בידוד, הרחבה והבחנה של אב פיברו-אדיפוגני ממודל העכבר הקוצני

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אבות פיברו-אדיפוגניים של שרירי השלד והלב (FAPs) מעכבר קוצני (Acomys) באמצעות דיסוציאציה אנזימטית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה. FAPs המתקבלים מפרוטוקול זה ניתן להרחיב ביעילות ולהבדיל למיופיברובלסטים ואדיפוציטים.

Abstract

בשל תוכנית התיקון יוצאת הדופן שלו, העכבר הקוצני הוא מודל מחקר מתפתח לרפואה רגנרטיבית. אבות פיברו-אדיפוגניים הם תאים שוכנים ברקמה המסוגלים להתמיין לאדיפוציטים, פיברובלסטים וכונדרוציטים. אבות פיברו-אדיפוגניים הם בסיסיים לתיאום התחדשות רקמות מכיוון שהם אחראים לעיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית לאחר פציעה. מחקר זה מתמקד בחקירת התפקיד הספציפי של אבות פיברו-אדיפוגניים בתיקון לב עכבר קוצני ובהתחדשות שרירי השלד. לשם כך, פרוטוקול הותאם לטיהור אבות פיברו-אדיפוגניים של עכבר קוצני על ידי ציטומטריית זרימה משרירי השלד והלב המנותקים אנזימטית. האוכלוסייה המתקבלת מפרוטוקול זה מסוגלת להתרחב במבחנה, וניתן להבדיל אותה למיופיברובלסטים ואדיפוציטים. פרוטוקול זה מציע כלי רב ערך לחוקרים לבחון את התכונות הייחודיות של עכבר קוצני, ולהשוות אותן לשרירי Mus. זה יספק תובנות שיכולות לקדם את ההבנה של מנגנוני התחדשות במודל מסקרן זה.

Introduction

עכבר קוצני, שהוכר בתחילה בזכות עורו השברירי במיוחד ויכולתו יוצאת הדופן לתקן פציעות עור, הוכיח יכולת התחדשות מעולה במערכות איברים שונות, כגון שרירים ושלד, כליות, מערכת העצבים המרכזית ולב וכלי דם, בהשוואה לשרירי Mus ^1,2.

אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם תת-קבוצה של תאי סטרומה השוכנים ברקמות שונות, כולל שרירי השלד והלב. תאים אלה הם בעלי יכולת ייחודית להתחייב לשושלות פיברוגני ואדיפוגניות in vivo ו-in vitro ^3,4. FAPs ממלאים תפקיד מכריע בהתחדשות רקמות על ידי אפנון המטריצה החוץ תאית ותמיכה בתפקודים של סוגי תאים אחרים המעורבים בתהליך התיקון. בשרירי השלד, FAPs מופעלים בתגובה לפציעה ומקלים על התמיינות תאי גזע שריר ומיוגנזה ^5,6. בפגיעה איסכמית בלב, FAPs מניחים רקמת צלקת כדי לשמור על שלמות שריר הלב. בניגוד לשרירים, FAPs לב להיות מופעל באופן כרוני ולתרום שיפוץ פתולוגי ^7,8.

מחקרים קודמים הראו כי למטריצה חוץ-תאית של עכבר קוצני יש הרכב, מבנה ותכונות שונים התומכים בהתחדשות בהשוואה לשרירי Mus ^9,10. בפציעות שרירים ולב, FAPs הודגם כתורם לריפוי מעולה בעכבר קוצני 11,12,13. הבנת ההתנהגות והבקרה הרגולטורית של עכברים קוצניים וסטרומה עשויה לשפוך אור על המנגנון שמאחורי יכולות ההתחדשות שלהם. בעוד FAPs נחקרים בהרחבה במודלים אחרים של בעלי חיים, כגון Mus musculus^14,15, נכון לעכשיו, אין פרוטוקולים שפורסמו לבידוד FAPs עכבר קוצני. פיתוח פרוטוקול כזה ימלא פער משמעותי בתחום ויאפשר לחוקרים לבחון את המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס פוטנציאל ההתחדשות של העכבר הקוצני.

פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול חזק וניתן לשחזור לבידוד, הרחבה והבחנה בין FAPs של שרירי השלד והלב לבין עכבר קוצני. הפרוטוקול המתואר כאן מניב מתלים חד-תאיים באיכות גבוהה המתאימים למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS). על-ידי שימוש ב-rh-TGFβ1 או במדיה מסחרית תואמת, שתי שיטות שנמצאות בשימוש נרחב כדי להבדיל בין שרירי שריר ^{FAPs 16}, ה-FAPs הקוצניים הממוינים שומרים על יכולתם להתמיין לאורך השושלת הפיברוגנית והשושלת האדיפוגנית, בהתאמה (איור 1).

Protocol

כל הליכי התחזוקה והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לאישור הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קולומביה הבריטית והתקנות באוניברסיטת קולומביה הבריטית. בעלי החיים שוכנו במתקן סגור ללא פתוגן בתנאים סטנדרטיים (מחזור אור-חושך 12:12, 21-23 מעלות צלזיוס ורמת לחות של 40%-60%) וסיפקו תזונת עכברים עשירה בחלבון ומים עד לליביטום. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי Acomys dimidiatus בוגרים (בני 4 עד 6 חודשים, 50-60 גרם). הפרטים של כל הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תמיסה וחיץ

1. הכינו 1x מלח חיץ פוספט (PBS).
2. הכן PBS-EDTA על ידי ערבוב 4 מ"ל של 0.5 M EDTA (2 mM) ו- 996 מ"ל של 1x PBS, pH = 7.4.
3. הכן 250 mM CaCl₂ על ידי הוספת 2.7745 גרם של CaCl₂ עד 100 מ"ל של מים ללא נוקלאז.
4. הכינו את מאגר העיכול: יש לערבב 50 מיקרוגרם/מ"ל ליבראז, 2.5 מ"מ CaCl₂ וסרום בקר עוברי 5% (FBS) ב-DMEM/F12.
5. הכן מאגר FACS על-ידי ערבוב של 488 מ"ל של 1x PBS, 2 מ"ל של 0.5M EDTA ו-10 מ"ל של FBS.
6. הכן את מאגר הכדאיות על-ידי ערבוב מאגר FACS עם יודיד פרופידיום (PI; 1 מיקרוגרם/מ"ל).
7. הכן מדיה בסיסית על-ידי ערבוב DMEM/F12 עם 5% FBS ו-1% (v/v) עט/סטרפ.
8. הכן מדיית התפשטות על-ידי ערבוב DMEM/F12 עם 10% FBS, 1% (v/v) pen/strep ו-2.5 ng/mL bFGF.
9. הכן מדיה פיברוגנית על ידי ערבוב מדיה בסיסית ו 10 ng/mL rh-TGFβ1,
10. הכן מדיה אדיפוגנית (1x) על ידי ערבוב DMEM/F12 עם 1% עט/סטרפטוקוקוס ותוסף בידול אדיפוגני של עכבר 10x הזמין מסחרית.
11. הכינו 4% PFA על ידי הוספת 4% Paraformaldehyde (w/v) ל-1x PBS.
12. הכינו 0.3% PBS-Triton על ידי ערבוב 498.5 מ"ל של 1x PBS ו-1.5 מ"ל של TritonX-100.
13. הכינו חיץ חוסם חמור על ידי ערבוב 5% (v/v) נסיוב חמור, 1% BSA (w/v) ו-0.3% PBS-Triton.
14. הכינו חיץ חוסם חמור + MOM על ידי ערבוב 2.5 מ"ל של חיץ חסימת חמור ו -2 טיפות של בלוק MOM.
15. הכן תמיסת צביעה DAPI על ידי ערבוב 600 ננומטר של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 1x PBS.

2. איסוף רקמות

1. יש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. עבור עכברים קוצניים, isoflurane ואחריו_CO2 (20% מנפח הכלוב / דקה) ונקע בעמוד השדרה כדי להבטיח מוות מומלץ.
2. הניחו את העכבר על שלב הדיסקציה במצב שכיבה, ורססו ביסודיות באתנול 70% כדי למנוע זיהום בפרוות עכבר.
3. בצע חתך אנכי של 2-3 ס"מ בקו האמצע הגחוני וחשף את כלוב הצלעות ושריר הבטן. חותכים דרך השריר בתהליך הקסיפואיד עם מספריים לרקמות וחושפים את הסרעפת. חותכים את הסרעפת ואת כלוב הצלעות משני הצדדים. השתמש hemostat כדי להדק ולקלף בחזרה את הצלעות החתוכות.
4. ניקבו את האטריום הימני עם מספריים לרקמות, הניחו מחט 23 G המחוברת למזרק 20 מ"ל בקודקוד הלב, וחוררו אותה על ידי הזרקה איטית של 20 מ"ל של 2 mM PBS-EDTA.
5. מוציאים את הלב, שוטפים בקור 1x PBS בצלחת פטרי 60 מ"מ על קרח, מסירים אטריה ומנקים דם ככל האפשר.
6. הסר את העור מעל מפרק הברך. השתמשו במלקחיים עדינים כדי להסיר את הפאשיה ולבודד את שריר הארבע ראשי בעזרת מספריים על ידי שימוש בעצם הירך כקו מנחה. מניחים בצלחת פטרי נפרדת עם 1x PBS קר.
7. חזור על שלב 2.6 עבור הרגל השנייה.

3. עיכול רקמות

1. הוסף 2 מ"ל של חיץ עיכול לבקבוקון הובלה של 5 מ"ל ללב, ו -4 מ"ל של חיץ עיכול לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל לשני שרירים ארבע ראשיים.
2. טחנו את הרקמה עם מספריים רקמה על מכסה צלחת פטרי לתוך קטן מ 1 מ"מ³ חתיכות.
3. הוסיפו רקמה טחונה לצינורות העיכול המתאימים. מערבול במשך 2 שניות במהירות נמוכה כדי לערבב.
4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם סיבוב עדין וניעור.
5. לאחר 20 דקות, הסר את הצינורות מהמסובב ואפשר לחתיכות הרקמה לשקוע. הורידו את הסופרנאטנט עם פיפטה P1000 לתוך 20 מ"ל של חיץ FACS קר כקרח בצינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל.
6. מלאו את צינורות העיכול ב-2 מ"ל ו-4 מ"ל של חיץ עיכול לעיכול הלב והשריר בהתאמה, והחזירו אותם לטמפרטורה של 37°C עם סיבוב ורעד עדינים.
7. חזור על שלבים 3.5 עד 3.6 פעם נוספת לאחר 20 דקות נוספות. הכנס את הסופרנאטנט לצינור הצנטריפוגה המתאים של 50 מ"ל משלב 3.5.
8. עצור את העיכול לאחר 60 דקות על ידי הרוות את מאגר העיכול עם מאגר FACS קר כקרח.
9. מסננים את מתלה העיכול ואת הסופרנאטנט דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר על גבי צינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל. מלא עד 40 מ"ל עם מאגר FACS.
10. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 x גרם במשך 8 דקות ב 4 ° C. דקנט את הסופרנאטנט והשהה מחדש את גלולת התא ב 3 מ"ל של חיץ ליזה ACK. יש לדגור על קרח במשך 5 דקות ולמלא עד 40 מ"ל עם חיץ FAC.
11. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. דקנט את הסופר-נטנט.
12. יש להשהות מחדש ב-0.5 מ"ל של מאגר FACS, תוך צנרת מעלה ומטה כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
13. סנן את המתלה דרך מסנן 40 מיקרומטר על צינורות פוליסטירן עגולים בעלי תחתית עגולה של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים.

4. צביעה למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)

1. לבקרות צבע יחיד ופלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO), יש להכין 30 μL של חיץ צביעה (נוגדנים מדוללים במאגר FACS) בריכוז עבודה פי 2 בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל שסומנו מראש. עיין בטבלה 1 עבור הגדרת מאגר צביעת נוגדנים.
2. הכינו צבעים בודדים ופקדי FMO לשרירים וללב בנפרד.
3. מעבירים 30 μL של צבע יחיד וחיץ צביעה של בקרת FMO לצלחת של 96 בארות. מלא 20 μL של מאגר FACS.
4. לצביעת FACS לדוגמה, יש להכין 0.5 מ"ל של חיץ צביעה (נוגדן מדולל במאגר FACS) בריכוז עבודה פי 2 בצינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל.
5. הוסף 10 μL של תרחיף התא לצבע יחיד ולבארות בקרת FMO. הוסף חיץ צביעה לשאר מתלה התא והשעיה מחדש.
6. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C, מוגן מפני אור למשך 30 דקות.
7. מלא את הבארות עם 100 μL של חיץ FACS, ואת צינור הדגימה עם 2 מ"ל של חיץ FACS.
8. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
9. חזור על שלבים 4.7 ו- 4.8.
10. השהה מחדש את גלולת התא במאגר הכדאיות. 100 μL עבור צבע יחיד ופקדי FMO, 1 מ"ל עבור דוגמאות מיון FACS.
11. הכן את צינורות האיסוף על ידי הוספת 300 μL של אמצעי התפשטות בצינורות צנטריפוגות 1.7 מ"ל.

5. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

1. אסטרטגיית Gating: השתמש ב- FSC לעומת . SSC (יומן) לפינוי פסולת. השתמש ב- FSC-H לעומת . FSC-A לסינגלטים שערים. השתמש CD31 לעומת PI כדי שער על תאים קיימא ושושלת שלילית. השתמשו ב-PDGFRα כדי להגיע לשער עבור FAPs (איור 2).
2. מיין לתוך צינורות איסוף שהוכנו בעבר.

6. תרבות רקמות

1. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
2. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה P1000. היזהר לא להפריע את כדור התא.
3. יש להשהות מחדש את הגלולה בתרבית (250 מיקרוליטר/באר) ולזרוע ב-25,000 תאים/באר בצלחת תרבית רקמה של 48 בארות.
4. תרבות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂). שנה מדיה כל 3 ימים עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.

7. הבחנה פיברוגנית

1. ברגע שהתאים מוכנים לטיפול, הניחו מדיה בסיסית ו-1x DPBS באמבטיה חמה או בטמפרטורת החדר לפני השימוש בהם.
2. שאפו לתקשורת התרבות.
3. יש לשטוף עם 200 μL של DPBS אחד פעמיים.
4. יש לשטוף עם 200 מיקרוליטר של חומר בסיסי פעם אחת.
5. הוסף 250 μL של מדיה פיברוגנית או בסיסית לבארות המתאימות.
6. להחזיר את התאים לאינקובטור (37 ° C, 5% CO₂).
7. עצור את ההבחנה לאחר 48 שעות.

8. הבחנה אדיפוגנית

1. ברגע שהתאים מוכנים לטיפול, הניחו מדיה בסיסית, מדיה אדיפוגנית ו-DPBS 1x באמבטיה חמה או בטמפרטורת החדר לפני השימוש בהם.
2. שאפו לתקשורת התרבות.
3. יש לשטוף עם 200 μL של DPBS אחד פעמיים.
4. יש לשטוף עם 200 מיקרוליטר של חומר בסיסי פעם אחת.
5. הוסף 400 μL של מדיה אדיפוגנית או בסיסית לבארות המתאימות.
6. חזרה לאינקובטור (37°C, 5% CO₂).
7. כל יומיים, להסיר 200 μL מדיה עם פיפטה מן הבארות ולהוסיף 200 μL של מדיה אדיפוגנית טרייה או בסיסית.
8. עצור את ההבחנה ביום ה^- 6 עבור FAPs שרירי השלד, וביום ה^- 14 עבור FAPs לב.

9. Immunostaining

1. עצור את בדיקת הבידול על ידי שאיפה מדיה ושטיפה עם 250 μL של 1x PBS פעמיים. בצע את כל השטיפות עם מחט 18 G המחוברת מזרק 3 מ"ל כדי למנוע ניתוק התא.
2. יש להוסיף 250 μL של 4% PFA לבאר ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות.
3. יש להסיר את ה-PFA ולשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 250 μL של 1x PBS.
4. בשטיפה האחרונה, שאפו 1x PBS והוסיפו 250 μL של חיץ חוסם חמור + MOM.
5. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות.
6. הכינו תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית בחיץ חוסם חמור (אנטי-SMA ואנטי-פריליפין) לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לבאר.
7. שאפו את בארות הצביעה. השאר את חיץ החסימה חמור + MOM בשליטה היטב אם רלוונטי.
8. הוסף תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית בבארות המתאימות.
9. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
10. למחרת, שטפו 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 1x PBS.
11. הכינו תמיסת צביעת נוגדנים משנית בחיץ חוסם חמור בנפח סופי של 100 מיקרוליטר לבאר.
12. שאפו את השטיפה האחרונה והוסיפו תמיסת צביעת נוגדנים משנית בכל הבארות.
13. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות (הדגימות צריכות להיות מוגנות מפני אור מנקודה זו ואילך).
14. שטפו 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 1x PBS.
15. שאפו את הכביסה האחרונה והוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת צביעה DAPI.
16. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
17. הסר את תמיסת הצביעה DAPI ושטוף פעם אחת במשך 5 דקות עם PBS אחד.
18. הוסף 100 μL של Fluoromount-G בכל באר.
19. אטמו את הצלחת עם המכסה וסרט הפרפין כדי למזער אידוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, מוגן מפני האור עד להדמיה.
20. תמונה במיקרוסקופ (איור 3 ואיור 4).
    הערה: סרום חמור משמש לחסימת חיץ כבלוק ספציפי למין כנגד נוגדנים משניים הגדלים על חמור המשמשים בפרוטוקול זה. מגיב חסימת עכבר על עכבר משמש נגד נוגדן אנטי SMA הראשוני כי הוא גדל בעכבר.

תוצאות

הסכמה של פרוטוקול זה לבידוד ותרבית של שרירי השלד והלב מסוכמת באיור 1. עבור איסוף רקמות, הכבד משנה את צבעו מאדום כהה לצהוב בהיר בדרך כלל מעיד על זילוח מוצלח. עם טווחי הגילאים שצוינו של עכבר קוצני, משקל הלב הוא בדרך כלל סביב 200 מ"ג, בעוד שריר ארבע ראשי הוא סביב 3...

Discussion

רקמות עכבר קוצני רגישות יותר ללחצים בדיסוציאציה של רקמות, וישנם מספר היבטים של פרוטוקול זה שמטרתם למזער את הלחץ כדי לשפר את יכולת הקיום של התא. טכניקת דיסוציאציה אנזימטית סדרתית משמשת להכנת דגימה כדי להוריד את ריכוז האנזים הדרוש. ככל שהעיכול האנזימטי מתקדם, הפעילות האנז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5