عزل السلف الليفي الأديبوجيني والتوسع والتمايز عن نموذج الفأر الشوكي

Summary

يحدد هذا البروتوكول عزل الأسلاف الليفية العضلية الهيكلية والقلبية (FAPs) من الفأر الشوكي (Acomys) عن طريق التفكك الأنزيمي وفرز الخلايا المنشطة بالتألق. يمكن توسيع FAPs التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول بشكل فعال وتمييزها إلى الخلايا الليفية العضلية والخلايا الشحمية.

Abstract

نظرا لبرنامج الإصلاح الاستثنائي ، يعد الفأر الشوكي نموذجا بحثيا ناشئا للطب التجديدي. السلف الليفي الدهني المنشأ عبارة عن خلايا مقيمة في الأنسجة قادرة على التمايز إلى خلايا دهنية وخلايا ليفية وخلايا غضروفية. تعتبر الأسلاف الليفية الأديبوجينية أساسية لتنظيم تجديد الأنسجة لأنها مسؤولة عن إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية بعد الإصابة. تركز هذه الدراسة على التحقيق في الدور المحدد للأسلاف الليفية الأديبوجينية في إصلاح قلب الفأر الشوكي وتجديد العضلات الهيكلية. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تحسين بروتوكول لتنقية أسلاف الفأر الشوكي الليفي الدهني عن طريق قياس التدفق الخلوي من العضلات الهيكلية والقلبية المنفصلة إنزيميا. السكان الذين تم الحصول عليهم من هذا البروتوكول قادرون على التوسع في المختبر ، ويمكن تمييزهم إلى الخلايا الليفية العضلية والخلايا الشحمية. يقدم هذا البروتوكول أداة قيمة للباحثين لفحص الخصائص المميزة للفأر الشوكي ، ومقارنتها بالعضلات الشوكية. سيوفر هذا رؤى يمكن أن تعزز فهم آليات التجدد في هذا النموذج المثير للاهتمام.

Introduction

تم التعرف على الفأر الشوكي في البداية لبشرته الهشة بشكل استثنائي وقدرته الرائعة على إصلاح إصابات الجلد ، وقد أظهر قدرة فائقة على التجدد في مختلف أجهزة الأعضاء ، مثل الجهاز العضلي الهيكلي والكلوي والجهاز العصبي المركزي والقلب والأوعية الدموية ، عند مقارنته ب Mus musculus ^1,2.

السلف الليفي الدهني (FAPs) هي مجموعة فرعية من الخلايا اللحمية الموجودة في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الهيكل العظمي وعضلة القلب. تمتلك هذه الخلايا قدرة فريدة على الالتزام بالسلالات الليفية والدهنية في الجسم الحي وفي المختبر

Protocol

تم إجراء جميع إجراءات صيانة والتجارب وفقا لموافقة لجنة رعاية بجامعة كولومبيا البريطانية واللوائح في جامعة كولومبيا البريطانية. تم إيواء في منشأة مغلقة خالية من مسببات الأمراض في ظل الظروف القياسية (دورة الضوء والظلام 12:12 ، 21-23 درجة مئوية ، ومستوى الرطوبة 40٪ -60٪) وقدمت نظاما غذائيا غنيا بالبروتين للفئران والماء حسب الحاجة. تم استخدام الفئران البالغة (من 4 إلى 6 أشهر ، 50-60 جم) من الإناث والذكور Acomys dimidiatus لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. إعداد الحل والمخزن المؤقت

1. تحضير 1x محلول ملحي عازل....

النتائج

يلخص الشكل 1 الشكل التخطيطي لهذا البروتوكول لعزل وزراعة العضلات الهيكلية وفضلات الساقين القلبية. لجمع الأنسجة ، عادة ما يكون لون الكبد المتغير من الأحمر الداكن إلى الأصفر الباهت مؤشرا على نجاح التروية. مع الفئات العمرية المحددة للفأر الشوكي ، تكون أوزان.......

Discussion

أنسجة الفئران الشوكية أكثر حساسية للضغوط في تفكك الأنسجة ، وهناك عدة جوانب من هذا البروتوكول تهدف إلى تقليل الإجهاد لتحسين صلاحية الخلية. يتم استخدام تقنية التفكك الأنزيمي التسلسلي لإعداد العينة لخفض تركيز الإنزيم المطلوب. مع استمرار الهضم الأنزيمي ، ينخفض النشاط الأن.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5