Assemblage modulaire basé sur CRISPR pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-cDNA/ORF

Résumé

Nous présentons un protocole d’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass), une méthode pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-ADNc/ORF chez la drosophile en utilisant des ressources d’ADNc/ORF accessibles au public. CRISPRmass peut être appliqué à l’édition de diverses banques de plasmides.

Résumé

Le criblage en génomique fonctionnelle offre une approche puissante pour sonder la fonction des gènes et repose sur la construction de bibliothèques de plasmides à l’échelle du génome. Les approches conventionnelles pour la construction de bibliothèques de plasmides prennent du temps et sont laborieuses. Par conséquent, nous avons récemment développé une méthode simple et efficace, l’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass), pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-cDNA/ORF (séquence d’activation en amont à l’échelle du génome). Ici, nous présentons un protocole pour CRISPRmass, en prenant comme exemple la construction d’une bibliothèque de plasmides UAS-ADNc/ORF basée sur GAL4/UAS. Le protocole comprend des réactions massivement parallèles en deux étapes en éprouvette, suivies d’une transformation bactérienne. La première étape consiste à linéariser les plasmides d’ADN cDNA ou de banque ORF (ADNc) complémentaire (ADNc) ou ORF existants en coupant les séquences vectorielles partagées en amont adjacentes à l’extrémité 5' des ADNc ou des ORF à l’aide de CRISPR/Cas9 avec un ARN guide unique (sgRNA), et la deuxième étape consiste à insérer un module UAS dans les plasmides d’ADNc ou ORF linéarisés en utilisant une réaction en une seule étape. CRISPRmass permet la construction simple, rapide, efficace et rentable de diverses banques de plasmides. La banque de plasmides UAS-cDNA/ORF peut être utilisée pour le criblage du gain de fonction dans les cellules en culture et pour la construction d’une banque transgénique UAS-cDNA/ORF à l’échelle du génome chez la drosophile.

Introduction

Le dépistage génétique impartial du génome entier est une approche puissante pour identifier les gènes impliqués dans un processus biologique donné et élucider son mécanisme. Par conséquent, il est largement utilisé dans divers domaines de la recherche biologique. Environ 60% des gènes de la drosophile sont conservés chez l’homme ^1,2, et ~75% des gènes de la maladie humaine ont des homologues chez la drosophile³. Le dépistage génétique est principalement divisé en deux types : la perte de fonction (LOF) et le gain de fonction (GOF). Les criblages génétiques LOF chez la drosophile ont joué un rôle essentiel dans l’élucidation des mécanismes qui régissent presque tous les aspects de la biologie. Cependant, la majorité des gènes de la drosophile n’ont pas de phénotypes LOF⁴ évidents, et par conséquent, le dépistage GOF est une méthode importante pour étudier la fonction de ces gènes ^4,5.

Le système binaire GAL4/UAS est couramment utilisé pour l’expression génique spécifique des tissus chez la drosophile⁶. Dans ce système, le tissu exprime spécifiquement l’activateur de transcription de la levure GAL4 qui se lie à l’élément sensible à GAL4 (UAS) et active ainsi la transcription des composants génétiques en aval (par exemple, l’ADNc et l’ORF)⁶. Pour effectuer des criblages GOF à l’échelle du génome chez la drosophile, nous devons construire une banque de plasmides UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome et, par la suite, une banque transgénique UAS-ADNc/ORF chez la drosophile.

La construction d’une banque de plasmides UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome par des méthodes conventionnelles à partir de clones d’ADNc/ORF accessibles au public prend du temps et est laborieuse, car chaque gène nécessite des conceptions individualisées, y compris la conception et la synthèse d’amorces, la réaction en chaîne par polymérase (PCR), la purification du gel, le séquençage, la digestion par restriction^{, etc. 7,8}. Par conséquent, la construction d’une telle banque de plasmides est une étape limitant le débit dans la création d’une banque transgénique UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome chez la drosophile. Récemment, nous avons réussi à résoudre ce problème en développant une nouvelle méthode, l’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass)⁹. L’essentiel de CRISPRmass consiste à manipuler les séquences de vecteurs partagés d’une bibliothèque de plasmides grâce à une combinaison de technologie d’édition de gènes et de technologie de clonage sans couture.

Ici, nous présentons un protocole pour CRISPRmass, qui comprend des réactions massivement parallèles en tube à essai en deux étapes suivies d’une transformation bactérienne. CRISPRmass est une méthode simple, rapide, efficace et rentable qui, en principe, peut être utilisée pour la construction à haut débit de diverses banques de plasmides.

Stratégie CRISPRmass
La procédure de CRISPRmass commence par des réactions parallèles en tube à essai en deux étapes avant la transformation d’Escherichia coli (E. coli) (Figure 1). L’étape 1 est le clivage des squelettes vectoriels identiques des plasmides ADNc/ORF par Cas9/sgRNA. Un site de clivage idéal est adjacent à l’extrémité 5' de l’ADNc/ORF. Les produits de décolleté n’ont pas besoin d’être purifiés. L’étape 2 consiste à insérer un module UAS spécifique du vecteur dans les plasmides ADNc/ORF linéarisés Cas9/sgRNA par assemblage de Gibson (ci-après appelé réaction en une seule étape), ce qui permet d’obtenir des plasmides UAS-ADNc/ORF. Les séquences terminales 5' et 3' d’un module UAS se chevauchent avec celles des plasmides linéarisés ADNc/ORF, permettant la réaction en une seule étape.

Les produits de réaction en une seule étape sont directement soumis à la transformation d’E. coli . Théoriquement, seules les colonies UAS-ADNc/ORF souhaitées peuvent se développer sur des plaques Luria-Bertani (LB) qui contiennent des antibiotiques sélectionnés correspondant au gène de résistance aux antibiotiques du module UAS. Le module UAS est composé d’un module UAS central, d’un gène de résistance aux antibiotiques distinct de celui des plasmides d’ADNc ou d’ORF, et des séquences terminales 5′ et 3′. Un module UAS de base comprend 10 copies d’UAS, un promoteur minimal Hsp70, une séquence attB pour l’intégration génomique médiée par phiC31 et un marqueur de transformation mini-blanc pour la drosophile⁷.

Protocole

1. Détermination du site optimal de clivage Cas9/ARNsg en amont de l’ADNc/ORF

1. Préparation de plasmides d’ADNc ou d’ORF avec un squelette vectoriel identique
   1. Achetez des clones d’ADNc/ORF disponibles dans les ressources publiques, telles que le centre de ressources sur le génome de la drosophile (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, la collection de gènes de mammifères souris (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) et la bibliothèque d’expression lentivirale humaine^{CCSB 12}. Dans ce protocole, nous prenons l’exemple des clones d’ADNc/ORF à base de vecteurs pOT2, qui sont disponibles dans la collection Gold du DGRC.
   2. Extrayez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmide. Mesurez la concentration de plasmides à l’aide d’un spectrophotomètre.
2. Conception des ARNsg
   1. Visitez le site Web de CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Cliquez sur le bouton Coller la cible , puis saisissez la séquence d’ADN qui vous intéresse. La séquence d’intérêt est une région de 20-100 pb située dans le squelette du vecteur pOT2 en amont de l’extrémité 5' de l’ADNc/ORF.
   2. Choisissez l’espèce Drosophila melanogaster. Cliquez sur le bouton Trouver des sites cibles. Choisissez des candidats à ARNsg dont l’efficacité prévue est supérieure à 80 %.
3. Préparation des ARNsg
   1. Commandez des oligos purifiés par PAGE, une amorce directe (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3') où (N)₂₀ est la séquence cible d’un ARNsg, et un échafaudage d’ARNsg inverse d’amorce sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des oligonucléotides de haute qualité purifiés par PAGE.
   2. Préparez une matrice d’ADN par PCR pour la transcription in vitro (IVT) de l’ARNsg. Mettez en place une réaction PCR de 100 μL comme suit : 5 μL de matrice pX330 (plasmide Addgene 42230, un cadeau de Feng Zhang ; 0,1 ng/μL), 5 μL d’amorce directe (10 μM), 5 μL de sgRNA-REV (10 μM), 50 μL de 2 mélanges maîtres PCR haute fidélité et 35 μL d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) dans un tube PCR.
   3. Effectuer la PCR dans les conditions de thermocyclage suivantes : 1 cycle à 98 °C pendant 30 s ; 5 cycles de 98 °C pendant 10 s, 51 °C pendant 10 s, 72 °C pendant 5 s ; 30 cycles de 98 °C pendant 10 s, 72 °C pendant 15 s ; 1 cycle à 72 °C pendant 2 min. Incuber les réactions dans un thermocycleur.
   4. Séparer les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 %. Un fragment d’ADN de ~120 pb doit être visible sur le gel sous UV. Purifiez le fragment d’ADN de ~120 pb à l’aide d’un kit d’extraction de gel. Le fragment d’ADN purifié sert de modèle pour l’IVT de l’ARNsg.
   5. Configurez une réaction IVT de 5 μL comme suit : 165 ng de fragment d’ADN de gel purifié de ~120 pb, 1,65 μL de mélange tampon NTP, 0,33 μL de mélange d’ARN polymérase T7 et de l’eau traitée au DEPC. Incuber les réactions à 37 °C pendant 4 h. Suivez les instructions du manuel d’un kit de transcription in vitro .
   6. Ajouter 45 μL d’eau traitée au DEPC au produit de réaction IVT. Traitez les produits de réaction IVT comme de l’ARN et utilisez de l’eau traitée au DEPC comme témoin à blanc. Mesurez la concentration d’ARNsg à l’aide d’un spectrophotomètre. La concentration d’ARNsg dilué est d’environ 870 ng/μL.
   7. Diluer le produit de réaction IVT à 20 ng/μL avec de l’eau traitée au DEPC. Aliquote et stockez l’ARNsg directement à -80 °C.
      REMARQUE : Après la réaction IVT, il n’est pas nécessaire de retirer la matrice d’ADN par digestion de la DNase pour mesurer la concentration précise d’ARNsg, car la quantité de matrice d’ADN est inférieure à 0,4 % de celle de l’ARNsg et la matrice d’ADN n’affecte pas la réaction CRISPRmass ultérieure. Par conséquent, la purification de l’ARNsg n’est pas nécessaire.
4. Évaluation des ARNsg
   1. Digérer un squelette de vecteur pOT2 portant un plasmide ADNc/ORF avec une enzyme de restriction. Séparez les fragments d’ADN résultants par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 %. Purifiez le substrat de l’ADN avec un kit d’extraction de gel.
      REMARQUE : Un fragment d’ADN résultant contenant les séquences ciblant l’ARNsg du squelette du vecteur pOT2 sert de substrat d’ADN aux ARNsg Cas9. Les sites de clivage des ARNs Cas9/sg sont situés de manière asymétrique dans le substrat d’ADN, et par conséquent, le clivage du substrat d’ADN par les ARNs Cas9/sg produit deux fragments d’ADN de tailles différentes, ce qui les distingue plus facilement du substrat d’ADN non lavé dans la réaction de digestion.
   2. Établissez une réaction de clivage Cas9 de 5 μL comme suit : 0,2 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,5 μL de 20 ng/μL d’ARNsg, 0,015 pmol de substrat d’ADN, 0,5 μL de tampon 10x Cas9 et de l’eau traitée au DEPC. Incuber les réactions à 37 °C pendant 1 h.
   3. Séparer les produits de clivage par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 %. Chargez le substrat d’ADN intact comme contrôle négatif pour le substrat d’ADN digéré.
      REMARQUE : Ici, le substrat d’ADN intact fait référence au substrat d’ADN qui n’est pas soumis à des réactions de digestion par Cas9/sgRNAs. Le clivage du substrat d’ADN par Cas9/sgRNAs produit deux fragments d’ADN de tailles différentes, ce qui les rend plus faciles à distinguer du substrat d’ADN non lavé dans la réaction de digestion.
   4. Analysez les modèles de clivage à l’aide d’un système d’imagerie numérique (Figure 2). Sélectionnez l’ARNsg le plus efficace pour les expériences CRISPRmass ultérieures. La figure 2 montre que les quatre ARNsg présentent une efficacité de clivage élevée et peuvent être utilisés pour CRISPRmass. Sélectionnez l’ARNsg souligné pour les expériences ultérieures.
      REMARQUE : Moins le substrat d’ADN non lavé est important, plus l’ARNsg est efficace pour la digestion du substrat d’ADN par Cas9/ARNsg.

2. Construction d’un module UAS

REMARQUE : Un module UAS comprend un UAS central et environ 20 à 40 pb des séquences terminales 5' et 3' chevauchant les extrémités 5' et 3' du site de clivage du squelette, respectivement (Figure 1). Les séquences terminales 5' et 3' du module UAS sont déterminées par le site de clivage du squelette du vecteur pOT2.

1. Clonez le module UAS spécifique au vecteur pOT2 dans le site EcoRI du vecteur pCR8GW, ce qui donne le plasmide pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (fichier supplémentaire 1). Libérer le module UAS spécifique du vecteur pOT2 par digestion du plasmide pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 avec EcoRI à 37 °C pendant 1 h.
2. Séparer les produits de clivage par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,7 %. Purifiez le module UAS de 6178 pb avec un kit d’extraction de gel. Diluer le module UAS à 23 ng/μL pour les expériences ultérieures. Ce fragment de 6178 pb sert de module UAS pour la construction de plasmides UAS-ADNc/ORF à partir de clones d’ADNc/ORF basés sur le vecteur pOT2.

3. Construction à grande échelle de plasmides UAS-cDNA/ORF par CRISPRmass

REMARQUE : CRISPRmass est normalisé en tant que réactions massivement parallèles en tube à essai en deux étapes avant la transformation d’E. coli (Figure 1).

1. Réaction en éprouvette, étape 1
   1. Cliver les squelettes vectorielles identiques des plasmides ADNc/ORF par Cas9/sgRNA. Disposez les tubes de 0,2 ml dans un bloc de refroidissement en aluminium sur de la glace et étiquetez soigneusement les tubes. Préparez le mixage maître comme suit.
      1. Pour une seule réaction, ajouter 0,16 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,4 μL de 20 ng/μL d’ARNsg, 0,24 μL de tampon 10x Cas9, 1,2 μL d’eau traitée au DEPC. Pour les réactions azotées, ajouter (N+1) x 0,16 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μL de 20 ng/μL d’ARNsg, (N+1) x 0,24 μL de 10 tampons Cas9, (N+1) x 1,2 μL d’eau traitée au DEPC.
   2. Vortex, mélangez bien et tournez. Aliquote 2 μL de mélange maître dans chaque tube. Ajouter 0,4 μL de 0,019 μM de plasmide ADNc/ORF dans chaque tube. Incuber les réactions de clivage à 37 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Diluer chaque plasmide à 0,019 μM avec de l’eau traitée au DEPC. Si la concentration d’un plasmide est inférieure à 0,019 μM, ajoutez l’ADN du plasmide directement à la réaction de clivage. Utilisez des tubes sans RNase et de l’eau traitée au DEPC. La réalisation de ces étapes à grande échelle prendra plusieurs heures. Sauf indication contraire, conservez les réactifs et les réactions sur de la glace.
2. Réaction en éprouvette, étape 2
   1. Insérez un module UAS spécifique au vecteur de l’étape 2 dans les plasmides ADNc/ORF linéarisés par Cas9 par un assemblage de réaction en une seule étape. Mettez en place une réaction en une seule étape de 1,4 μL pour chaque échantillon. Disposez les tubes de 0,2 ml dans un bloc de refroidissement en aluminium sur de la glace et étiquetez soigneusement les tubes.
      1. Préparez le mixage maître comme suit. Pour une réaction unique, ajoutez 0,07 μL de module UAS 0,006 μM et 0,7 μL de mélange maître d’assemblage de réaction en une seule étape. Pour N réactions, ajouter (N+1) x 0,07 μL de module UAS 0,006 μM et (N+1) x 0,7 μL de mélange maître d’assemblage de réaction en une seule étape.
   2. Vortex, mélangez bien et tournez. Aliquote 0,77 μL du mélange maître dans chaque tube. Ajouter 0,7 μL de plasmide ADNc/ORF linéarisé Cas9 dans chaque tube. Incuber les réactions à 50 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : La purification des produits de réaction d’assemblage en une seule étape n’est pas nécessaire. La réalisation de ces étapes à grande échelle prend plusieurs heures. Sauf indication contraire, conservez les réactifs et les réactions sur de la glace.
3. Transformer les produits de réaction d’assemblage en une seule étape en E. coli à grande échelle.
   1. Préconfrifier les pointes de 10 μL à 4 °C. Prérefroidir des tubes de 1,5 mL dans un bloc de refroidissement en aluminium sur de la glace.
   2. Décongeler les cellules E . coli compétentes sur de la glace pendant 5 min. Aliquote 10 μL de cellules compétentes dans chaque tube prérefroidi de 1,5 mL.
      REMARQUE : Utilisez des cellules E. coli compétentes disponibles dans le commerce avec une efficacité de transformation d’au moins 1 x 10⁸ UFC/μg d’ADN pUC19.
   3. Ajouter 1 μL de produit de réaction d’assemblage en une seule étape à 10 μL de cellules compétentes, agiter doucement pour mélanger et placer sur de la glace pendant 30 min.
   4. Incuber les tubes dans un bain-marie à 42 °C pendant 1 min, puis refroidir immédiatement sur de la glace pendant 2 min.
   5. Ajouter 100 μL de milieu SOC (préchauffé à 37 °C) dans chaque tube à température ambiante et incuber dans un incubateur à agitation (250 tr/min) à 37 °C pendant 1 h.
   6. Réchauffer jusqu’à 37 °C les plaques LB qui contiennent un antibiotique correspondant au gène de résistance aux antibiotiques du module UAS. Répartissez les cellules sur les plaques et incubez à 37 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : L’exécution de ces étapes à grande échelle prend plusieurs heures. Sauf indication contraire, conservez les réactifs et les réactions sur de la glace.
4. Vérifier les plasmides UAS-cDNA/ORF construits par CRISPRmass
   1. Choisissez une seule colonie et inoculez-la dans 4,5 mL de milieu liquide LB complété par la sélection appropriée d’antibiotiques correspondant au gène de résistance aux antibiotiques du module UAS. Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant à 250 tr/min.
   2. Extrayez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmide. Mettez en place une réaction de digestion de restriction de 20 μL comme suit : 300-500 ng/μL de plasmide, enzyme(s) de restriction appropriée(s), tampon de digestion de restriction et eau ultrapure. Incuber les réactions à 37 °C pendant 1 h.
   3. Séparer les fragments d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 % et les analyser à l’aide d’un système d’imagerie numérique (Figure 3).

Résultats

Nous avons appliqué CRISPRmass pour générer une banque de plasmides UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome en utilisant 3402 clones d’ADNc/ORF portant le squelette de vecteur pOT2 de la collection Gold du DGRC. Nous avons analysé au hasard une seule colonie pour chaque construction UAS-cDNA/ORF, et l’analyse de restriction ultérieure avec PstI a indiqué que 98,6 % des constructions UAS-cDNA/ORF ont été créées avec succès⁹. La raison d’être de l’utilisation de PstI pour l’ana...

Discussion

Les étapes les plus critiques de CRISPRmass sont la conception des ARNsg et l’évaluation des ARNsg. La sélection d’ARNsg hautement efficaces pour Cas9 est la clé du succès de CRISPRmass. Si très peu ou pas de colonies sont observées sur la majorité des plaques LB contenant des antibiotiques après la transformation d’E. coli avec des produits d’assemblage de réaction en une seule étape, vérifier la digestion du plasmide par électrophorèse sur gel d’agarose. Si les plasmides ne sont pas bien digér?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA