基于CRISPR的模块化组装用于UAS-cDNA/ORF质粒文库的高通量构建

摘要

我们提出了一种基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass）方案，这是一种使用公开可用的cDNA/ORF资源在 果蝇 中高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒库的方法。CRISPRmass可用于编辑各种质粒文库。

摘要

功能基因组学筛选为探测基因功能提供了一种强大的方法，并依赖于全基因组质粒库的构建。传统的质粒文库构建方法既费时又费力。因此，我们最近开发了一种简单高效的方法，即基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass），用于高通量构建全基因组上游激活序列互补DNA/开放阅读框（UAS-cDNA/ORF）质粒库。在这里，我们提出了一种CRISPRmass的方案，以构建基于GAL4 / UAS的UAS-cDNA / ORF质粒库为例。该方案包括大规模平行的两步试管反应，然后是细菌转化。第一步是使用 CRISPR/Cas9 和单向导 RNA （sgRNA） 切割与 cDNA 或 ORF 的 5' 端相邻的共享上游载体序列，对现有的互补 DNA （cDNA） 或开放阅读框 （ORF） cDNA 或 ORF 文库质粒进行线性化，第二步是使用一步反应将 UAS 模块插入线性化的 cDNA 或 ORF 质粒中。CRISPRmass可以简单、快速、高效且经济高效地构建各种质粒文库。UAS-cDNA/ORF 质粒文库可用于培养细胞中的功能获得性筛选，以及在 果蝇中构建全基因组转基因 UAS-cDNA/ORF 文库。

引言

无偏倚的全基因组基因筛选是识别参与特定生物过程的基因并阐明其机制的有力方法。因此，它在生物学研究的各个领域都有广泛的应用。大约 60% 的果蝇基因在人类 ^1,2 中是保守的，而 ~75% 的人类疾病基因在果蝇³ 中具有同源物。基因筛查主要分为功能丧失（LOF）和功能获得（GOF）两种类型。果蝇中的LOF遗传筛选在阐明控制生物学几乎每个方面的机制方面发挥了关键作用。然而，大多数果蝇基因没有明显的LOF表型⁴，因此，GOF筛选是研究这些基因功能的重要方法^4,5。

二元 GAL4/UAS 系统通常用于 果蝇⁶ 中的组织特异性基因表达。在该系统中，组织特异性表达酵母转录激活因子 GAL4，该激活因子与 GAL4 反应元件 （UAS） 结合，从而激活下游遗传成分（例如 cDNA 和 ORF）⁶ 的转录。为了在 果蝇中进行全基因组GOF筛选，我们需要构建全基因组....

研究方案

1. cDNA/ORF上游最佳Cas9/sgRNA切割位点的测定

1. 具有相同载体骨架的cDNA或ORF质粒的制备
   1. 购买公共资源中可用的cDNA/ORF克隆，例如果蝇基因组资源中心（DGRC，https://dgrc.bio.indiana.edu/）Gold Collection^10,11，小鼠哺乳动物基因集合（MGC，https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/）和人类CCSB广小病毒表达文库¹²。在该协议中，我们以基于pOT2载体的cDNA / ORF克隆为例，该克隆在DGRC Gold Collection中可用。
   2. 使用质粒小量制备试剂盒提取质粒 DNA。用分光光度计测量质粒的浓度。
2. sgRNA的设计
   1. 访问 CHOPCHOP 网站 （https://chopchop.cbu.uib.no/）。单击“粘贴目标” 按钮，然后输入感兴趣的 DNA 序列。目标序列是位于 cDNA/ORF 5' 末端上游的 pOT2 载体骨架中的 20-100 bp 区域。
   2. 选择物种 果蝇 melanogaster。单....

讨论

CRISPRmass最关键的步骤是sgRNA的设计和sgRNA的评估。为 Cas9 选择高效的 sgRNA 是 CRISPRmass 成功的关键。如果在用单步反应组装产物转化大肠杆菌后，在大多数含抗生素的LB平板上观察到很少或没有菌落，则通过琼脂糖凝胶电泳检查质粒消化。如果质粒未得到良好消化，则检查Cas9活性、sgRNA降解和质粒质量;如果质粒消化良好，则检查单步反应组装试剂，并确保感受态细胞的转化效率至少为 1 x 10⁸.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA