UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ

要約

本稿では、一般に公開されているcDNA/ORFリソースを用いて ショウジョウバエ のUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリをハイスループットで構築する方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)のプロトコールを紹介します。CRISPRmassは、さまざまなプラスミドライブラリーの編集に適用できます。

要約

機能ゲノミクススクリーニングは、遺伝子機能を調べるための強力なアプローチを提供し、ゲノムワイドなプラスミドライブラリの構築に依存しています。プラスミドライブラリー構築のための従来のアプローチは、時間と手間がかかります。そこで、私たちは最近、ゲノムワイドなアップストリーム活性化配列相補型DNA/オープンリーディングフレーム(UAS-cDNA/ORF)プラスミドライブラリーをハイスループットに構築するための、シンプルで効率的な方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)を開発しました。ここでは、GAL4/UASベースのUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーの構築を例に、CRISPRmassのプロトコールを紹介します。このプロトコルには、超並列の2段階試験管反応とそれに続く細菌の形質転換が含まれます。最初のステップは、CRISPR/Cas9を使用してcDNAまたはORFの5'末端に隣接する共有アップストリームベクター配列をシングルガイドRNA(sgRNA)と一緒に切断することにより、既存の相補的DNA(cDNA)またはオープンリーディングフレーム(ORF)cDNAまたはORFライブラリプラスミドを直鎖化することです。また、次のステップは、シングルステップ反応を使用して、直鎖化されたcDNAまたはORFプラスミドにUASモジュールを挿入することです。CRISPRmassは、さまざまなプラスミドライブラリーをシンプル、迅速、効率的、かつ費用対効果の高い方法で構築することができます。UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーは、培養細胞における機能獲得スクリーニングや 、ショウジョウバエにおけるゲノムワイドなトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーの構築に利用できます。

概要

バイアスのない全ゲノム遺伝子スクリーニングは、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子を特定し、そのメカニズムを解明するための強力なアプローチです。したがって、それは生物学研究のさまざまな分野で広く使用されています。ショウジョウバエの遺伝子の約60%^はヒト1,2に保存されており、ヒトの疾患遺伝子の~75%はショウジョウバエ³で相同体を持っています。遺伝子スクリーニングは、主に機能喪失(LOF)と機能獲得(GOF)の2種類に分けられます。ショウジョウバエのLOF遺伝子スクリーニングは、生物学のほぼすべての側面を支配するメカニズムを解明する上で重要な役割を果たしてきました。しかし、ショウジョウバエの遺伝子の大部分は明らかなLOF^{表現型を持って}いないため4、したがって、GOFスクリーニングはこれらの遺伝子の機能を研究するための重要な方法です^4,5。

バイナリGAL4/UASシステムは、 ショウジョウバエ⁶の組織特異的遺伝子....

プロトコル

1. cDNA/ORF上流のCas9/sgRNA切断部位の最適決定

1. 同一のベクターバックボーンを持つcDNAまたはORFプラスミドの調製
   1. Drosophila genome resource center(DGRC、https://dgrc.bio.indiana.edu/)Gold Collection ^10,11、マウス哺乳類遺伝子コレクション(MGC、https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/)、ヒトCCSBブロードレンチウイルス発現^{ライブラリー12}などの公開リソースで利用可能なcDNA/ORFクローンを購入します。このプロトコルでは、DGRC Gold Collectionで入手可能なpOT2ベクターベースのcDNA/ORFクローンを例として取り上げます。
   2. プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを抽出します。分光光度計でプラスミドの濃度を測定します。
2. sgRNAの設計
   1. CHOPCHOPのWebサイト(https://chopchop.cbu.uib.no/)にアクセスしてください。「Paste Target 」....

ディスカッション

CRISPRmassの最も重要なステップは、sgRNAの設計とsgRNAの評価です。Cas9用の高効率sgRNAの選択は、CRISPRmassの成功の鍵です。大腸菌をシングルステップ反応集合産物で形質転換した後、抗生物質含有LBプレートの大部分でコロニーがほとんどまたはまったく観察されない場合は、アガロースゲル電気泳動によるプラスミド消化を確認してください。プラスミドが十分に消化されない場合は、Cas9活性?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA