UAS-cDNA/ORF Plasmid Library의 고처리량 구축을 위한 CRISPR-based Modular Assembly

요약

공개적으로 사용 가능한 cDNA/ORF 리소스를 사용하여 Drosophila 에서 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축 방법인 CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass)를 위한 프로토콜을 제시합니다. CRISPRmass는 다양한 플라스미드 라이브러리 편집에 적용할 수 있습니다.

초록

기능적 유전체학 스크리닝은 유전자 기능을 프로브하기 위한 강력한 접근법을 제공하며 게놈 전반의 플라스미드 라이브러리 구축에 의존합니다. plasmid library 구축을 위한 기존의 접근법은 시간과 노력이 많이 듭니다. 따라서 최근에는 유전체 전체 업스트림 활성화 서열 보완 DNA/개방형 판독 프레임(UAS-cDNA/ORF) 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축을 위한 간단하고 효율적인 방법인 CRISPR-based modular assembly(CRISPRmass)를 개발했습니다. 여기에서는 GAL4/UAS 기반 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리의 구축을 예로 들어 CRISPRmass를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 대규모로 병렬화된 2단계 시험관 반응과 박테리아 변형이 포함됩니다. 첫 번째 단계는 CRISPR/Cas9와 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 함께 사용하여 cDNA 또는 ORF의 5' 말단에 인접한 공유 업스트림 벡터 염기서열을 절단하여 기존 상보적 DNA(cDNA) 또는 개방형 판독 프레임(ORF) cDNA 또는 ORF 라이브러리 플라스미드를 선형화하는 것이며, 두 번째 단계는 단일 단계 반응을 사용하여 선형화된 cDNA 또는 ORF 플라스미드에 UAS 모듈을 삽입하는 것입니다. CRISPRmass를 사용하면 다양한 플라스미드 라이브러리를 간단하고 빠르며 효율적이며 비용 효율적으로 구축할 수 있습니다. UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리는 배양된 세포의 Gain-of-Function 스크리닝 및 초파리에서 게놈 전반의 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 구축하는 데 활용할 수 있습니다.

서문

편향되지 않은 전체 게놈 유전자 스크리닝은 주어진 생물학적 과정에 관여하는 유전자를 식별하고 그 메커니즘을 규명하기 위한 강력한 접근 방식입니다. 따라서 생물학 연구의 다양한 분야에서 널리 사용됩니다. 초파리 유전자의 약 60%는 인간 ^1,2에서 보존되며, 인간 질병 유전자의 ~75%는 초파리³에서 상동체를 가지고 있습니다. 유전자 검사는 크게 LOF(loss of function)와 GOF(gain of function)의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 초파리의 LOF 유전자 스크리닝은 생물학의 거의 모든 측면을 지배하는 메커니즘을 규명하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 대부분의 초파리 유전자는 명백한 LOF 표현형⁴을 가지고 있지 않으므로 GOF 스크리닝은 이러한 유전자 ^4,5의 기능을 연구하는 중요한 방법입니다.

binary GAL4/UAS 시스템은 Drosophila⁶에서 조직 특이적 유전자 발현에 일반적으로 사용됩니다. 이 시스템에서 조직은 GAL4 반응 요소(UAS)에 결합하는 효모 전사 활성인자 GAL4를 특이적으로 발현하여 다운스트림 유전 성분(예: cDNA 및 ORF^)의 전사를 활성화합니다6. 초파리에서 게놈 전반의 GOF 스크리닝을 수행하기 위해서는 게놈 전반의 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리를 구축해야 하며, 이어서 초파리에서 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 구축해야 합니다.

공개적으로 사용 가능한 cDNA/ORF 클론에서 기존 방법으로 게놈 전체 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리를 구축하는 것은 모든 유전자가 프라이머 설계 및 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 겔 정제, 염기서열 분석, 제한 소화 등을 포함한 개별화된 설계를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 힘들다^7,8. 따라서, 이러한 플라스미드 라이브러리의 구축은 초파리에서 게놈 전반의 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 생성하는 속도 제한 단계입니다. 최근에는 새로운 방법인 CRISPRmass(CRISPR-based modular assembly)⁹를 개발하여 이 문제를 성공적으로 해결했습니다. CRISPRmass의 핵심은 유전자 편집 기술과 Seamless cloning 기술의 조합을 통해 플라스미드 라이브러리의 공유 벡터 염기서열을 조작하는 것입니다.

여기에서는 CRISPRmass에 대한 프로토콜을 제시하며, 여기에는 대규모 병렬 2단계 시험관 반응 후 박테리아 변형이 포함됩니다. CRISPRmass는 원칙적으로 다양한 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축에 사용할 수 있는 간단하고 빠르며 효율적이며 비용 효율적인 방법입니다.

CRISPRmass 전략
CRISPRmass의 절차는 대장 균(E. coli) 형질전환에 앞서 병렬 2단계 시험관 반응으로 시작됩니다(그림 1). 1단계는 Cas9/sgRNA에 의한 cDNA/ORF 플라스미드의 동일한 벡터 백본을 절단하는 것입니다. 이상적인 절단 부위는 cDNA/ORF의 5′ 말단에 인접해 있습니다. 분열 산물은 정제할 필요가 없습니다. 2단계는 Gibson 어셈블리(이하 single step reaction)에 의해 Cas9/sgRNA 선형화된 cDNA/ORF 플라스미드에 벡터 특이적 UAS 모듈을 삽입하여 UAS-cDNA/ORF 플라스미드를 생성하는 것입니다. UAS 모듈의 5′ 및 3′ 말단 염기서열은 선형화된 cDNA/ORF 플라스미드의 염기서열과 겹치므로 단일 단계 반응이 가능합니다.

단일 단계 반응 산물은 직접 E. coli 변형을 거칩니다. 이론적으로, UAS 모듈의 항생제 내성 유전자에 해당하는 선택 항생제를 포함하는 Luria-Bertani(LB) 플레이트에서는 원하는 UAS-cDNA/ORF 콜로니만 성장할 수 있습니다. UAS 모듈은 핵심 UAS 모듈, cDNA 또는 ORF 플라스미드와 구별되는 항생제 내성 유전자, 5′ 및 3′ 말단 서열로 구성됩니다. 핵심 UAS 모듈은 UAS 사본 10개, Hsp70 최소 프로모터, phiC31 매개 게놈 통합을 위한 attB 염기서열, Drosophila⁷에 대한 mini-white 형질전환 마커로 구성됩니다.

프로토콜

1. cDNA/ORF의 상류에 위치한 최적의 Cas9/sgRNA 절단 부위 결정

1. 동일한 벡터 백본을 가진 cDNA 또는 ORF 플라스미드의 준비
   1. Drosophila genome resource center(DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, 마우스 포유류 유전자 collection(MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) 및 human CCSB-wide Lentiviral expression library¹²와 같은 공개 리소스에서 사용할 수 있는 cDNA/ORF 클론을 구입합니다. 이 프로토콜에서는 DGRC Gold Collection에서 사용할 수 있는 pOT2 벡터 기반 cDNA/ORF 클론을 예로 들어 보겠습니다.
   2. plasmid mini-prep kit를 사용하여 plasmid DNA를 추출합니다. 분광광도계로 plasmids의 농도를 측정합니다.
2. sgRNA의 설계
   1. CHOPCHOP 웹 사이트(https://chopchop.cbu.uib.no/)를 방문하십시오. Paste Target 버튼을 클릭한 다음 관심 있는 DNA 염기서열을 입력합니다. 관심 염기서열은 cDNA/ORF 5' 말단의 상류에 있는 pOT2 벡터 백본에 위치한 20-100 bp 영역입니다.
   2. Drosophila melanogaster 종을 선택하십시오. 대상 사이트 찾기 버튼을 클릭합니다. 효율이 80% 이상으로 예측되는 sgRNA 후보를 선택하십시오.
3. sgRNA의 제조
   1. PAGE 정제 올리고, 전방 프라이머(5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTA 주문
      GAAATAG-3′), 여기서 (N)₂₀ 은 sgRNA의 표적 염기서열이고, sgRNA 스캐폴드 역프라이머 sgRNA-REV(5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′)입니다.
      참고: PAGE로 정제된 고품질 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 좋습니다.
   2. sgRNA의 시험관 내 전사(IVT)를 위해 PCR로 DNA 템플릿을 준비합니다. 다음과 같이 100 μL PCR 반응을 설정합니다: 5 μL 템플릿 pX330 (Addgene plasmid 42230, Feng Zhang의 선물; 0.1 ng/μL), 5 μL의 forward primer (10 μM), 5 μL의 sgRNA-REV (10 μM), 50 μL의 2x High fidelity PCR master mix 및 35 μL의 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리수를 PCR 튜브에 넣습니다.
   3. 다음의 열순환 조건을 사용하여 PCR을 수행한다: 30초 동안 98°C의 1주기; 10초 동안 98°C의 5주기, 10초 동안 51°C, 5초 동안 72°C의 5주기; 10초 동안 98°C의 30회 주기, 15초 동안 72°C; 1분 동안 72°C의 2주기 열 순환기에서 반응을 배양합니다.
   4. PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리합니다. ~120-bp DNA 조각은 UV 아래의 겔에서 볼 수 있어야 합니다. 겔 추출 키트를 사용하여 ~120-bp DNA 절편을 정제합니다. 정제된 DNA 단편은 sgRNA의 IVT를 위한 템플릿 역할을 합니다.
   5. 다음과 같이 5 μL IVT 반응을 설정합니다: 165 ng의 ~120-bp 정제된 겔 DNA 단편, 1.65 μL의 NTP 완충 혼합물, 0.33 μL의 T7 RNA 중합효소 혼합물 및 DEPC 처리수. 37°C에서 4시간 동안 반응을 배양합니다. in vitro transcription kit의 수동 지침을 따르십시오.
   6. IVT 반응 생성물에 DEPC 처리수 45μL를 추가합니다. IVT 반응 산물을 RNA로 처리하고 DEPC 처리수를 블랭크 대조군으로 사용합니다. 분광광도계로 sgRNA의 농도를 측정합니다. 희석된 sgRNA의 농도는 약 870ng/μL입니다.
   7. IVT 반응 생성물을 DEPC 처리수로 20ng/μL로 희석합니다. sgRNA를 -80 °C에서 직접 분취 및 보관합니다.
      참고: IVT 반응 후에는 DNA 템플릿의 양이 sgRNA의 0.4% 미만이고 DNA 템플릿이 후속 CRISPRmass 반응에 영향을 미치지 않기 때문에 sgRNA의 정확한 농도를 측정하기 위해 DNase 분해에 의한 DNA 템플릿 제거가 필요하지 않습니다. 따라서 sgRNA 정제가 필요하지 않습니다.
4. sgRNA의 평가
   1. 제한효소로 pOT2 벡터 백본을 가진 cDNA/ORF 플라스미드를 절단합니다. 생성된 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리합니다. 겔 추출 키트로 DNA 기질을 정제합니다.
      참고: pOT2 벡터 백본의 sgRNA 표적 서열을 포함하는 결과 DNA 단편은 Cas9/sgRNA의 DNA 기질 역할을 합니다. Cas9/sgRNA의 절단 부위는 DNA 기질에 비대칭으로 위치하며, 이에 따라 Cas9/sgRNA에 의한 DNA 기질의 절단은 크기가 다른 두 개의 DNA 단편을 생성하므로 분해 반응에서 절단된 DNA 기질과 쉽게 구별할 수 있습니다.
   2. 0.2 μL의 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.5 μL의 20 ng/μL sgRNA, 0.015 pmol의 DNA 기질, 0.5 μL의 10x Cas9 완충액 및 DEPC 처리수와 같이 5 μL Cas9 절단 반응을 설정합니다. 37°C에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.
   3. 절단 생성물을 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리합니다. 온전한 DNA 기질을 분해된 DNA 기질에 대한 음성 대조군으로 로드합니다.
      참고: 여기서 intact DNA substrate는 Cas9/sgRNAs에 의한 분해 반응을 거치지 않는 DNA substrate를 의미합니다. Cas9/sgRNA에 의한 DNA 기질의 절단은 크기가 다른 두 개의 DNA 단편을 생성하여 분해 반응에서 절단된 DNA 기질과 쉽게 구별할 수 있도록 합니다.
   4. 디지털 이미징 시스템으로 분할 패턴을 분석합니다(그림 2). 후속 CRISPRmass 실험을 위해 가장 효율적인 sgRNA를 선택하십시오. 그림 2 는 4개의 sgRNA가 모두 높은 절단 효율을 나타내며 CRISPRmass에 사용할 수 있음을 보여줍니다. 후속 실험을 위해 밑줄이 그어진 sgRNA를 선택합니다.
      참고: 절단된 DNA 기질이 적을수록 DNA 기질의 Cas9/sgRNA 분해에 sgRNA가 더 효율적입니다.

2. UAS 모듈 구축

참고: UAS 모듈은 코어 UAS와 각각 백본 절단 부위의 5′ 및 3′ 말단과 겹치는 5′ 및 3′ 단자 시퀀스의 약 20-40bp로 구성됩니다(그림 1). UAS 모듈의 5' 및 3' 단자 시퀀스는 pOT2 벡터의 백본 절단 부위에 의해 결정됩니다.

1. pOT2 벡터 특이적 UAS 모듈을 pCR8GW 벡터의 EcoRI 부위에 클로닝하여 pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 플라스미드를 생성합니다(보충 파일 1). pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 플라스미드를 EcoRI로 37°C에서 1시간 동안 분해하여 pOT2 벡터 특이적 UAS 모듈을 방출합니다.
2. 절단 생성물을 0.7% 아가로스 겔 전기영동으로 분리합니다. 겔 추출 키트로 6178-bp UAS 모듈을 정제합니다. 후속 실험을 위해 UAS 모듈을 23ng/μL로 희석합니다. 이 6178-bp 단편은 pOT2 벡터 기반 cDNA/ORF 클론에서 UAS-cDNA/ORF 플라스미드를 구축하기 위한 UAS 모듈 역할을 합니다.

3. CRISPRmass에 의한 UAS-cDNA/ORF 플라스미드의 대규모 구축

참고: CRISPRmass는 대장균 변형 이전의 대규모 병렬 2단계 시험관 반응으로 표준화되었습니다(그림 1).

1. 시험관 반응 단계 1
   1. Cas9/sgRNA로 cDNA/ORF 플라스미드의 동일한 벡터 골격을 절단합니다. 얼음 위의 알루미늄 냉각 블록에 0.2mL 튜브를 배열하고 튜브에 조심스럽게 라벨을 붙입니다. 다음과 같이 마스터 믹스를 준비합니다.
      1. 단일 반응의 경우 1.22μM Pyogenes Cas9 0.16μL, 20ng/μL sgRNA 0.4μL, 10x Cas9 완충액 0.24μL, DEPC 처리수 1.2μL를 추가합니다. N 반응의 경우 (N+1) x 0.16 μL의 1.22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0.4 μL의 20 ng/μL sgRNA, (N+1) x 0.24 μL의 10x Cas9 완충액, (N+1) x 1.2 μL의 DEPC 처리수를 추가합니다.
   2. 소용돌이치고, 잘 섞고, 스핀 다운하십시오. 각 튜브에 마스터 믹스 2μL를 분취합니다. 각 튜브에 0.4 μL의 0.019 μM 의 cDNA/ORF 플라스미드를 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 절단 반응을 배양합니다.
      참고: 각 플라스미드를 DEPC 처리된 물로 0.019 μM로 희석합니다. 플라스미드의 농도가 0.019 μM 미만인 경우, 플라스미드 DNA를 절단 반응에 직접 첨가하십시오. RNase-free 튜브와 DEPC 처리수를 사용하십시오. 이러한 단계를 대규모로 수행하려면 몇 시간이 걸립니다. 달리 명시되지 않는 한, 시약과 반응을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 시험관 반응 단계 2
   1. 2단계의 벡터 특이적 UAS 모듈을 단일 단계 반응 어셈블리를 통해 Cas9-linearized cDNA/ORF plasmids에 삽입합니다. 각 샘플에 대해 1.4μL 단일 단계 반응을 설정합니다. 0.2mL 튜브를 얼음 위의 알루미늄 냉각 블록에 놓고 튜브에 조심스럽게 라벨을 붙입니다.
      1. 다음과 같이 마스터 믹스를 준비합니다. 단일 반응의 경우 0.006μM UAS 모듈 0.07μL와 단일 단계 반응 어셈블리 마스터 믹스 0.7μL를 추가합니다. N 반응의 경우 (N+1) x 0.07μL의 0.006μM UAS 모듈과 (N+1) x 0.7μL의 단단계 반응 어셈블리 마스터 믹스를 추가합니다.
   2. 소용돌이치고, 잘 섞고, 스핀 다운하십시오. 각 튜브에 0.77 μL의 마스터 믹스를 분취합니다. 각 튜브에 0.7 μL의 Cas9-linearized cDNA/ORF 플라스미드를 추가합니다. 50°C에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.
      참고: 단일 단계 조립 반응 생성물의 정제는 필요하지 않습니다. 이러한 단계를 대규모로 수행하는 데는 몇 시간이 걸립니다. 달리 명시되지 않는 한, 시약과 반응을 얼음 위에 보관하십시오.
3. 단일 단계 조립 반응 산물을 대규모로 E. coli 로 변환합니다.
   1. 4 °C에서 10 μL 팁을 프리칠합니다. 알루미늄 냉각 블록에 넣고 얼음 위에 올려 1.5mL 튜브를 사전 냉각합니다.
   2. 유능한 대장균 세포를 얼음에서 5분 동안 해동합니다. 각 사전 냉각된 1.5mL 튜브에 10μL의 유능한 세포를 분취합니다.
      참고: 형질전환 효율이 pUC19 DNA의 최소 1 x 10⁸ CFU/μg인 상업적으로 이용 가능한 유능한 대장균 세포를 사용하십시오.
   3. 10 μL의 유능한 셀에 1 μL의 단일 단계 조립 반응 생성물을 추가하고 부드럽게 휘저어 섞은 다음 30분 동안 얼음 위에 놓습니다.
   4. 튜브를 42°C 수조에서 1분 동안 배양한 다음 즉시 얼음에서 2분 동안 식힙니다.
   5. 실온에서 각 튜브에 100μL의 SOC 배지(37°C로 예열)를 넣고 37°C에서 250rpm으로 1시간 동안 배양합니다.
   6. UAS 모듈의 항생제 내성 유전자에 해당하는 항생제가 포함된 LB 플레이트를 37°C까지 예열합니다. 세포를 플레이트에 펴고 37°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 이러한 단계를 대규모로 수행하려면 몇 시간이 걸립니다. 달리 명시되지 않는 한, 시약과 반응을 얼음 위에 보관하십시오.
4. CRISPRmass에 의해 구성된 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 검증
   1. 단일 콜로니를 선택하고 UAS 모듈의 항생제 내성 유전자에 해당하는 적절한 항생제 선택이 보충된 4.5mL의 LB 액체 배지에 접종합니다. 37°C에서 250rpm으로 흔들면서 밤새 배양합니다.
   2. plasmid mini-prep kit를 사용하여 plasmid DNA를 추출합니다. 다음과 같이 20 μL 제한 분해 반응을 설정합니다: 300-500 ng/μL의 플라스미드, 적절한 제한 효소, 제한 분해 완충액 및 초순수. 37°C에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.
   3. 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고 디지털 이미징 시스템으로 분석합니다(그림 3).

결과

DGRC Gold Collection의 pOT2 벡터 백본을 가진 3402개의 cDNA/ORF 클론을 사용하여 CRISPRmass를 적용하여 게놈 전체의 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리를 생성했습니다. 각 UAS-cDNA/ORF 구조체에 대해 하나의 콜로니만 무작위로 분석했으며, PstI를 사용한 후속 제한 분석에서 UAS-cDNA/ORF 구조체의 98.6%가 성공적으로 생성되었음을 나타냈습니다⁹. pOT2 벡터 백본을 가진 UAS-cDNA/ORF 구조체의 제한 분석...

토론

CRISPRmass의 가장 중요한 단계는 sgRNA의 설계와 sgRNA의 평가입니다. Cas9에 대한 고효율 sgRNA의 선택은 CRISPRmass 성공의 핵심입니다. 단단계 반응 조립 산물로 E. coli를 형질전환시킨 후 대부분의 항생제 함유 LB 플레이트에서 콜로니가 거의 관찰되지 않거나 전혀 관찰되지 않는 경우, 아가로스 겔 전기영동에 의한 플라스미드 분해를 확인합니다. 플라스미드가 잘 소화되지 않으면 Cas9 활성, sgRNA 분해 및 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA