Montagem modular baseada em CRISPR para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF

Resumo

Apresentamos um protocolo para montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass), um método para construção de alto rendimento da biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em Drosophila usando recursos de cDNA/ORF disponíveis publicamente. O CRISPRmass pode ser aplicado à edição de várias bibliotecas de plasmídeos.

Resumo

A triagem genômica funcional oferece uma abordagem poderosa para investigar a função do gene e depende da construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma. As abordagens convencionais para a construção de bibliotecas de plasmídeos são demoradas e trabalhosas. Portanto, desenvolvemos recentemente um método simples e eficiente, montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass), para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos de DNA complementar de sequência de ativação upstream / quadro de leitura aberto (UAS-cDNA / ORF) em todo o genoma. Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRmass, tomando como exemplo a construção de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF baseada em GAL4/UAS. O protocolo inclui reações massivamente paralelas em tubos de ensaio de duas etapas, seguidas de transformação bacteriana. O primeiro passo é linearizar os plasmídeos de biblioteca de cDNA ou ORF de DNA complementar (cDNA) ou quadro de leitura aberta (ORF) existentes, cortando as sequências vetoriais upstream compartilhadas adjacentes à extremidade 5 'de cDNAs ou ORFs usando CRISPR / Cas9 junto com RNA guia único (sgRNA), e o segundo passo é inserir um módulo UAS nos plasmídeos linearizados de cDNA ou ORF usando uma reação de etapa única. O CRISPRmass permite a construção simples, rápida, eficiente e econômica de várias bibliotecas de plasmídeos. A biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF pode ser utilizada para triagem de ganho de função em células cultivadas e para construir uma biblioteca transgênica UAS-cDNA/ORF em todo o genoma em Drosophila.

Introdução

A triagem genética imparcial do genoma completo é uma abordagem poderosa para identificar genes envolvidos em um determinado processo biológico e elucidar seu mecanismo. Portanto, é amplamente utilizado em vários campos da pesquisa biológica. Aproximadamente 60% dos genes de Drosophila são conservados em humanos ^1,2 e ~ 75% dos genes de doenças humanas têm homólogos em Drosophila³. A triagem genética é dividida principalmente em dois tipos: perda de função (LOF) e ganho de função (GOF). As telas genéticas LOF em Drosophila desempenharam um papel crítico na elu....

Protocolo

1. Determinação do local ideal de clivagem de Cas9 / sgRNA a montante do cDNA / ORF

1. Preparação de plasmídeos de cDNA ou ORF com estrutura vetorial idêntica
   1. Compre clones de cDNA / ORF que estão disponíveis em recursos públicos, como o centro de recursos do genoma de Drosophila (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, a coleção de genes de mamíferos de camundongos (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) e a biblioteca de expressão lentiviral CCSB humana¹². Neste protocolo, tomamos como exemplo os clones de cDNA/ORF bas....

Discussão

As etapas mais críticas do CRISPRmass são o design de sgRNAs e a avaliação de sgRNAs. A seleção de sgRNAs altamente eficientes para Cas9 é a chave para o sucesso do CRISPRmass. Se forem observadas muito poucas ou nenhumas colónias na maioria das placas LB contendo antibióticos após a transformação de E. coli com produtos de montagem de reação de etapa única, verifique a digestão do plasmídeo por eletroforese em gel de agarose. Se os plasmídeos não forem bem digeridos, verifique a atividade de Cas9, a d.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA