JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен протокол модульной сборки на основе CRISPR (CRISPRmass) — метода высокопроизводительного построения библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF у дрозофил с использованием общедоступных ресурсов кДНК/ORF. CRISPRmass может быть применен для редактирования различных библиотек плазмид.

Аннотация

Функциональный геномный скрининг предлагает мощный подход к исследованию функции генов и опирается на создание полногеномных библиотек плазмид. Традиционные подходы к построению библиотек плазмид являются трудоемкими и трудоемкими. Поэтому недавно мы разработали простой и эффективный метод, модульную сборку на основе CRISPR (CRISPRmass), для высокопроизводительного конструирования всей геномной библиотеки плазмид, активирующей последовательность, комплементарную ДНК/открытую рамку считывания (UAS-cDNA/ORF). Здесь мы представляем протокол для CRISPRmass, взяв в качестве примера построение библиотеки плазмид UAS-cDNA/ORF на основе GAL4/UAS. Протокол включает в себя массово параллельные двухступенчатые реакции в пробирке с последующей бактериальной трансформацией. Первым шагом является линеаризация существующей комплементарной ДНК (кДНК) или открытой рамки считывания (ORF) кДНК или библиотечных плазмид ORF путем разрезания общих восходящих векторных последовательностей, прилегающих к 5'-концу кДНК или ORF, с использованием CRISPR/Cas9 вместе с одной направляющей РНК (sgRNA), а вторым шагом является вставка модуля UAS в линеаризованные кДНК или ORF плазмиды с использованием одноступенчатой реакции. CRISPRmass позволяет просто, быстро, эффективно и экономично конструировать различные библиотеки плазмид. Библиотека плазмид UAS-кДНК/ORF может быть использована для скрининга усиления функции в культивируемых клетках и для создания полногеномной трансгенной библиотеки UAS-кДНК/ORF у дрозофил.

Введение

Непредвзятый полногеномный генетический скрининг является мощным подходом к идентификации генов, участвующих в данном биологическом процессе, и выяснению его механизма. Поэтому он широко используется в различных областях биологических исследований. Примерно 60% генов дрозофилы консервативны у человека 1,2, а ~75% генов болезней человека имеют гомологи у дрозофилы3. Генетический скрининг в основном делится на два типа: потеря функции (LOF) и приобретение функции (GOF). Генетический скрининг LOF у дрозофил сыграл решающую роль в выяснении механизмов, которые управляют почти каждым аспектом биологии. Тем не менее, большинство генов дрозофилы не имеют явного фенотипа LOF4, и поэтому скрининг GOF является важным методом изучения функции этих генов 4,5.

Бинарная система GAL4/UAS обычно используется для тканевой специфической экспрессии генов у дрозофилы 6. В этой системе ткань специфически экспрессирует активатор транскрипции дрожжей GAL4, который связывается с чувствительным к GAL4 элементом (UAS) и тем самым активирует транскрипцию нижестоящих генетических компонентов (например, кДНК и ORF)6. Для проведения полногеномного скрининга GOF у дрозофил нам необходимо создать полногеномную библиотеку плазмид UAS-кДНК/ORF и, впоследствии, трансгенную библиотеку UAS-кДНК/ORF у дрозофилы.

Создание полногеномной библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF традиционными методами из общедоступных клонов кДНК/ORF является трудоемким и трудоемким процессом, так как каждый ген требует индивидуального дизайна, включая дизайн и синтез праймеров, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и очистку геля, секвенирование, рестрикционное расщепление и т.д. 7,8. Таким образом, построение такой плазмидной библиотеки является ограничивающим шагом в создании полногеномной трансгенной библиотеки UAS-cDNA/ORF у дрозофилы. Недавно мы успешно решили эту проблему, разработав новый метод модульной сборки на основе CRISPR (CRISPRmass)9. Суть CRISPRmass заключается в манипулировании общими векторными последовательностями библиотеки плазмид с помощью комбинации технологии редактирования генов и технологии бесшовного клонирования.

Здесь мы представляем протокол для CRISPRmass, который включает в себя массивно параллельные двухступенчатые реакции в пробирке с последующей бактериальной трансформацией. CRISPRmass — это простой, быстрый, эффективный и экономичный метод, который, в принципе, может быть использован для высокопроизводительного конструирования различных плазмидных библиотек.

Стратегия CRISPRmass
Процедура CRISPRmass начинается с параллельных двухступенчатых реакций в пробирке до превращения Escherichia coli (E. coli) (рис. 1). Шаг 1 заключается в расщеплении идентичных векторных остов кДНК/ORF плазмид Cas9/sgRNA. Идеальный сайт расщепления примыкает к 5'-концу кДНК/ЧОР. Продукты расщепления не нуждаются в очистке. На этапе 2 происходит вставка вектор-специфичного модуля UAS в линеаризованные кДНК/ORF плазмиды Cas9/sgRNA путем сборки Gibson (далее – одноступенчатая реакция), в результате чего образуются UAS-кДНК/ORF плазмиды. 5'- и 3'-концевые последовательности модуля UAS перекрываются с последовательностями линеаризованных плазмид кДНК/ORF, что позволяет проводить одноступенчатую реакцию.

Одноступенчатые продукты реакции непосредственно подвергаются превращению E. coli . Теоретически только желаемые колонии UAS-кДНК/ORF могут расти на пластинах Лурии-Бертани (LB), которые содержат селекционные антибиотики, соответствующие гену устойчивости к антибиотикам модуля UAS. Модуль UAS состоит из ядра модуля UAS, гена устойчивости к антибиотикам, отличного от гена кДНК или плазмид ORF, а также 5'- и 3'-концевых последовательностей. Основной модуль UAS включает в себя 10 копий UAS, минимальный промотор Hsp70, последовательность attB для геномной интеграции, опосредованной phiC31, и маркер трансформации мини-белого для Drosophila7.

протокол

1. Определение оптимального сайта расщепления Cas9/sgРНК до кДНК/ORF

  1. Получение кДНК или ORF плазмид с идентичным векторным каркасом
    1. Приобретайте клоны кДНК/ORF, доступные в общедоступных ресурсах, таких как Ресурсный центр генома дрозофилы (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, коллекция генов млекопитающих мышей (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) и широкая библиотека экспрессии лентивирусов человекаCCSB 12. В этом протоколе мы берем в качестве примера клоны кДНК/ORF на основе вектора pOT2, которые доступны в коллекции DGRC Gold.
    2. Извлеките плазмидную ДНК с помощью мини-набора для подготовки плазмид. Измерьте концентрацию плазмид с помощью спектрофотометра.
  2. Дизайн sgRNA
    1. Посетите веб-сайт CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Нажмите кнопку «Вставить цель », а затем введите интересующую последовательность ДНК. Представляющая интерес последовательность представляет собой область массой 20-100.о., расположенную в векторной магистрали pOT2 выше конца кДНК/ORF 5'.
    2. Выберите вид Drosophila melanogaster. Нажмите кнопку «Найти целевые сайты». Выбирайте кандидатов на sgRNA с прогнозируемой эффективностью выше 80%.
  3. Получение sgРНК
    1. Заказать PAGE-очищенные олигопласты, прямой праймер (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3'), где (N)20 — последовательность-мишень sgРНК, а sgRNA — обратный праймер, sgRNA-REV (5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать высококачественные олигонуклеотиды, очищенные от PAGE.
    2. Подготовьте матрицу ДНК методом ПЦР для транскрипции in vitro (IVT) sgRNA. Настройте ПЦР-реакцию объемом 100 мкл следующим образом: 5 мкл матрицы pX330 (плазмида Addgene 42230, подарок от Фэн Чжана; 0,1 нг/мкл), 5 мкл прямого праймера (10 мкМ), 5 мкл sgRNA-REV (10 мкМ), 50 мкл 2x мастер-смеси для ПЦР высокой точности и 35 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), в пробирке для ПЦР.
    3. Проводят ПЦР с использованием следующих условий термоциклирования: 1 цикл 98 °C в течение 30 с; 5 циклов при температуре 98 °C в течение 10 с, 51 °C в течение 10 с, 72 °C в течение 5 с; 30 циклов при температуре 98 °C в течение 10 с, 72 °C в течение 15 с; 1 цикл 72 °C в течение 2 мин. Инкубируйте реакции в термическом амплификаторе.
    4. Разделяют продукты ПЦР с помощью электрофореза 0,8% агарозного геля. Фрагмент ДНК ~120.н. должен быть виден на геле под воздействием ультрафиолета. Очистите фрагмент ДНК ~120.о. с помощью набора для экстракции геля. Очищенный фрагмент ДНК служит матрицей для ИВТ гРНК.
    5. Настройте реакцию 5 мкл IVT следующим образом: 165 нг ~120-.н. очищенного фрагмента ДНК в геле, 1,65 мкл буферной смеси NTP, 0,33 мкл смеси РНК-полимеразы T7 и вода, обработанная DEPC. Инкубируйте реакции при 37 °C в течение 4 ч. Следуйте инструкциям по эксплуатации набора для транскрипции in vitro .
    6. Добавьте 45 μл воды, обработанной DEPC, в продукт реакции IVT. Обрабатывайте продукты реакции IVT как РНК и используйте воду, обработанную DEPC, в качестве холостого контроля. Измерьте концентрацию sgРНК с помощью спектрофотометра. Концентрация разведенной sgРНК составляет около 870 нг/мкл.
    7. Разбавьте продукт реакции IVT до 20 нг/мкл водой, обработанной DEPC. Аликвотируйте и храните sgRNA непосредственно при -80 °C.
      Примечание: После реакции IVT удаление матрицы ДНК путем расщепления ДНКазы не является необходимым для измерения точной концентрации sgRNA, поскольку количество матрицы ДНК составляет менее 0,4% от количества sgRNA, и матрица ДНК не влияет на последующую реакцию CRISPRmass. Поэтому в очистке sgRNA нет необходимости.
  4. Оценка sgРНК
    1. Расщеплять плазмиду кДНК/ОРФ, несущую векторный остов pOT2, с помощью фермента рестрикции. Разделить полученные фрагменты ДНК на 0,8% с помощью электрофореза в агарозном геле. Очистите субстрат ДНК с помощью набора для экстракции геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный фрагмент ДНК, содержащий последовательности, нацеленные на sgРНК каркаса вектора pOT2, служит субстратом ДНК Cas9/sgРНК. Сайты расщепления Cas9/sgРНК расположены асимметрично в субстрате ДНК, и, таким образом, расщепление субстрата ДНК Cas9/sgРНК дает два фрагмента ДНК разного размера, что облегчает их отличить от разрозненного субстрата ДНК в реакции расщепления.
    2. Организуйте реакцию расщепления Cas9 объемом 5 мкл следующим образом: 0,2 мкл 1,22 мкл S. pyogenes Cas9, 0,5 мкл 20 нг/мкл sgРНК, 0,015 пмоль субстрата ДНК, 0,5 мкл 10-кратного буфера Cas9 и вода, обработанная DEPC. Инкубируйте реакции при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Отделите продукты расщепления на 0,8% от электрофореза в агарозном геле. Загрузите интактный субстрат ДНК в качестве отрицательного контроля для расщепленного субстрата ДНК.
      Примечание: В данном случае интактный субстрат ДНК относится к субстрату ДНК, который не подвергается реакциям переваривания Cas9/sgРНК. Расщепление субстрата ДНК Cas9/sgРНК дает два фрагмента ДНК разного размера, что облегчает их отличие от разрозненного субстрата ДНК в реакции пищеварения.
    4. Анализ узоров спайности с помощью цифровой системы обработки изображений (рис. 2). Выберите наиболее эффективную sgRNA для последующих экспериментов CRISPRmass. На рисунке 2 показано, что все четыре sgРНК демонстрируют высокую эффективность расщепления и могут быть использованы для CRISPRmass. Выберите подчеркнутую sgРНК для последующих экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем меньше неиспользованного субстрата ДНК, тем эффективнее sgRNA для переваривания Cas9/sgRNA субстрата ДНК.

2. Построение модуля БАС

Примечание: Модуль БАС содержит ядро БАС и около 20-40.о. 5'- и 3'-концевых последовательностей, перекрывающихся с 5'- и 3'-концами сайта расщепления основной цепи, соответственно (рис. 1). 5'- и 3'-концевые последовательности модуля UAS определяются по сайту расщепления основной цепи вектора pOT2.

  1. Клонируйте векторно-специфичный модуль UAS pOT2 в сайт EcoRI вектора pCR8GW, в результате чего получится плазмида pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (Дополнительный файл 1). Высвобождение векторно-специфичного модуля UAS pOT2 путем расщепления плазмиды pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 с EcoRI при 37 °C в течение 1 ч.
  2. Отделите продукты расщепления на 0,7% электрофорезом в агарозном геле. Очистите модуль БАС 6178-bp с помощью набора для экстракции геля. Разбавьте модуль БАС до 23 нг/мкл для последующих экспериментов. Этот фрагмент 6178-bp служит модулем UAS для конструирования плазмид UAS-кДНК/ORF из клонов кДНК/ORF на основе вектора pOT2.

3. Широкомасштабное конструирование плазмид UAS-кДНК/ORF методом CRISPRmass

ПРИМЕЧАНИЕ: CRISPRmass стандартизирован как массивно-параллельные двухступенчатые реакции в пробирке перед превращением E. coli (Рисунок 1).

  1. Реакция в пробирке шаг 1
    1. Расщепление идентичных векторных остов кДНК/ORF плазмид с помощью Cas9/sgRNA. Разложите пробирки объемом 0,2 мл в алюминиевом охлаждающем блоке на льду и тщательно промаркируйте пробирки. Готовьте мастер-смесь следующим образом.
      1. Для одной реакции добавьте 0,16 мкл 1,22 мкМ S. pyogenes Cas9, 0,4 мкл 20 нг/мкл sgРНК, 0,24 мкл 10x Cas9-буфера, 1,2 мкл воды, обработанной DEPC. Для N-реакций добавьте (N+1) x 0,16 мкл 1,22 мкМ S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 мкл 20 нг/мкл sgRNA, (N+1) x 0,24 мкл 10-кратного буфера Cas9, (N+1) x 1,2 мкл воды, обработанной DEPC.
    2. Вортекс, хорошо перемешайте и раскрутите вниз. Аликвотируйте 2 мкл мастер-смеси на каждую пробирку. Добавьте 0,4 мкл 0,019 мкМ кДНК/ОРФ плазмиды в каждую пробирку. Инкубируйте реакции расщепления при 37 °C в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте каждую плазмиду до 0,019 μМ водой, обработанной DEPC. Если концентрация плазмиды ниже 0,019 мкМ, добавьте плазмидную ДНК непосредственно в реакцию расщепления. Используйте пробирки без РНКазы и воду, обработанную DEPC. Выполнение этих действий в больших масштабах займет несколько часов. Если не указано иное, храните реагенты и реакции на льду.
  2. Реакция в пробирке шаг 2
    1. Вставьте векторно-специфичный модуль UAS из шага 2 в линеаризованные Cas9-линеаризованные кДНК/ORF плазмиды путем одноступенчатой реакционной сборки. Настройте одноступенчатую реакцию объемом 1,4 мкл для каждого образца. Разложите пробирки объемом 0,2 мл в алюминиевом охлаждающем блоке на льду и тщательно промаркируйте пробирки.
      1. Готовьте мастер-смесь следующим образом. Для одной реакции добавьте 0,07 мкл 0,006 мкМ модуля UAS и 0,7 мкл мастер-смеси для одноступенчатой реакционной сборки. Для N реакций добавьте (N+1) x 0,07 мкл модуля UAS размером 0,006 мкМ и (N+1) x 0,7 мкл мастер-смеси для одноступенчатой реакционной сборки.
    2. Вортекс, хорошо перемешайте и раскрутите вниз. Аликвотируйте 0,77 мкл мастер-смеси на каждую пробирку. Добавьте 0,7 мкл Cas9-линеаризованной кДНК/ORF плазмиды в каждую пробирку. Инкубируйте реакции при 50 °C в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка одноступенчатых продуктов реакции сборки не требуется. Выполнение этих действий в больших масштабах занимает несколько часов. Если не указано иное, храните реагенты и реакции на льду.
  3. Преобразуйте продукты реакции одноступенчатой сборки в E. coli в больших масштабах.
    1. Предварительно охладите наконечники 10 μL при 4 °C. Предварительно охладите пробирки объемом 1,5 мл в алюминиевом охлаждающем блоке на льду.
    2. Разморозьте компетентные клетки кишечной палочки на льду в течение 5 минут. Аликвотировать 10 мкл компетентных клеток на каждую предварительно охлажденную 1,5 мл пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коммерчески доступные компетентные клетки E. coli с эффективностью трансформации не менее 1 x 108 КОЕ/мкг ДНК pUC19.
    3. Добавьте 1 мкл одноступенчатого продукта реакции сборки в 10 мкл компетентных клеток, аккуратно перемешайте и положите на лед на 30 минут.
    4. Инкубируйте трубки на водяной бане при температуре 42 °C в течение 1 минуты, а затем сразу охладите на льду в течение 2 минут.
    5. Добавьте 100 мкл среды SOC (предварительно подогретой до 37 °C) в каждую пробирку при комнатной температуре и инкубируйте в встряхивающем инкубаторе (250 об/мин) при 37 °C в течение 1 ч.
    6. Нагрейте до 37 °C планшеты LB, содержащие антибиотик, соответствующий гену устойчивости к антибиотикам модуля БАС. Распределите клетки по планшетам и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение этих шагов в больших масштабах занимает несколько часов. Если не указано иное, храните реагенты и реакции на льду.
  4. Верификация плазмид UAS-кДНК/ORF, сконструированных с помощью CRISPRmass
    1. Выберите одну колонию и инокулируйте ее в 4,5 мл жидкой среды LB с добавлением соответствующего набора антибиотиков, соответствующих гену устойчивости к антибиотикам модуля UAS. Инкубировать в течение ночи при 37 °C и встряхивать при 250 об/мин.
    2. Извлеките плазмидную ДНК с помощью мини-набора для подготовки плазмид. Настройте реакцию рестрикционного сбраживания объемом 20 мкл следующим образом: 300-500 нг/мкл плазмиды, соответствующий фермент(ы) рестрикции, буфер для рестрикционного сбраживания и сверхчистая вода. Инкубируйте реакции при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Отделить фрагменты ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле на 0,8% и проанализировать с помощью цифровой системы визуализации (рис. 3).

Результаты

Мы применили CRISPRmass для создания полногеномной библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF с использованием 3402 клонов кДНК/ORF, несущих векторную основу pOT2 из золотой коллекции DGRC. Мы случайным образом проанализировали только одну колонию для каждой конструкции UAS-кДНК/ORF, и последующий рестрикционный ?...

Обсуждение

Наиболее важными этапами CRISPRmass являются дизайн sgRNA и оценка sgRNAs. Выбор высокоэффективных sgРНК для Cas9 является ключом к успеху CRISPRmass. Если после трансформации E. coli с одноступенчатыми продуктами сборки реакции на большинстве антибиотиксодержащих LB-планшетов наблюдается очень мало коло?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была спонсирована Национальным фондом естественных наук Китая (32071135 и 31471010), Шанхайской программой Пуцзян (14PJ1405900) и Фондом естественных наук Шанхая (19ZR1446400).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum Cooling BlockAikbbioADMK-0296To perform bacterial transformation
DEPC-Treated WaterInvitrogenAM9906
Gel Extraction KitOmegaD2500To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging SystemTanon2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis KitNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621
Plasmid Mini KitOmegaD6943To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Shaking IncubatorShanghai Zhichu ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal CyclerLongGeneT20To perform PCR 
Trans10 Chemically Competent CellTranGen BioTechCD101
Ultraviolet spectrophotometerShimadzuBioSpec-nanoTo measure concentration of DNA or RNA

Ссылки

  1. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  2. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  3. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  4. Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  7. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  8. Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
  9. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  10. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
  11. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
  12. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

CRISPRUASCDNAORF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены