CRISPR-basierter modularer Aufbau für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass) vor, eine Methode zum Hochdurchsatzaufbau von UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliotheken in Drosophila unter Verwendung öffentlich verfügbarer cDNA/ORF-Ressourcen. CRISPRmass kann zur Bearbeitung verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Das funktionelle Genomik-Screening bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion und stützt sich auf den Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken. Herkömmliche Ansätze für den Aufbau von Plasmidbibliotheken sind zeitaufwändig und mühsam. Aus diesem Grund haben wir kürzlich eine einfache und effiziente Methode, die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass), für den Hochdurchsatzaufbau einer genomweiten Upstream-aktivierenden sequenzkomplementären DNA/Open Reading Frame (UAS-cDNA/ORF) Plasmidbibliothek entwickelt. Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRmass vor, am Beispiel des Aufbaus einer GAL4/UAS-basierten UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek. Das Protokoll umfasst massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen, gefolgt von einer bakteriellen Transformation. Der erste Schritt besteht darin, die vorhandenen komplementären DNA- (cDNA) oder Open Reading Frame (ORF)-cDNA- oder ORF-Bibliotheksplasmide zu linearisieren, indem die gemeinsam genutzten Upstream-Vektorsequenzen neben dem 5'-Ende von cDNAs oder ORFs unter Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit Single-Guide-RNA (sgRNA) geschnitten werden, und der zweite Schritt besteht darin, ein UAS-Modul in die linearisierten cDNA- oder ORF-Plasmide mit einer einstufigen Reaktion einzufügen. CRISPRmass ermöglicht den einfachen, schnellen, effizienten und kostengünstigen Aufbau verschiedener Plasmidbibliotheken. Die UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek kann für das Gain-of-Function-Screening in kultivierten Zellen und für den Aufbau einer genomweiten transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila verwendet werden.

Einleitung

Das unvoreingenommene genetische Screening des gesamten Genoms ist ein leistungsfähiger Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten biologischen Prozess beteiligt sind, und seinen Mechanismus aufzuklären. Daher ist es in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung weit verbreitet. Ungefähr 60% der Drosophila-Gene sind beim Menschen konserviert ^1,2, und ~75% der menschlichen Krankheitsgene haben Homologe in Drosophila³. Das genetische Screening wird hauptsächlich in zwei Arten unterteilt: Funktionsverlust (LOF) und Funktionsgewinn (GOF). LOF-Geneti....

Protokoll

1. Bestimmung der optimalen Cas9/sgRNA-Spaltstelle stromaufwärts von cDNA/ORF

1. Präparation von cDNA- oder ORF-Plasmiden mit identischem Vektorrückgrat
   1. Kaufen Sie cDNA/ORF-Klone, die in öffentlichen Ressourcen verfügbar sind, wie z. B. dem Drosophila Genome Resource Center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, der mouse mammalian gene collection (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) und der humanen CCSB-breiten Lentiviral-Expressionsbibliothek¹². In diesem Protokoll nehmen wir als Beispiel die pOT2-Vektor-basierten....

Diskussion

Die kritischsten Schritte von CRISPRmass sind das Design von sgRNAs und die Evaluierung von sgRNAs. Die Auswahl hocheffizienter sgRNAs für Cas9 ist der Schlüssel zum Erfolg von CRISPRmass. Wenn auf der Mehrzahl der antibiotikahaltigen LB-Platten nach der Transformation von E. coli mit einstufigen Reaktionsassemblierungsprodukten nur sehr wenige oder keine Kolonien beobachtet werden, ist der Plasmidverdau durch Agarosegelelektrophorese zu überprüfen. Wenn Plasmide nicht gut verdaut werden, überprüfen Sie die Cas9-Ak.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA