Модульная сборка на основе CRISPR для высокопроизводительного построения библиотеки плазмид UAS-cDNA/ORF

Резюме

Представлен протокол модульной сборки на основе CRISPR (CRISPRmass) — метода высокопроизводительного построения библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF у дрозофил с использованием общедоступных ресурсов кДНК/ORF. CRISPRmass может быть применен для редактирования различных библиотек плазмид.

Аннотация

Функциональный геномный скрининг предлагает мощный подход к исследованию функции генов и опирается на создание полногеномных библиотек плазмид. Традиционные подходы к построению библиотек плазмид являются трудоемкими и трудоемкими. Поэтому недавно мы разработали простой и эффективный метод, модульную сборку на основе CRISPR (CRISPRmass), для высокопроизводительного конструирования всей геномной библиотеки плазмид, активирующей последовательность, комплементарную ДНК/открытую рамку считывания (UAS-cDNA/ORF). Здесь мы представляем протокол для CRISPRmass, взяв в качестве примера построение библиотеки плазмид UAS-cDNA/ORF на основе GAL4/UAS. Протокол включает в себя массово параллельные двухступенчатые реакции в пробирке с последующей бактериальной трансформацией. Первым шагом является линеаризация существующей комплементарной ДНК (кДНК) или открытой рамки считывания (ORF) кДНК или библиотечных плазмид ORF путем разрезания общих восходящих векторных последовательностей, прилегающих к 5'-концу кДНК или ORF, с использованием CRISPR/Cas9 вместе с одной направляющей РНК (sgRNA), а вторым шагом является вставка модуля UAS в линеаризованные кДНК или ORF плазмиды с использованием одноступенчатой реакции. CRISPRmass позволяет просто, быстро, эффективно и экономично конструировать различные библиотеки плазмид. Библиотека плазмид UAS-кДНК/ORF может быть использована для скрининга усиления функции в культивируемых клетках и для создания полногеномной трансгенной библиотеки UAS-кДНК/ORF у дрозофил.

Введение

Непредвзятый полногеномный генетический скрининг является мощным подходом к идентификации генов, участвующих в данном биологическом процессе, и выяснению его механизма. Поэтому он широко используется в различных областях биологических исследований. Примерно 60% генов дрозофилы консервативны у человека ^1,2, а ~75% генов болезней человека имеют гомологи у дрозофилы³. Генетический скрининг в основном делится на два типа: потеря функции (LOF) и приобретение функции (GOF). Генетический скрининг LOF у дрозофил сыграл решающую роль в выяснении механизмов, которые упр....

протокол

1. Определение оптимального сайта расщепления Cas9/sgРНК до кДНК/ORF

1. Получение кДНК или ORF плазмид с идентичным векторным каркасом
   1. Приобретайте клоны кДНК/ORF, доступные в общедоступных ресурсах, таких как Ресурсный центр генома дрозофилы (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, коллекция генов млекопитающих мышей (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) и широкая библиотека экспрессии лентивирусов человека^{CCSB 12}. В этом протоколе мы берем в качестве примера клоны кДНК/ORF на основе вектора pOT2, которые доступны в к....

Результаты

Мы применили CRISPRmass для создания полногеномной библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF с использованием 3402 клонов кДНК/ORF, несущих векторную основу pOT2 из золотой коллекции DGRC. Мы случайным образом проанализировали только одну колонию для каждой конструкции UAS-кДНК/ORF, и последующий рестрикционный ?.......

Обсуждение

Наиболее важными этапами CRISPRmass являются дизайн sgRNA и оценка sgRNAs. Выбор высокоэффективных sgРНК для Cas9 является ключом к успеху CRISPRmass. Если после трансформации E. coli с одноступенчатыми продуктами сборки реакции на большинстве антибиотиксодержащих LB-планшетов наблюдается очень мало коло?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA