JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول عزل الأسلاف الليفية العضلية الهيكلية والقلبية (FAPs) من الفأر الشوكي (Acomys) عن طريق التفكك الأنزيمي وفرز الخلايا المنشطة بالتألق. يمكن توسيع FAPs التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول بشكل فعال وتمييزها إلى الخلايا الليفية العضلية والخلايا الشحمية.

Abstract

نظرا لبرنامج الإصلاح الاستثنائي ، يعد الفأر الشوكي نموذجا بحثيا ناشئا للطب التجديدي. السلف الليفي الدهني المنشأ عبارة عن خلايا مقيمة في الأنسجة قادرة على التمايز إلى خلايا دهنية وخلايا ليفية وخلايا غضروفية. تعتبر الأسلاف الليفية الأديبوجينية أساسية لتنظيم تجديد الأنسجة لأنها مسؤولة عن إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية بعد الإصابة. تركز هذه الدراسة على التحقيق في الدور المحدد للأسلاف الليفية الأديبوجينية في إصلاح قلب الفأر الشوكي وتجديد العضلات الهيكلية. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تحسين بروتوكول لتنقية أسلاف الفأر الشوكي الليفي الدهني عن طريق قياس التدفق الخلوي من العضلات الهيكلية والقلبية المنفصلة إنزيميا. السكان الذين تم الحصول عليهم من هذا البروتوكول قادرون على التوسع في المختبر ، ويمكن تمييزهم إلى الخلايا الليفية العضلية والخلايا الشحمية. يقدم هذا البروتوكول أداة قيمة للباحثين لفحص الخصائص المميزة للفأر الشوكي ، ومقارنتها بالعضلات الشوكية. سيوفر هذا رؤى يمكن أن تعزز فهم آليات التجدد في هذا النموذج المثير للاهتمام.

Introduction

تم التعرف على الفأر الشوكي في البداية لبشرته الهشة بشكل استثنائي وقدرته الرائعة على إصلاح إصابات الجلد ، وقد أظهر قدرة فائقة على التجدد في مختلف أجهزة الأعضاء ، مثل الجهاز العضلي الهيكلي والكلوي والجهاز العصبي المركزي والقلب والأوعية الدموية ، عند مقارنته ب Mus musculus 1,2.

السلف الليفي الدهني (FAPs) هي مجموعة فرعية من الخلايا اللحمية الموجودة في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الهيكل العظمي وعضلة القلب. تمتلك هذه الخلايا قدرة فريدة على الالتزام بالسلالات الليفية والدهنية في الجسم الحي وفي المختبر 3,4. تلعب FAPs دورا حاسما في تجديد الأنسجة عن طريق تعديل المصفوفة خارج الخلية ودعم وظائف أنواع الخلايا الأخرى المشاركة في عملية الإصلاح. في العضلات الهيكلية ، يتم تنشيط FAPs استجابة للإصابة وتسهيل تمايز الخلايا الجذعية العضلية وتكوين العضلات 5,6. في إصابة نقص تروية القلب ، تضع FAPs أنسجة ندبة للحفاظ على سلامة عضلة القلب. على عكس العضلات ، يتم تنشيط FAPs القلبية بشكل مزمن وتساهم في إعادة تشكيل الأمراض 7,8.

أظهرت الدراسات السابقة أن مصفوفة الفأر الشوكي خارج الخلية لها تركيبة وبنية وخصائص مختلفة تدعم التجديد مقارنة ب Mus musculus 9,10. في إصابات العضلات والقلب ، لوحظ أن FAPs تساهم في الشفاء الفائق في الفأر الشوكي11،12،13. إن فهم السلوك والتحكم التنظيمي للفأر الشوكي FAPs والسدى قد يلقي الضوء على الآلية الكامنة وراء قدراتها التجديدية. بينما تتم دراسة FAPs على نطاق واسع في نماذج حيوانية أخرى ، كما هو الحال في mus musculus14,15 ، حاليا ، لا توجد بروتوكولات منشورة لعزل FAPs للفأر الشوكي. إن تطوير مثل هذا البروتوكول من شأنه أن يسد فجوة كبيرة في هذا المجال ويمكن الباحثين من فحص الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء إمكانات التجدد للفأر الشوكي.

يصف هذا البروتوكول بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لعزل وتوسيع وتمييز FAPs للعضلات الهيكلية والقلبية من الفأر الشوكي. ينتج عن البروتوكول الموصوف هنا معلقات أحادية الخلية عالية الجودة مناسبة لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). باستخدام rh-TGFβ1 أو وسائط متوافقة متاحة تجاريا ، وهما طريقتان تستخدمان على نطاق واسع للتمييز بين العضلات العضلية FAPs16 ، تحافظ FAPs الشوكية المصنفة على قدرتها على التمييز على طول السلالة الليفية والسلالة الأديبية ، على التوالي (الشكل 1).

Protocol

تم إجراء جميع إجراءات صيانة والتجارب وفقا لموافقة لجنة رعاية بجامعة كولومبيا البريطانية واللوائح في جامعة كولومبيا البريطانية. تم إيواء في منشأة مغلقة خالية من مسببات الأمراض في ظل الظروف القياسية (دورة الضوء والظلام 12:12 ، 21-23 درجة مئوية ، ومستوى الرطوبة 40٪ -60٪) وقدمت نظاما غذائيا غنيا بالبروتين للفئران والماء حسب الحاجة. تم استخدام الفئران البالغة (من 4 إلى 6 أشهر ، 50-60 جم) من الإناث والذكور Acomys dimidiatus لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. إعداد الحل والمخزن المؤقت

  1. تحضير 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS).
  2. تحضير PBS-EDTA عن طريق خلط 4 مل من 0.5 M EDTA (2 mM) و 996 مل من 1x PBS ، الرقم الهيدروجيني = 7.4.
  3. تحضير 250 mM CaCl2 بإضافة 2.7745 جم من CaCl2 إلى 100 مل من الماء الخالي من النيوكلياز.
  4. تحضير محلول الهضم: امزج 50 ميكروغرام / مل ليبراز ، 2.5 مللي مول CaCl2 ، و 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) في DMEM / F12.
  5. قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق خلط 488 مل من 1x PBS و 2 مل من 0.5M EDTA و 10 مل من FBS.
  6. تحضير المخزن المؤقت للتطبيق عن طريق خلط المخزن المؤقت FACS مع يوديد البروبيديوم (PI ؛ 1 ميكروغرام / مل).
  7. قم بإعداد الوسائط الأساسية عن طريق خلط DMEM / F12 مع 5٪ FBS ، و 1٪ (v / v) قلم / بكتيريا .
  8. قم بإعداد وسائط الانتشار عن طريق خلط DMEM / F12 مع 10٪ FBS و 1٪ (v / v) قلم / بكتيريا و 2.5 نانوغرام / مل bFGF.
  9. تحضير الوسائط الليفية عن طريق خلط الوسائط الأساسية و 10 نانوغرام / مل rh-TGFβ1 ،
  10. تحضير الوسائط الأديبوجينية (1x) عن طريق خلط DMEM / F12 مع 1٪ قلم / بكتيريا وملحق تمايز 10x منشأ للفأر متاح تجاريا.
  11. تحضير 4٪ PFA بإضافة 4٪ بارافورمالدهيد (w / v) إلى 1x PBS.
  12. تحضير 0.3٪ PBS-Triton عن طريق خلط 498.5 مل من 1x PBS و 1.5 مل من TritonX-100.
  13. قم بإعداد المخزن المؤقت لحظر الحمير عن طريق خلط 5٪ (v / v) مصل حمار ، و 1٪ BSA (w / v) ، و 0.3٪ PBS-Triton.
  14. قم بإعداد المخزن المؤقت لحظر Donkey + MOM عن طريق خلط 2.5 مل من المخزن المؤقت لحظر الحمار وقطرتين من كتلة MOM.
  15. قم بإعداد محلول تلطيخ DAPI عن طريق خلط 600 نانومتر من 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) في 1x PBS.

2. جمع الأنسجة

  1. القتل الرحيم للحيوان باتباع إرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية. بالنسبة للفئران الشوكية ، يوصى بإيزوفلوران متبوعا بثاني أكسيد الكربون2 (20٪ من حجم القفص / دقيقة) وخلع العمود الفقري لضمان الوفاة.
  2. ضع الماوس على مرحلة التشريح في وضع الاستلقاء ، ورشه جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث بفراء الفأر.
  3. قم بعمل شق عمودي 2-3 سم عند خط الوسط البطني وكشف القفص الصدري وعضلة البطن. قطع العضلات في عملية الخنجري مع مقص الأنسجة وفضح الحجاب الحاجز. قطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري على كلا الجانبين. استخدم مرقئا لتثبيت وتقشير الأضلاع المقطوعة.
  4. قم بشق الأذين الأيمن بمقص الأنسجة ، ضع إبرة 23 جم متصلة بحقنة سعة 20 مل في قمة القلب ، وقم بحقنها عن طريق حقن 20 مل ببطء من 2 مللي متر PBS-EDTA.
  5. استئص القلب ، وشطف في البرد 1x PBS في طبق بتري 60 ملم على الجليد ، وإزالة الأذينين ، وتنظيف الدم قدر الإمكان.
  6. إزالة الجلد فوق مفصل الركبة. استخدم ملقط ناعم لإزالة اللفافة وعزل عضلة الفخذ بالمقص باستخدام عظم الفخذ كدليل. ضع في طبق بتري منفصل مع 1x PBS الباردة.
  7. كرر الخطوة 2.6 للساق الأخرى.

3. هضم الأنسجة

  1. أضف 2 مل من محلول الهضم إلى قارورة نقل 5 مل للقلب ، و 4 مل من محلول الهضم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل لعضلتين رباعيتي الرؤوس.
  2. فرم الأنسجة بمقص الأنسجة على غطاء طبق بتري إلى أصغر من 1 مم3 قطع.
  3. أضف الأنسجة المفرومة إلى أنابيب الهضم الخاصة بها. دوامة لمدة 2 ثانية بسرعة منخفضة للخلط.
  4. احتضان في 37 درجة مئوية مع دوران لطيف ورج.
  5. بعد 20 دقيقة ، أخرج الأنابيب من المدور واترك قطع الأنسجة تستقر. خلع المادة الطافية باستخدام ماصة P1000 إلى 20 مل من مخزن FACS المثلج البارد في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل.
  6. قم بتعبئة أنابيب الهضم ب 2 مل و 4 مل من محلول الهضم لهضم القلب والعضلات على التوالي ، وضعها مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع دوران لطيف ورج.
  7. كرر الخطوات من 3.5 إلى 3.6 مرة أخرى بعد 20 دقيقة أخرى. ضع المادة الطافية في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل من الخطوة 3.5.
  8. أوقف عملية الهضم بعد 60 دقيقة عن طريق إخماد المخزن المؤقت للهضم باستخدام محلول FACS المثلج البارد.
  9. قم بتصفية معلق الهضم والمادة الطافية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر فوق أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل. قم بتعبئة ما يصل إلى 40 مل باستخدام المخزن المؤقت FACS.
  10. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK. احتضانها على الثلج لمدة 5 دقائق وقم بتعبئة ما يصل إلى 40 مل باستخدام مخزن FACS المؤقت.
  11. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب الطاف.
  12. أعد التعليق في 0.5 مل من المخزن المؤقت FACS ، مع السحب لأعلى ولأسفل لضمان تشتت الخلايا بالتساوي.
  13. قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر على أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5 مل مع غطاء مصفاة خلوية.

4. تلطيخ لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS)

  1. بالنسبة لعناصر التحكم أحادية اللون والتألق ناقص واحد (FMO) ، قم بإعداد 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (الأجسام المضادة المخففة في المخزن المؤقت FACS) بتركيز عمل 2x في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل الموسومة مسبقا. راجع الجدول 1 لإعداد المخزن المؤقت لتلطيخ الأجسام المضادة.
  2. قم بإعداد الألوان الفردية وعناصر التحكم في FMO للعضلات والقلب بشكل منفصل.
  3. انقل 30 ميكرولتر من اللون الواحد و FMO التحكم في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى لوحة 96 بئرا. قم بتعبئة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  4. بالنسبة لعينة تلطيخ FACS ، قم بإعداد 0.5 مل من محلول التلوين (الجسم المضاد المخفف في المخزن المؤقت FACS) بتركيز عمل 2x في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل.
  5. أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى لون واحد وآبار التحكم في FMO. أضف المخزن المؤقت للتلطيخ إلى بقية تعليق الخلية وإنعاشها.
  6. احتضان في درجة حرارة 4 درجة مئوية ، محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة.
  7. قم بتعبئة الآبار ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وأنبوب العينة ب 2 مل من المخزن المؤقت FACS.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية.
  9. كرر الخطوتين 4.7 و4.8.
  10. أعد تعليق بيليه الخلية في المخزن المؤقت للصلاحية. 100 ميكرولتر للون الواحد وعناصر التحكم FMO ، 1 مل لعينات فرز FACS.
  11. قم بإعداد أنابيب التجميع بإضافة 300 ميكرولتر من وسائط الانتشار في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.7 مل.

5. فرز الخلايا المنشط بالفلورة

  1. استراتيجية البوابة: استخدم FSC مقابل. SSC (سجل) لإزالة الحطام. استخدم FSC-H مقابل. FSC-A لبوابة الفردي. استخدم CD31 مقابل. PI إلى البوابة على خلايا قابلة للحياة وسالبة النسب. استخدم PDGFRα لبوابة FAPs (الشكل 2).
  2. فرز في أنابيب جمع أعدت مسبقا.

6. زراعة الأنسجة

  1. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة P1000. احرص على عدم إزعاج بيليه الخلية.
  3. أعد تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع (250 ميكرولتر / بئر) والبذور عند 25 ألف خلية / بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 48 بئرا.
  4. الثقافة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2). قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.

7. التمايز الليفي

  1. بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة للعلاج ، ضع الوسائط الأساسية و 1x DPBS في حمام دافئ أو في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
  2. نضح وسائل الإعلام الثقافية.
  3. شطف مع 200 ميكرولتر من 1x DPBS مرتين.
  4. شطف مع 200 ميكرولتر من الوسائط الأساسية مرة واحدة.
  5. أضف 250 ميكرولتر من الوسائط الليفية أو الأساسية إلى الآبار المعنية.
  6. أعد الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  7. أوقف التمايز بعد 48 ساعة.

8. التمايز الأديبوجيني

  1. بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة للعلاج ، ضع الوسائط الأساسية والوسائط الدهنية و 1x DPBS في حمام دافئ أو في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
  2. نضح وسائل الإعلام الثقافية.
  3. شطف مع 200 ميكرولتر من 1x DPBS مرتين.
  4. شطف مع 200 ميكرولتر من الوسائط الأساسية مرة واحدة.
  5. أضف 400 ميكرولتر من الوسائط الدهنية أو الأساسية إلى الآبار المعنية.
  6. العودة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  7. كل يومين ، قم بإزالة وسائط 200 ميكرولتر باستخدام ماصة من الآبار وأضف 200 ميكرولتر من الوسائط الدهنية أو الأساسية الطازجة.
  8. توقف عن التمايزفي اليوم 6 ل FAPs العضلات والهيكل العظمي ،واليوم 14 ل FAPs القلبية.

9. تلطيخ المناعة

  1. أوقف مقايسة التمايز عن طريق شفط الوسائط والشطف باستخدام 250 ميكرولتر من 1x PBS مرتين. قم بإجراء جميع عمليات الغسيل بإبرة 18 جم متصلة بحقنة سعة 3 مل لتجنب انفصال الخلايا.
  2. أضف 250 ميكرولتر من 4٪ PFA لكل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
  3. قم بإزالة PFA واشطفه 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 250 ميكرولتر من 1x PBS.
  4. في الغسلة الأخيرة ، نضح 1x PBS وأضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحظر Donkey + MOM.
  5. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
  6. قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأساسي في المخزن المؤقت لحجب الحمير (مضاد SMA ومضاد للبيريليبين) لحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.
  7. نضح آبار تلطيخ. اترك المخزن المؤقت لحظر Donkey + MOM تحت السيطرة جيدا إن أمكن.
  8. أضف محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأساسي في الآبار المعنية.
  9. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  10. في اليوم التالي ، اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 1x PBS.
  11. قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوي في المخزن المؤقت لحجب الحمير بحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.
  12. نضح الغسيل الأخير وإضافة محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوي في جميع الآبار.
  13. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة (يجب حماية العينات من الضوء من هذه النقطة فصاعدا).
  14. اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 1x PBS.
  15. نضح الغسيل الأخير وإضافة 250 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI.
  16. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  17. قم بإزالة محلول تلطيخ DAPI واغسله مرة واحدة لمدة 5 دقائق باستخدام 1x PBS.
  18. أضف 100 ميكرولتر من Fluoromount-G في كل بئر.
  19. أغلق اللوحة بالغطاء وفيلم البارافين لتقليل التبخر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء حتى التصوير.
  20. صورة بالمجهر (الشكل 3 والشكل 4).
    ملاحظة: يستخدم مصل الحمير في منع المخزن المؤقت ككتلة خاصة بالأنواع ضد الأجسام المضادة الثانوية التي يثيرها الحمار والتي تستخدم في هذا البروتوكول. يتم استخدام كاشف حظر الماوس على الماوس ضد الجسم المضاد الأساسي المضاد ل SMA الذي يتم رفعه في الماوس.

النتائج

يلخص الشكل 1 الشكل التخطيطي لهذا البروتوكول لعزل وزراعة العضلات الهيكلية وفضلات الساقين القلبية. لجمع الأنسجة ، عادة ما يكون لون الكبد المتغير من الأحمر الداكن إلى الأصفر الباهت مؤشرا على نجاح التروية. مع الفئات العمرية المحددة للفأر الشوكي ، تكون أوزان...

Discussion

أنسجة الفئران الشوكية أكثر حساسية للضغوط في تفكك الأنسجة ، وهناك عدة جوانب من هذا البروتوكول تهدف إلى تقليل الإجهاد لتحسين صلاحية الخلية. يتم استخدام تقنية التفكك الأنزيمي التسلسلي لإعداد العينة لخفض تركيز الإنزيم المطلوب. مع استمرار الهضم الأنزيمي ، ينخفض النشاط الأن...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن تقديرنا لآندي جونسون وجوستين وونغ ، قلب تدفق UBC ، لخبرتهما ومساعدتهما في تحسين بروتوكول FACS ، بالإضافة إلى موظفي منشأة في مركز البحوث الطبية الحيوية بجامعة كولومبيا البريطانية لرعاية الفئران الشوكية. تم عمل الشكل 1 باستخدام Biorender. تم عمل الشكل 2 باستخدام برنامج FlowJo.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogen15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubesVWR87003-294
15 mL centrifuge tubeFalcon352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
20 mL syringeBD309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD3571
40 μm cell strainerFalcon352340
48 well flat-bottom tissue culture plateFalcon53078
5 mL polypropyleneFalcon352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capFalcon352235
5 mL syringeBD309646
50 mL centrifuge tubeFalcon352070
60 mm Petri dishFalcon353002
96 well V-bottom tissue culture plateCorning3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing bufferGibcoA10492-01
Anti-perilipin (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 GBD305195
BD PrecisionGlide Needle 23 GBD305145
Bovine serum albuminSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
CentrifugeEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Donkey serumSigmaS30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasersBeckman coulterB52102
Fetal bovine serumGemini100-500
Fine scissorsFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
ForcepsFST11051-10
HemostatFST91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)Gibco13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Inverted microscope - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x SupplementSTEMCELL technologies5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213
ParaformaldehydeSigmaP1648-500g
Penicillin-StreptomycinGibco15140–122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Propidium iodide (PI)InvitrogenP3566
Transport vial 5mL tubeCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5

References

  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1 (2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
  3. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  4. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  6. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
  7. Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  8. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
  9. Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
  10. Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561 (2012).
  11. Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78 (2021).
  12. Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74 (2021).
  13. Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920 (2018).
  14. Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983 (2022).
  15. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
  16. Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110 (2021).
  17. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
  18. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
  19. Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
  20. Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved