Isolierung, Expansion und Differenzierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus dem Modell der stacheligen Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen (FAPs) des Skelett- und Herzmuskels aus stacheligen Mäusen (Acomys) durch enzymatische Dissoziation und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Die aus diesem Protokoll gewonnenen FAPs können effektiv zu Myofibroblasten und Adipozyten erweitert und differenziert werden.

Zusammenfassung

Aufgrund ihres außergewöhnlichen Reparaturprogramms ist die Stachelmaus ein aufstrebendes Forschungsmodell für die regenerative Medizin. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind geweberesidente Zellen, die in der Lage sind, sich in Adipozyten, Fibroblasten und Chondrozyten zu differenzieren. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind von grundlegender Bedeutung für die Orchestrierung der Geweberegeneration, da sie für den Umbau der extrazellulären Matrix nach Verletzungen verantwortlich sind. Diese Studie konzentriert sich auf die Untersuchung der spezifischen Rolle von fibro-adipogenen Vorläuferzellen bei der Herzreparatur und der Regeneration der Skelettmuskulatur der Stachelmaus. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll für die Aufreinigung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen der Stachelmaus mittels Durchflusszytometrie aus enzymatisch dissoziierten Skelett- und Herzmuskeln optimiert. Die aus diesem Protokoll erhaltene Population ist in der Lage, sich in vitro zu vermehren und kann zu Myofibroblasten und Adipozyten differenziert werden. Dieses Protokoll bietet Forschern ein wertvolles Werkzeug, um die charakteristischen Eigenschaften der Stachelmaus zu untersuchen und sie mit dem Mus musculus zu vergleichen. Dies wird Erkenntnisse liefern, die das Verständnis der regenerativen Mechanismen in diesem faszinierenden Modell voranbringen könnten.

Einleitung

Ursprünglich für ihre außergewöhnlich empfindliche Haut und ihre bemerkenswerte Fähigkeit, Hautverletzungen zu reparieren, bekannt, hat die Stachelmaus im Vergleich zu Mus musculus^eine überlegene Regenerationsfähigkeit in verschiedenen Organsystemen wie Bewegungsapparat, Nieren, Zentralnervensystem und Herz-Kreislauf gezeigt ^1,2.

Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Untergruppe von Stromazellen, die in verschiedenen Geweben beheimatet sind, einschließlich Skelett- und Herzmuskeln. Diese Zellen besitzen eine einzigartige Fähigkei....

Protokoll

Alle Tierhaltungs- und Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung des Tierpflegeausschusses der University of British Columbia und den Vorschriften der University of British Columbia durchgeführt. Die Tiere wurden in einer geschlossenen pathogenfreien Anlage unter Standardbedingungen (12:12 Hell-Dunkel-Zyklus, 21-23 °C und 40%-60% Luftfeuchtigkeit) untergebracht und erhielten eine proteinreiche Mausnahrung und Wasser ad libitum. Für diese Studie wurden adulte (4 bis 6 Monate alte, 50-60 g) weibliche und männliche Acomys dimidiatus-Mäuse verwendet. Die Details zu allen verwendeten Reagenzien und G....

Diskussion

Stachelmausgewebe reagiert empfindlicher auf die Spannungen bei der Dissoziation des Gewebes, und es gibt mehrere Aspekte dieses Protokolls, die darauf abzielen, Stress zu minimieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Für die Probenvorbereitung wird die serielle enzymatische Dissoziationstechnik eingesetzt, um die Konzentration des erforderlichen Enzyms zu senken. Mit fortschreitender enzymatischer Verdauung nimmt die enzymatische Aktivität ab. Durch den Ersatz durch fr.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5