diverse, il che li rende più facili da distinguere dal substrato di DNA non scisso nella reazione di digestione.
   2. Impostare una reazione di scissione Cas9 da 5 μL come segue: 0,2 μL di 1,22 μM di S. pyogenes Cas9, 0,5 μL di 20 ng/μL di sgRNA, 0,015 pmol di substrato di DNA, 0,5 μL di tampone Cas9 10x e acqua trattata con DEPC. Incubare le reazioni a 37 °C per 1 ora.
   3. Separare i prodotti di scissione mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. Caricare il substrato di DNA intatto come controllo negativo per il substrato di DNA digerito.
      NOTA: Qui, il substrato di DNA intatto si riferisce al substrato di DNA che non è soggetto a reazioni di digestione da parte di Cas9/sgRNA. La scissione del substrato di DNA da parte di Cas9/sgRNA produce due frammenti di DNA di dimensioni diverse, il che li rende più facili da distinguere dal substrato di DNA non scisso nella reazione di digestione.
   4. Analizza i modelli di clivaggio con un sistema di imaging digitale (Figura 2). Seleziona l'sgRNA più efficiente per i successivi esperimenti CRISPRmass. La Figura 2 mostra che tutti e quattro gli sgRNA mostrano un'elevata efficienza di scissione e possono essere utilizzati per CRISPRmass. Seleziona l'sgRNA sottolineato per gli esperimenti successivi.
      NOTA: Minore è il substrato di DNA non scisso, più efficiente è l'sgRNA per la digestione di Cas9/sgRNA del substrato di DNA.

2. Costruzione di un modulo UAS

NOTA: Un modulo UAS comprende un UAS centrale e circa 20-40 bp delle sequenze terminali 5' e 3' che si sovrappongono rispettivamente alle estremità 5' e 3' del sito di scissione della spina dorsale (Figura 1). Le sequenze terminali 5' e 3' del modulo UAS sono determinate dal sito di clivaggio della spina dorsale del vettore pOT2.

1. Clonare il modulo UAS specifico del vettore pOT2 nel sito EcoRI del vettore pCR8GW, ottenendo il plasmide pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (File supplementare 1). Rilasciare il modulo UAS vettoriale specifico pOT2 mediante digestione del plasmide pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 con EcoRI a 37 °C per 1 ora.
2. Separare i prodotti di scissione mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,7%. Purificare il modulo UAS 6178-bp con un kit di estrazione del gel. Diluire il modulo UAS a 23 ng/μL per gli esperimenti successivi. Questo frammento di 6178-bp funge da modulo UAS per la costruzione di plasmidi UAS-cDNA/ORF da cloni di cDNA/ORF basati su vettori pOT2.

3. Costruzione su larga scala di plasmidi UAS-cDNA/ORF mediante CRISPRmass

NOTA: CRISPRmass è standardizzato come reazioni in provetta in due fasi massicciamente parallele prima della trasformazione di E. coli (Figura 1).

1. Reazione in provetta fase 1
   1. Scindere le ossa vettoriali identiche dei plasmidi cDNA/ORF mediante Cas9/sgRNA. Disporre le provette da 0,2 mL in un blocco di raffreddamento di alluminio sul ghiaccio ed etichettare accuratamente le provette. Preparare il master mix come segue.
      1. Per una singola reazione, aggiungere 0,16 μL di 1,22 μM di S. pyogenes Cas9, 0,4 μL di 20 ng/μL di sgRNA, 0,24 μL di tampone 10x Cas9, 1,2 μL di acqua trattata con DEPC. Per le reazioni N, aggiungere (N+1) x 0,16 μL di 1,22 μM di S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μL di 20 ng/μL di sgRNA, (N+1) x 0,24 μL di tampone Cas9 10x, (N+1) x 1,2 μL di acqua trattata con DEPC.
   2. Vortice, mescola bene e gira verso il basso. Aliquotare 2 μL di master mix in ciascuna provetta. Aggiungere 0,4 μL di 0,019 μM di plasmide cDNA/ORF a ciascuna provetta. Incubare le reazioni di scissione a 37 °C per 1 ora.
      NOTA: Diluire ciascun plasmide a 0,019 μM con acqua trattata con DEPC. Se la concentrazione di un plasmide è inferiore a 0,019 μM, aggiungere il DNA plasmidico direttamente alla reazione di scissione. Utilizzare tubi privi di RNasi e acqua trattata con DEPC. L'esecuzione di questi passaggi su larga scala richiederà diverse ore. Se non diversamente specificato, conservare i reagenti e le reazioni sul ghiaccio.
2. Reazione in provetta fase 2
   1. Inserire un modulo UAS vettoriale specifico dalla fase 2 nei plasmidi cDNA/ORF linearizzati Cas9 mediante assemblaggio di reazione a passo singolo. Impostare una reazione a fase singola da 1,4 μl per ciascun campione. Disporre le provette da 0,2 mL in un blocco di raffreddamento di alluminio sul ghiaccio ed etichettare accuratamente le provette.
      1. Preparare il master mix come segue. Per una singola reazione, aggiungere 0,07 μL di modulo UAS da 0,006 μM e 0,7 μL di master mix di assemblaggio di reazione a passo singolo. Per N reazioni, aggiungere (N+1) x 0,07 μL di modulo UAS 0,006 μM e (N+1) x 0,7 μL di master mix di assemblaggio di reazione a passo singolo.
   2. Vortice, mescola bene e gira verso il basso. Aliquotare 0,77 μl della miscela master in ciascuna provetta. Aggiungere 0,7 μl di plasmide cDNA/ORF linearizzato Cas9 a ciascuna provetta. Incubare le reazioni a 50 °C per 1 ora.
      NOTA: Non è necessaria la purificazione dei prodotti di reazione di assemblaggio in un'unica fase. L'esecuzione di questi passaggi su larga scala richiede diverse ore. Se non diversamente specificato, conservare i reagenti e le reazioni sul ghiaccio.
3. Trasforma i prodotti della reazione di assemblaggio in un solo passaggio in E. coli su larga scala.
   1. Preraffreddare i puntali da 10 μl a 4 °C. Preraffreddare le provette da 1,5 mL in un blocco di raffreddamento in alluminio su ghiaccio.
   2. Scongelare le cellule di E. coli competenti su ghiaccio per 5 minuti. Aliquotare 10 μL di cellule competenti in ciascuna provetta prerefrigerata da 1,5 mL.
      NOTA: Utilizzare cellule di E. coli competenti disponibili in commercio con un'efficienza di trasformazione di almeno 1 x 10⁸ CFU/μg di DNA pUC19.
   3. Aggiungere 1 μl di prodotto di reazione di assemblaggio in un'unica fase a 10 μl di cellule competenti, agitare delicatamente per mescolare e mettere in ghiaccio per 30 minuti.
   4. Incubare le provette in un bagnomaria a 42 °C per 1 minuto, quindi raffreddare immediatamente con ghiaccio per 2 minuti.
   5. Aggiungere 100 μl di terreno SOC (preriscaldato a 37 °C) in ciascuna provetta a temperatura ambiente e incubare in un incubatore con agitazione (250 giri/min) a 37 °C per 1 ora.
   6. Riscaldare fino a 37 °C le piastre LB che contengono un antibiotico corrispondente al gene di resistenza agli antibiotici del modulo UAS. Distribuire le cellule sulle piastre e incubare a 37 °C per una notte.
      NOTA: l'esecuzione di questi passaggi su larga scala richiede diverse ore. Se non diversamente specificato, conservare i reagenti e le reazioni sul ghiaccio.
4. Verifica dei plasmidi UAS-cDNA/ORF costruiti da CRISPRmass
   1. Prelevare una singola colonia e inocularla in 4,5 mL di terreno liquido LB integrato con l'appropriata selezione di antibiotici corrispondenti al gene di resistenza agli antibiotici del modulo UAS. Incubare per una notte a 37 °C agitando a 250 giri/min.
   2. Estrarre il DNA plasmidico utilizzando un kit di mini-preparazione plasmidica. Impostare una reazione di digestione di restrizione da 20 μL come segue: 300-500 ng/μL di plasmide, enzima di restrizione appropriato, tampone di digestione di restrizione e acqua ultrapura. Incubare le reazioni a 37 °C per 1 ora.
   3. Separare i frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8% e analizzarli con un sistema di imaging digitale (Figura 3).

Risultati

Abbiamo applicato CRISPRmass per generare una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF a livello di genoma utilizzando 3402 cloni di cDNA/ORF con backbone vettoriale pOT2 della DGRC Gold Collection. Abbiamo analizzato in modo casuale solo una colonia per ogni costrutto UAS-cDNA/ORF e la successiva analisi delle restrizioni con PstI ha indicato che il 98,6% dei costrutti UAS-cDNA/ORF sono stati creati con successo⁹. Il razionale per l'utilizzo di PstI per l'analisi di restrizione di costrutti UAS-cDNA/ORF...

Discussione

Le fasi più critiche di CRISPRmass sono la progettazione degli sgRNA e la valutazione degli sgRNA. La selezione di sgRNA altamente efficienti per Cas9 è la chiave del successo di CRISPRmass. Se si osservano pochissime o nessuna colonia sulla maggior parte delle piastre LB contenenti antibiotici dopo la trasformazione di E. coli con prodotti di assemblaggio della reazione in un'unica fase, controllare la digestione plasmidica mediante elettroforesi su gel di agarosio. Se i plasmidi non sono ben digeriti, controllare l'a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA