Ensamblaje modular basado en CRISPR para la construcción de alto rendimiento de una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF

Resumen

Presentamos un protocolo para el ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass), un método para la construcción de alto rendimiento de la biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF en Drosophila utilizando recursos de cDNA/ORF disponibles públicamente. CRISPRmass se puede aplicar a la edición de varias bibliotecas de plásmidos.

Resumen

El cribado de genómica funcional ofrece un enfoque potente para sondear la función de los genes y se basa en la construcción de bibliotecas de plásmidos de todo el genoma. Los enfoques convencionales para la construcción de bibliotecas de plásmidos requieren mucho tiempo y son laboriosos. Por lo tanto, recientemente hemos desarrollado un método simple y eficiente, el ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass), para la construcción de alto rendimiento de una biblioteca de plásmidos de ADN complementario de secuencia activadora/marco de lectura abierto (UAS-cDNA/ORF) de todo el genoma. Aquí, presentamos un protocolo para CRISPRmass, tomando como ejemplo la construcción de una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF basada en GAL4/UAS. El protocolo incluye reacciones masivas paralelas de dos pasos en el tubo de ensayo seguidas de una transformación bacteriana. El primer paso es linealizar los plásmidos de biblioteca de ADNc u ORF de ADN complementario (ADNc) o de marco de lectura abierto (ORF) existentes cortando las secuencias vectoriales ascendentes compartidas adyacentes al extremo 5' de ADNc u ORF utilizando CRISPR/Cas9 junto con ARN guía único (sgRNA), y el segundo paso es insertar un módulo UAS en los plásmidos linealizados de ADNc u ORF utilizando una reacción de un solo paso. CRISPRmass permite la construcción sencilla, rápida, eficiente y rentable de varias bibliotecas de plásmidos. La biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF se puede utilizar para el cribado de ganancia de función en células cultivadas y para construir una biblioteca de UAS-cDNA/ORF transgénico de todo el genoma en Drosophila.

Introducción

El cribado genético imparcial del genoma completo es un enfoque eficaz para identificar los genes implicados en un determinado proceso biológico y dilucidar su mecanismo. Por lo tanto, es ampliamente utilizado en diversos campos de la investigación biológica. Aproximadamente el 60% de los genes de Drosophila se conservan en humanos ^1,2, y ~75% de los genes de enfermedades humanas tienen homólogos en Drosophila³. El cribado genético se divide principalmente en dos tipos: pérdida de función (LOF) y ganancia de función (GOF). Los cribados genéticos de LOF en Drosophila han desempeñado un papel fundamental en la elucidación de los mecanismos que gobiernan casi todos los aspectos de la biología. Sin embargo, la mayoría de los genes de Drosophila no tienen fenotipos LOF obvios⁴ y, por lo tanto, el cribado de GOF es un método importante para estudiar la función de esos genes ^4,5.

El sistema binario GAL4/UAS se usa comúnmente para la expresión génica específica de tejido en Drosophila⁶. En este sistema, el tejido expresa específicamente el activador de transcripción de levadura GAL4 que se une al elemento de respuesta GAL4 (UAS) y, por lo tanto, activa la transcripción de los componentes genéticos posteriores (por ejemplo, ADNc y ORF)⁶. Para realizar cribados de GOF en todo el genoma en Drosophila, necesitamos construir una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF de todo el genoma y, posteriormente, una biblioteca de UAS-cDNA/ORF transgénica en Drosophila.

La construcción de una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF de todo el genoma mediante métodos convencionales a partir de clones de cDNA/ORF disponibles públicamente requiere mucho tiempo y laboriosidad, ya que cada gen requiere diseños individualizados, incluido el diseño y la síntesis de cebadores, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la purificación en gel, la secuenciación, la digestión de restricción, etc. ^7,8. Por lo tanto, la construcción de una biblioteca de plásmidos de este tipo es un paso limitante de la velocidad en la creación de una biblioteca de UAS-cDNA/ORF transgénica de todo el genoma en Drosophila. Recientemente, hemos resuelto con éxito este problema mediante el desarrollo de un método novedoso, el ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass)⁹. El núcleo de CRISPRmass es manipular las secuencias vectoriales compartidas de una biblioteca de plásmidos a través de una combinación de tecnología de edición de genes y tecnología de clonación sin interrupciones.

Aquí, presentamos un protocolo para CRISPRmass, que incluye reacciones de probeta masivamente paralelas de dos pasos seguidas de transformación bacteriana. CRISPRmass es un método sencillo, rápido, eficiente y rentable que, en principio, puede utilizarse para la construcción de alto rendimiento de varias bibliotecas de plásmidos.

Estrategia CRISPRmass
El procedimiento de CRISPRmass comienza con reacciones paralelas de probeta de dos pasos antes de la transformación de Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). El paso 1 es la escisión de las columnas vertebrales vectoriales idénticas de los plásmidos cDNA/ORF por Cas9/sgRNA. Un sitio de escisión ideal es adyacente al extremo 5' del ADNc/ORF. Los productos de escisión no tienen que ser purificados. El paso 2 es la inserción de un módulo UAS específico del vector en los plásmidos linealizados cDNA/ORF Cas9/sgRNA mediante ensamblaje de Gibson (en lo sucesivo, reacción de un solo paso), lo que da como resultado plásmidos UAS-cDNA/ORF. Las secuencias terminales 5' y 3' de un módulo UAS se superponen con las de los plásmidos linealizados cDNA/ORF, lo que permite la reacción en un solo paso.

Los productos de reacción de un solo paso se someten directamente a la transformación de E. coli . Teóricamente, solo las colonias deseadas de UAS-cDNA/ORF pueden crecer en placas Luria-Bertani (LB) que contienen antibióticos de selección correspondientes al gen de resistencia a antibióticos del módulo UAS. El módulo UAS está compuesto por un módulo UAS central, un gen de resistencia a antibióticos distinto del de los plásmidos de ADNc u ORF, y las secuencias terminales 5' y 3'. Un módulo central de UAS consta de 10 copias de UAS, un promotor mínimo Hsp70, una secuencia attB para la integración genómica mediada por phiC31 y un marcador de transformación mini-blanco para Drosophila⁷.

Protocolo

1. Determinación del sitio óptimo de escisión de Cas9/sgRNA aguas arriba del ADNc/ORF

1. Preparación de plásmidos de ADNc u ORF con una columna vertebral vectorial idéntica
   1. Compre clones de ADNc/ORF que estén disponibles en recursos públicos, como la Colección de Oro^10,11 del Centro de Recursos del Genoma de Drosophila (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/), la colección de genes de mamíferos de ratón (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) y la biblioteca de expresión lentiviral humana de CCSB¹². En este protocolo, tomamos como ejemplo los clones de ADNc/ORF basados en vectores pOT2, que están disponibles en la Colección de Oro de la DGRC.
   2. Extraiga el ADN plasmídico utilizando un minikit de preparación de plásmidos. Mida la concentración de plásmidos con un espectrofotómetro.
2. Diseño de sgRNAs
   1. Visite el sitio web de CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Haga clic en el botón Pegar objetivo y luego ingrese la secuencia de ADN de interés. La secuencia de interés es una región de 20-100 pb ubicada en la red troncal del vector pOT2 aguas arriba del extremo cDNA/ORF 5'.
   2. Elige la especie Drosophila melanogaster. Haga clic en el botón Buscar sitios de destino. Elija candidatos de sgRNA con una eficiencia prevista superior al 80 %.
3. Preparación de sgRNAs
   1. Pida Oligós purificados por PAGE, un cebador directo (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′) donde (N)₂₀ es la secuencia diana de un sgRNA, y un sgRNA de andamio reverso cebador sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      NOTA: Se recomienda el uso de oligonucleótidos de alta calidad purificados con PAGE.
   2. Preparar una plantilla de ADN por PCR para la transcripción in vitro (IVT) de sgRNA. Configure una reacción de PCR de 100 μL de la siguiente manera: 5 μL de plantilla pX330 (plásmido Addgene 42230, un regalo de Feng Zhang; 0,1 ng/μL), 5 μL de cebador directo (10 μM), 5 μL de sgRNA-REV (10 μM), 50 μL de 2 mezclas maestras de PCR de alta fidelidad y 35 μL de agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) en un tubo de PCR.
   3. Realice la PCR utilizando las siguientes condiciones de termociclado: 1 ciclo de 98 °C durante 30 s; 5 ciclos de 98 °C durante 10 s, 51 °C durante 10 s, 72 °C durante 5 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 72 °C durante 15 s; 1 ciclo de 72 °C durante 2 min. Incubar las reacciones en un termociclador.
   4. Separe los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Un fragmento de ADN de ~120 pb debería ser visible en el gel bajo rayos UV. Purifique el fragmento de ADN de ~ 120 pb utilizando un kit de extracción en gel. El fragmento de ADN purificado sirve como molde para IVT de sgRNA.
   5. Configure una reacción IVT de 5 μL de la siguiente manera: 165 ng de fragmento de ADN en gel purificado de ~120 pb, 1,65 μL de mezcla de tampón NTP, 0,33 μL de mezcla de ARN polimerasa T7 y agua tratada con DEPC. Incubar las reacciones a 37 °C durante 4 h. Siga las instrucciones del manual de un kit de transcripción in vitro .
   6. Añadir 45 μL de agua tratada con DEPC al producto de reacción IVT. Trate los productos de reacción IVT como ARN y use agua tratada con DEPC como control en blanco. Mida la concentración de sgRNA con un espectrofotómetro. La concentración de sgRNA diluido es de alrededor de 870 ng/μL.
   7. Diluir el producto de reacción IVT a 20 ng/μL con agua tratada con DEPC. Alícuota y almacene el sgRNA directamente a -80 °C.
      NOTA: Después de la reacción IVT, la eliminación de la plantilla de ADN mediante digestión de DNasa no es necesaria para medir la concentración precisa de sgRNA, ya que la cantidad de la plantilla de ADN es inferior al 0,4% de la del sgRNA y la plantilla de ADN no afecta a la reacción CRISPRmass posterior. Por lo tanto, la purificación del sgRNA no es necesaria.
4. Evaluación de sgRNAs
   1. Digiera una columna vertebral del vector pOT2 que contiene un plásmido cDNA/ORF con una enzima de restricción. Separar los fragmentos de ADN resultantes mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Purifica el sustrato de ADN con un kit de extracción en gel.
      NOTA: Un fragmento de ADN resultante que contiene las secuencias de orientación de sgRNA de la columna vertebral del vector pOT2 sirve como sustrato de ADN de Cas9/sgRNAs. Los sitios de escisión de Cas9/sgRNAs están ubicados asimétricamente en el sustrato de ADN y, por lo tanto, la escisión del sustrato de ADN por Cas9/sgRNAs produce dos fragmentos de ADN de diferentes tamaños, lo que los hace más fáciles de distinguir del sustrato de ADN desencajado en la reacción de digestión.
   2. Configure una reacción de escisión de Cas9 de 5 μL de la siguiente manera: 0,2 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,5 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,015 pmol de sustrato de ADN, 0,5 μL de tampón 10x Cas9 y agua tratada con DEPC. Incubar las reacciones a 37 °C durante 1 h.
   3. Separar los productos de escisión mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Cargue el sustrato de ADN intacto como un control negativo para el sustrato de ADN digerido.
      NOTA: Aquí, el sustrato de ADN intacto se refiere al sustrato de ADN que no está sujeto a reacciones de digestión por Cas9 / sgRNA. La escisión del sustrato de ADN por Cas9/sgRNAs produce dos fragmentos de ADN de diferentes tamaños, lo que los hace más fáciles de distinguir del sustrato de ADN desencajado en la reacción de digestión.
   4. Analice los patrones de escisión mediante un sistema de imágenes digitales (Figura 2). Seleccione el sgRNA más eficiente para los siguientes experimentos de CRISPRmass. La Figura 2 muestra que los cuatro sgRNAs exhiben una alta eficiencia de escisión y se pueden usar para CRISPRmass. Seleccione el sgRNA subrayado para experimentos posteriores.
      NOTA: Cuanto menor sea el sustrato de ADN desatado, más eficiente será el sgRNA para la digestión de Cas9/sgRNA del sustrato de ADN.

2. Construcción de un módulo UAS

NOTA: Un módulo UAS comprende un UAS central y alrededor de 20-40 pb de las secuencias terminales de 5' y 3' que se superponen con los extremos de 5' y 3' del sitio de división de la columna vertebral, respectivamente (Figura 1). Las secuencias terminales 5' y 3' del módulo UAS están determinadas por el sitio de escisión de la columna vertebral del vector pOT2.

1. Clone el módulo UAS específico del vector pOT2 en el sitio EcoRI del vector pCR8GW, lo que da como resultado el plásmido pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (Archivo complementario 1). Liberación del módulo UAS específico del vector pOT2 mediante la digestión del plásmido pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 con EcoRI a 37 °C durante 1 h.
2. Separar los productos de escisión mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7%. Purifique el módulo UAS 6178-bp con un kit de extracción de gel. Diluya el módulo UAS a 23 ng/μL para experimentos posteriores. Este fragmento de 6178 pb sirve como módulo UAS para la construcción de plásmidos UAS-cDNA/ORF a partir de clones de cDNA/ORF basados en vectores pOT2.

3. Construcción a gran escala de plásmidos UAS-cDNA/ORF mediante CRISPRmass

NOTA: CRISPRmass está estandarizado como reacciones de probeta masivamente paralelas de dos pasos antes de la transformación de E. coli (Figura 1).

1. Reacción del tubo de ensayo paso 1
   1. Escida las columnas vertebrales vectoriales idénticas de los plásmidos cDNA/ORF por Cas9/sgRNA. Coloque los tubos de 0,2 ml en un bloque de enfriamiento de aluminio sobre hielo y etiquételos cuidadosamente. Prepara la mezcla maestra de la siguiente manera.
      1. Para una sola reacción, agregue 0,16 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,4 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,24 μL de tampón Cas9 10x, 1,2 μL de agua tratada con DEPC. Para las reacciones de N, agregue (N+1) x 0,16 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μL de 20 ng/μL de sgRNA, (N+1) x 0,24 μL de tampón Cas9 10x, (N+1) x 1,2 μL de agua tratada con DEPC.
   2. Vórtice, mezclar bien y girar hacia abajo. Alícuota 2 μL de mezcla maestra a cada tubo. Añadir 0,4 μL de 0,019 μM de plásmido ADNc/ORF a cada tubo. Incubar las reacciones de escisión a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: Diluya cada plásmido a 0,019 μM con agua tratada con DEPC. Si la concentración de un plásmido es inferior a 0,019 μM, agregue ADN plasmídico directamente a la reacción de escisión. Utilice tubos libres de RNasa y agua tratada con DEPC. Realizar estos pasos a gran escala llevará varias horas. A menos que se especifique lo contrario, mantenga los reactivos y las reacciones en hielo.
2. Reacción del tubo de ensayo paso 2
   1. Inserte un módulo UAS específico del vector del paso 2 en los plásmidos cDNA/ORF linealizados Cas9 mediante un ensamblaje de reacción de un solo paso. Configure una reacción de un solo paso de 1,4 μL para cada muestra. Coloque los tubos de 0,2 ml en un bloque de enfriamiento de aluminio sobre hielo y etiquete los tubos con cuidado.
      1. Prepara la mezcla maestra de la siguiente manera. Para una sola reacción, agregue 0,07 μL de módulo UAS de 0,006 μM y 0,7 μL de mezcla maestra de ensamblaje de reacción de un solo paso. Para N reacciones, agregue (N+1) x 0,07 μL de módulo UAS de 0,006 μM y (N+1) x 0,7 μL de mezcla maestra de ensamblaje de reacción de un solo paso.
   2. Vórtice, mezclar bien y girar hacia abajo. Alícuota 0,77 μL de la mezcla maestra a cada tubo. Añada 0,7 μL de plásmido ADNc/ORF linealizado Cas9 a cada tubo. Reacciones de incubación a 50 °C durante 1 h.
      NOTA: No es necesaria la purificación de los productos de reacción de ensamblaje de un solo paso. Realizar estos pasos a gran escala lleva varias horas. A menos que se especifique lo contrario, mantenga los reactivos y las reacciones en hielo.
3. Transforme los productos de reacción de ensamblaje de un solo paso en E. coli a gran escala.
   1. Preenfriar 10 μL de puntas a 4 °C. Enfríe previamente tubos de 1,5 ml en un bloque de enfriamiento de aluminio sobre hielo.
   2. Descongele las células competentes de E. coli en hielo durante 5 min. Alícuota de 10 μL de células competentes a cada tubo preenfriado de 1,5 mL.
      NOTA: Utilice células de E. coli competentes disponibles en el mercado con una eficiencia de transformación de al menos 1 x 10⁸ UFC/μg de ADN pUC19.
   3. Agregue 1 μL de producto de reacción de ensamblaje de un solo paso a 10 μL de celdas competentes, revuelva suavemente para mezclar y colóquelo en hielo durante 30 minutos.
   4. Incubar los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 1 min, y luego enfriar inmediatamente en hielo durante 2 min.
   5. Añadir 100 μL de medio SOC (precalentado a 37 °C) en cada tubo a temperatura ambiente e incubar en una incubadora agitadora (250 rpm) a 37 °C durante 1 h.
   6. Calentar hasta 37 °C las placas LB que contienen un antibiótico correspondiente al gen de resistencia a antibióticos del módulo UAS. Extienda las células en las placas e incube a 37 °C durante la noche.
      NOTA: Realizar estos pasos a gran escala lleva varias horas. A menos que se especifique lo contrario, mantenga los reactivos y las reacciones en hielo.
4. Verificación de plásmidos UAS-cDNA/ORF construidos por CRISPRmass
   1. Elegir una sola colonia e inocularla en 4,5 mL de medio líquido LB suplementado con la selección adecuada de antibióticos correspondientes al gen de resistencia a antibióticos del módulo UAS. Incubar durante la noche a 37 °C mientras se agita a 250 rpm.
   2. Extraiga el ADN plasmídico mediante el uso de un minikit de preparación de plásmidos. Configure una reacción de digestión de restricción de 20 μL de la siguiente manera: 300-500 ng/μL de plásmido, enzima(s) de restricción adecuada(s), tampón de digestión de restricción y agua ultrapura. Incubar las reacciones a 37 °C durante 1 h.
   3. Separar los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y analizarlos mediante un sistema de imagen digital (Figura 3).

Resultados

Aplicamos CRISPRmass para generar una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF de todo el genoma utilizando 3402 clones de cDNA/ORF con la columna vertebral del vector pOT2 de la DGRC Gold Collection. Analizamos aleatoriamente solo una colonia para cada constructo UAS-cDNA/ORF, y el posterior análisis de restricción con PstI indicó que el 98,6% de los constructos UAS-cDNA/ORF se crearon con éxito⁹. La justificación del uso de PstI para el análisis de restricción de construcciones UAS-cDNA/ORF ...

Discusión

Los pasos más críticos de CRISPRmass son el diseño de sgRNAs y la evaluación de sgRNAs. La selección de sgRNAs altamente eficientes para Cas9 es clave para el éxito de CRISPRmass. Si se observan muy pocas o ninguna colonia en la mayoría de las placas LB que contienen antibióticos después de la transformación de E. coli con productos de ensamblaje de reacción de un solo paso, verifique la digestión de plásmidos mediante electroforesis en gel de agarosa. Si los plásmidos no se digieren bien, compruebe la acti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA