UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ

要約

本稿では、一般に公開されているcDNA/ORFリソースを用いて ショウジョウバエ のUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリをハイスループットで構築する方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)のプロトコールを紹介します。CRISPRmassは、さまざまなプラスミドライブラリーの編集に適用できます。

要約

機能ゲノミクススクリーニングは、遺伝子機能を調べるための強力なアプローチを提供し、ゲノムワイドなプラスミドライブラリの構築に依存しています。プラスミドライブラリー構築のための従来のアプローチは、時間と手間がかかります。そこで、私たちは最近、ゲノムワイドなアップストリーム活性化配列相補型DNA/オープンリーディングフレーム(UAS-cDNA/ORF)プラスミドライブラリーをハイスループットに構築するための、シンプルで効率的な方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)を開発しました。ここでは、GAL4/UASベースのUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーの構築を例に、CRISPRmassのプロトコールを紹介します。このプロトコルには、超並列の2段階試験管反応とそれに続く細菌の形質転換が含まれます。最初のステップは、CRISPR/Cas9を使用してcDNAまたはORFの5'末端に隣接する共有アップストリームベクター配列をシングルガイドRNA(sgRNA)と一緒に切断することにより、既存の相補的DNA(cDNA)またはオープンリーディングフレーム(ORF)cDNAまたはORFライブラリプラスミドを直鎖化することです。また、次のステップは、シングルステップ反応を使用して、直鎖化されたcDNAまたはORFプラスミドにUASモジュールを挿入することです。CRISPRmassは、さまざまなプラスミドライブラリーをシンプル、迅速、効率的、かつ費用対効果の高い方法で構築することができます。UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーは、培養細胞における機能獲得スクリーニングや 、ショウジョウバエにおけるゲノムワイドなトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーの構築に利用できます。

概要

バイアスのない全ゲノム遺伝子スクリーニングは、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子を特定し、そのメカニズムを解明するための強力なアプローチです。したがって、それは生物学研究のさまざまな分野で広く使用されています。ショウジョウバエの遺伝子の約60%^はヒト1,2に保存されており、ヒトの疾患遺伝子の~75%はショウジョウバエ³で相同体を持っています。遺伝子スクリーニングは、主に機能喪失(LOF)と機能獲得(GOF)の2種類に分けられます。ショウジョウバエのLOF遺伝子スクリーニングは、生物学のほぼすべての側面を支配するメカニズムを解明する上で重要な役割を果たしてきました。しかし、ショウジョウバエの遺伝子の大部分は明らかなLOF^{表現型を持って}いないため4、したがって、GOFスクリーニングはこれらの遺伝子の機能を研究するための重要な方法です^4,5。

バイナリGAL4/UASシステムは、 ショウジョウバエ⁶の組織特異的遺伝子発現に一般的に使用されます。このシステムでは、組織は、GAL4応答性要素(UAS)に結合する酵母転写活性化因子GAL4を特異的に発現し、それによって下流の遺伝成分(例えば、cDNAおよびORF)^の転写を活性化します6。 ショウジョウバエでゲノムワイドなGOFスクリーニングを行うためには、ゲノムワイドなUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーを構築し、続いて ショウジョウバエにトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーを構築する必要があります。

一般に入手可能なcDNA/ORFクローンから従来の方法によるゲノムワイドなUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーの構築は、プライマーの設計と合成、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ゲル精製、シーケンシング、制限消化など、すべての遺伝子が個別の設計を必要とするため、時間と労力を要します^7,8.したがって、このようなプラスミドライブラリーの構築は、ショウジョウバエにおけるゲノムワイドなトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーを作製するための律速ステップとなります。最近、私たちは新しい方法であるCRISPRベースのモジュラーアセンブリ(CRISPRmass^)を開発することにより、この問題を解決することに成功しました9。CRISPRmassの中核は、遺伝子編集技術とシームレスクローニング技術の組み合わせにより、プラスミドライブラリーの共有ベクター配列を操作することです。

ここでは、超並列の2ステップ試験管反応とそれに続く細菌の形質転換を含むCRISPRmassのプロトコールを紹介します。CRISPRmass は、シンプルで、迅速、効率的、かつ費用対効果の高い方法であり、原則として、さまざまなプラスミドライブラリのハイスループット構築に使用できます。

CRISPR質量戦略
CRISPRmass の手順は、 大腸菌 (E. coli) 形質転換前の並列 2 段階試験管反応から始まります (図 1)。ステップ1は、Cas9/sgRNAによるcDNA/ORFプラスミドの同一のベクターバックボーンの切断です。理想的な切断部位は、cDNA/ORFの5'末端に隣接しています。劈開産物は精製する必要はありません。ステップ2は、GibsonアセンブリによりCas9/sgRNA直鎖状cDNA/ORFプラスミドにベクター特異的なUASモジュールを挿入(以下、シングルステップ反応と呼ぶ)することで、UAS-cDNA/ORFプラスミドを作製します。UASモジュールの5'末端配列と3'末端配列は、直鎖状化されたcDNA/ORFプラスミドの末端配列と重なり、シングルステップ反応を可能にします。

シングルステップ反応生成物は、 大腸菌 の形質転換に直接さらされます。理論的には、UASモジュールの抗生物質耐性遺伝子に対応する選択抗生物質を含むLuria-Bertani(LB)プレート上で成長できるのは、目的のUAS-cDNA/ORFコロニーのみです。UASモジュールは、コアUASモジュール、cDNAまたはORFプラスミドとは異なる抗生物質耐性遺伝子、および5′および3′末端配列で構成されています。コアUASモジュールは、UASの10コピー、Hsp70最小プロモーター、phiC31を介したゲノム統合のattB配列、 およびショウジョウバエ⁷のミニホワイト形質転換マーカーで構成されています。

プロトコル

1. cDNA/ORF上流のCas9/sgRNA切断部位の最適決定

1. 同一のベクターバックボーンを持つcDNAまたはORFプラスミドの調製
   1. Drosophila genome resource center(DGRC、https://dgrc.bio.indiana.edu/)Gold Collection ^10,11、マウス哺乳類遺伝子コレクション(MGC、https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/)、ヒトCCSBブロードレンチウイルス発現^{ライブラリー12}などの公開リソースで利用可能なcDNA/ORFクローンを購入します。このプロトコルでは、DGRC Gold Collectionで入手可能なpOT2ベクターベースのcDNA/ORFクローンを例として取り上げます。
   2. プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを抽出します。分光光度計でプラスミドの濃度を測定します。
2. sgRNAの設計
   1. CHOPCHOPのWebサイト(https://chopchop.cbu.uib.no/)にアクセスしてください。「Paste Target 」ボタンをクリックし、目的のDNA配列を入力します。対象の配列は、cDNA/ORF 5'末端の上流のpOT2ベクターバックボーンに位置する20〜100 bpの領域です。
   2. 種を選択してください ショウジョウバエメラノガスター。「ターゲットサイトを検索」ボタンをクリックします。予測効率が80%を超えるsgRNA候補を選択します。
3. sgRNAの調製
   1. PAGE精製オリゴ、フォワードプライマー(5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTA
      ここで、(N)₂₀ はsgRNAの標的配列であり、sgRNAスキャフォールドリバースプライマーsgRNA-REV(5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3')である。
      注:PAGE精製された高品質のオリゴヌクレオチドの使用を推奨します。
   2. sgRNAの in vitro 転写(IVT)用のDNAテンプレートをPCRで調製します。100 μL の PCR 反応液を次のように設定します: 5 μL のテンプレート pX330 (Addgene plasmid 42230、Feng Zhang からの贈り物; 0.1 ng/μL)、5 μL のフォワードプライマー (10 μM)、5 μL の sgRNA-REV (10 μM)、50 μL の 2x High Fidelity PCR マスターミックス、および 35 μL のジエチルピロカーボネート (DEPC) 処理水 in PCR チューブ。
   3. 以下の熱サイクル条件を用いてPCRを実施します:98°Cを1サイクル、30秒間。98 °C で 10 秒、51 °C で 10 秒、72 °C で 5 秒の 5 サイクル。98°Cで10秒間、72°Cで15秒間の30サイクル。72°Cを1サイクル、2分間サーマルサイクラーで反応をインキュベートします。
   4. 0.8%アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を分離します。~120 bp の DNA 断片が UV 下でゲル上に見えるはずです。ゲル抽出キットを使用して~120 bpのDNAフラグメントを精製します。精製されたDNA断片は、sgRNAのIVTのテンプレートとして機能します。
   5. 165 ng ~120 bp の精製ゲル DNA フラグメント、1.65 μL の NTP バッファーミックス、0.33 μL の T7 RNA ポリメラーゼミックス、および DEPC 処理水で 5 μL の IVT 反応を設定します。反応液を37°Cで4時間インキュベートします。 in vitro 転写キットのマニュアルの指示に従ってください。
   6. IVT反応生成物に45μLのDEPC処理水を加えます。IVT反応生成物をRNAとして扱い、DEPC処理水をブランクコントロールとして使用します。分光光度計でsgRNAの濃度を測定します。希釈したsgRNAの濃度は約870 ng/μLです。
   7. IVT反応生成物をDEPC処理水で20 ng/μLに希釈します。sgRNAを-80°Cで直接分注して保存します。
      注:IVT反応後、DNAテンプレートの量はsgRNAの量の0.4%未満であり、DNAテンプレートはその後のCRISPRmass反応に影響を与えないため、sgRNAの正確な濃度を測定するためにDNase消化によるDNAテンプレートの除去は必要ありません。したがって、sgRNAの精製は必要ありません。
4. sgRNAの評価
   1. pOT2ベクター骨格を持つcDNA/ORFプラスミドを制限酵素で消化します。得られたDNA断片を0.8%アガロースゲル電気泳動で分離します。ゲル抽出キットでDNA基質を精製します。
      注:pOT2ベクター骨格のsgRNAターゲティング配列を含む得られたDNA断片は、Cas9/sgRNAのDNA基質として機能します。Cas9/sgRNAの切断部位はDNA基質上に非対称に位置しているため、Cas9/sgRNAによるDNA基質の切断により、サイズの異なる2つのDNA断片が生成され、消化反応において切断されていないDNA基質と区別しやすくなります。
   2. 5 μL の Cas9 切断反応を次のように設定します: 0.2 μL の 1.22 μM 化膿性ブドウ球菌 Cas9、0.5 μL の 20 ng/μL sgRNA、0.015 pmol の DNA 基質、0.5 μL の 10x Cas9 バッファー、および DEPC 処理水。反応液を37°Cで1時間インキュベートします。
   3. 0.8%アガロースゲル電気泳動により、切断産物を分離します。インタクトなDNA基質を、消化したDNA基質のネガティブコントロールとしてロードします。
      注:ここで、インタクトDNA基質とは、Cas9/sgRNAによる消化反応を受けないDNA基質を指します。Cas9/sgRNAによるDNA基質の切断により、サイズの異なる2つのDNA断片が生成されるため、消化反応で切断されていないDNA基質と区別しやすくなります。
   4. デジタルイメージングシステムによる切断パターンの解析(図2)。その後のCRISPRmass実験に最も効率的なsgRNAを選択します。 図2 は、4つのsgRNAすべてが高い切断効率を示し、CRISPRmassに使用できることを示しています。下線が引かれたsgRNAを後続の実験のために選択します。
      注:切断されていないDNA基質が少ないほど、sgRNAはDNA基質のCas9/sgRNA消化に対してより効率的になります。

2. UASモジュールの構築

注:UASモジュールは、コアUASと、バックボーン切断部位の5'末端と3'末端にそれぞれ重なる約20-40 bpの5'および3'末端配列で構成されています(図1)。UASモジュールの5'および3'末端配列は、pOT2ベクターのバックボーン切断部位によって決定されます。

1. pCR8GWベクターのEcoRI部位にpOT2ベクター特異的UASモジュールをクローニングし、pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70プラスミドを生成します(補足ファイル1)。pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70プラスミドをEcoRIで37°Cで1時間分解することにより、pOT2ベクター特異的UASモジュールを放出します。
2. 0.7%アガロースゲル電気泳動により、切断産物を分離します。6178 bp UASモジュールをゲル抽出キットで精製します。その後の実験のために、UASモジュールを23 ng/μLに希釈します。この6178bpフラグメントは、pOT2ベクターベースのcDNA/ORFクローンからUAS-cDNA/ORFプラスミドを構築するためのUASモジュールとして機能します。

3. CRISPRmassによるUAS-cDNA/ORFプラスミドの大規模構築

注:CRISPRmass は、 大腸菌 形質転換前の超並列 2 ステップ試験管反応として標準化されています(図 1)。

1. 試験管反応ステップ1
   1. cDNA/ORFプラスミドの同一のベクターバックボーンをCas9/sgRNAで切断します。氷の上のアルミニウム冷却ブロックに0.2 mLチューブを配置し、チューブに慎重にラベルを付けます。マスターミックスは以下のように準備します。
      1. 1回の反応では、0.16 μL の 1.22 μM 化膿性ブドウ球菌 Cas9、0.4 μL の 20 ng/μL sgRNA、0.24 μL の 10x Cas9 バッファー、1.2 μL の DEPC 処理水を加えます。N反応の場合、(N+1)×0.16 μLの1.22 μM S. powgenes Cas9、(N+1)×0.4 μLの20 ng/μL sgRNA、(N+1)×0.24 μLの10x Cas9バッファー、(N+1)×1.2 μLのDEPC処理水を加えます。
   2. 渦巻き、よく混ぜて、スピンダウンします。各チューブに2μLのマスターミックスを分注します。0.019 μM の cDNA/ORF プラスミド 0.4 μL を各チューブに添加します。切断反応を37°Cで1時間インキュベートします。
      注:各プラスミドをDEPC処理水で0.019μMに希釈します。プラスミドの濃度が0.019 μM未満の場合は、プラスミドDNAを直接切断反応に添加します。RNaseフリーチューブとDEPC処理水を使用してください。これらの手順を大規模に実行するには、数時間かかります。特に指定のない限り、試薬と反応液は氷の上に置いてください。
2. 試験管反応ステップ2
   1. ステップ2のベクター特異的UASモジュールを、シングルステップ反応アセンブリによりCas9直鎖化cDNA/ORFプラスミドに挿入します。各サンプルに対して1.4 μLのシングルステップ反応を設定します。0.2 mLチューブを氷上のアルミニウム冷却ブロックに並べ、チューブに慎重にラベルを付けます。
      1. マスターミックスは以下のように準備します。1回の反応の場合、0.07 μLの0.006 μM UASモジュールと0.7 μLのシングルステップ反応アセンブリマスターミックスを添加します。N反応の場合は、0.006 μM UASモジュールの(N+1) x 0.07 μLと(N+1) x 0.7 μLのシングルステップ反応アセンブリマスターミックスを添加します。
   2. 渦巻き、よく混ぜて、スピンダウンします。各チューブに0.77μLのマスターミックスを分注します。0.7 μL の Cas9 直鎖状 cDNA/ORF プラスミドを各チューブに添加します。反応液を50°Cで1時間インキュベートします。
      注:シングルステップアセンブリ反応生成物の精製は必要ありません。これらの手順を大規模に実行するには、数時間かかります。特に指定のない限り、試薬と反応液は氷の上に置いてください。
3. シングルステップアセンブリ反応生成物を大規模に 大腸菌 に変換します。
   1. 10 μLチップを4°Cで予冷します。 1.5 mLチューブを氷上のアルミニウム冷却ブロックで予冷します。
   2. コンピテント 大腸菌 細胞を氷上で5分間解凍します。10 μLのコンピテントセルを、予め冷却した各1.5 mLチューブに分注します。
      注:少なくとも1 x 10⁸ CFU/μgのpUC19 DNAの形質転換効率を持つ市販の有能大腸菌細胞を使用してください。
   3. 10 μLのコンピテントセルに1 μLのシングルステップアセンブリ反応産物を加え、穏やかに渦巻いて混合し、氷上に30分間置きます。
   4. チューブを42°Cのウォーターバスで1分間インキュベートし、すぐに氷の上で2分間冷やします。
   5. 各チューブに100 μLのSOC培地(37°Cに予熱)を室温で加え、振とうインキュベーター(250 rpm)で37°Cで1時間インキュベートします。
   6. UASモジュールの抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を含むLBプレートを37°Cまで温めます。細胞をプレート上に広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
      注: これらの手順を大規模に実行するには、数時間かかります。特に指定のない限り、試薬と反応液は氷の上に置いてください。
4. CRISPRmassで構築したUAS-cDNA/ORFプラスミドの検証
   1. 単一のコロニーを選択し、UASモジュールの抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質の適切な選択を補充した4.5mLのLB液体培地に接種します。250 rpmで振とうしながら、37°Cで一晩インキュベートします。
   2. プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを抽出します。20 μLの制限酵素反応を次のようにセットアップします:300-500 ng/μLのプラスミド、適切な制限酵素、制限酵素バッファー、および超純水。反応液を37°Cで1時間インキュベートします。
   3. 0.8%アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、デジタルイメージングシステムにより解析します(図3)。

結果

CRISPRmassを適用して、DGRC Gold CollectionのpOT2ベクターバックボーンを持つ3402のcDNA/ORFクローンを使用して、ゲノムワイドなUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリを作製しました。我々は、各UAS-cDNA/ORFコンストラクトに対して1つのコロニーのみをランダムに解析し、その後のPstIによる制限解析では、UAS-cDNA/ORFコンストラクトの98.6%が成功裏に作成されたことが示されました⁹。pOT2ベクタ...

ディスカッション

CRISPRmassの最も重要なステップは、sgRNAの設計とsgRNAの評価です。Cas9用の高効率sgRNAの選択は、CRISPRmassの成功の鍵です。大腸菌をシングルステップ反応集合産物で形質転換した後、抗生物質含有LBプレートの大部分でコロニーがほとんどまたはまったく観察されない場合は、アガロースゲル電気泳動によるプラスミド消化を確認してください。プラスミドが十分に消化されない場合は、Cas9活性?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA