UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli yapısı için CRISPR tabanlı modüler montaj

Özet

Halka açık cDNA/ORF kaynaklarını kullanarak Drosophila'daki UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerini düzenlemek için uygulanabilir.

Özet

Fonksiyonel genomik tarama, gen fonksiyonunu araştırmak için güçlü bir yaklaşım sunar ve genom çapında plazmit kütüphanelerinin oluşturulmasına dayanır. Plazmid kütüphanesi yapımı için geleneksel yaklaşımlar zaman alıcı ve zahmetlidir. Bu nedenle, yakın zamanda, genom çapında bir yukarı akış aktive edici dizi tamamlayıcı DNA/açık okuma çerçevesi (UAS-cDNA/ORF) plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için basit ve verimli bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) geliştirdik. Burada, GAL4 / UAS tabanlı bir UAS-cDNA / ORF plazmit kütüphanesinin yapısını örnek alarak CRISPRmass için bir protokol sunuyoruz. Protokol, büyük ölçüde paralel iki aşamalı test tüpü reaksiyonlarını ve ardından bakteriyel dönüşümü içerir. İlk adım, tek kılavuz RNA (sgRNA) ile birlikte CRISPR/Cas9 kullanarak cDNA'ların veya ORF'lerin 5' ucuna bitişik paylaşılan yukarı akış vektör dizilerini keserek mevcut tamamlayıcı DNA (cDNA) veya açık okuma çerçevesi (ORF) cDNA veya ORF kütüphane plazmitlerini doğrusallaştırmaktır ve ikinci adım, tek adımlı bir reaksiyon kullanarak doğrusallaştırılmış cDNA veya ORF plazmitlerine bir UAS modülü yerleştirmektir. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerinin basit, hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir şekilde oluşturulmasını sağlar. UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesi, kültürlenmiş hücrelerde fonksiyon kazancı taraması ve Drosophila'da genom çapında bir transgenik UAS-cDNA/ORF kütüphanesi oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Tarafsız tüm genom genetik taraması, belirli bir biyolojik süreçte yer alan genleri tanımlamak ve mekanizmasını aydınlatmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu nedenle, biyolojik araştırmaların çeşitli alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Drosophila genlerinin yaklaşık% 60'ı insanlarda ^1,2 korunur ve insan hastalık genlerinin ~% 75'i Drosophila^3'te homologlara sahiptir. Genetik tarama temel olarak fonksiyon kaybı (LOF) ve fonksiyon kazancı (GOF) olmak üzere iki türe ayrılır. Drosophila'daki LOF genetik taramaları, biyolojinin neredeyse her yönünü yöneten mek....

Protokol

1. cDNA/ORF'nin yukarı akışında optimal Cas9/sgRNA bölünme bölgesinin belirlenmesi

1. Aynı vektör omurgalı cDNA veya ORF plazmitlerinin hazırlanması
   1. Drosophila genom kaynak merkezi (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Altın Koleksiyonu^10,11, fare memeli gen koleksiyonu (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) ve insan CCSB çapında Lentiviral ekspresyon kütüphanesi¹² gibi kamu kaynaklarında bulunan cDNA/ORF klonlarını satın alın. Bu protokolde, DGRC Altın Koleksiyonunda bulunan pOT2 vektör tabanlı cDNA/ORF klonlarını örnek olarak alıyoruz.<....

Tartışmalar

CRISPRmass'ın en kritik adımları sgRNA'ların tasarımı ve sgRNA'ların değerlendirilmesidir. Cas9 için yüksek verimli sgRNA'ların seçimi, CRISPRmass'ın başarısının anahtarıdır. E. coli'nin tek aşamalı reaksiyon montaj ürünleri ile dönüşümünden sonra antibiyotik içeren LB plakalarının çoğunda çok az koloni gözlenirse veya hiç koloni gözlenmezse, agaroz jel elektroforezi ile plazmit sindirimini kontrol edin. Plazmitler iyi sindirilmezse, Cas9 aktivitesini, sgRNA bozunmasını ve plazmit k.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA