とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

要約

このプロトコルは、酵素解離および蛍光活性化細胞ソーティングによるトゲマウス(Acomys)からの骨格筋および心筋線維脂肪形成前駆細胞(FAP)の単離を概説しています。このプロトコルから得られたFAPは、筋線維芽細胞および脂肪細胞に効果的に拡大および分化させることができます。

要約

その優れた修復プログラムにより、トゲネズミは再生医療の新たな研究モデルとなっています。線維脂肪形成前駆細胞は、脂肪細胞、線維芽細胞、軟骨細胞に分化することができる組織に常在する細胞です。線維脂肪形成前駆細胞は、損傷後の細胞外マトリックスリモデリングに関与しているため、組織再生を組織再生するための基本です。この研究は、トゲトゲマウスの心臓修復と骨格筋の再生における線維脂肪形成前駆細胞の特定の役割を調査することに焦点を当てています。この目的のために、酵素的に解離した骨格筋および心筋からのフローサイトメトリーによるトゲマウス線維脂肪形成前駆細胞の精製のためにプロトコルが最適化されています。このプロトコルから得られた集団は、 in vitro で拡大することができ、筋線維芽細胞および脂肪細胞に分化することができる。このプロトコールは、研究者がトゲネズミの特徴的な特性を調べ、 それらをMus musculus と比較するための貴重なツールを提供します。これにより、この興味深いモデルにおける再生メカニズムの理解を進める可能性のある洞察が得られます。

概要

当初、非常に壊れやすい皮膚と皮膚の損傷を修復する優れた能力で認識されていたトゲマウスは、Mus musculus ^1,2と比較して、筋骨格系、腎臓系、中枢神経系、心血管系などのさまざまな臓器系で優れた再生能力を示しています。

線維脂肪形成前駆細胞(FAP)は、骨格筋や心筋などのさまざまな組織に存在する間質細胞のサブセットです。これらの細胞は、in vivoおよびin vitroで線維形成および脂肪形成の系統に関与する独自の能力を持っています^3,4。FAPは、細胞外マトリックスを調節し、修復プロセスに関与する他の細胞タイプの機能をサポートすることにより、組織再生に重要な役割を果たします。骨格筋では、FAPは損傷に応答して活性化し、筋幹細胞の分化と筋形成を促進します^5,6。心臓の虚血性損傷では、FAPは心筋の完全性を維持するために瘢痕組織を敷設します。筋肉とは対照的に、心臓のFAPは慢性的に活性化され、病理学的リ....

プロトコル

すべての動物の維持管理および実験手順は、ブリティッシュコロンビア大学動物管理委員会の承認およびブリティッシュコロンビア大学の規則に従って実施されました。動物は、標準的な条件(12:12明暗サイクル、21-23°C、湿度40%-60%)で病原体のない密閉施設に収容され、タンパク質が豊富なマウスの食事 と水を自由に提供しました。この研究には、成体(生後4〜6か月、50〜60 g)の雌と雄の Acomys dimidiatus マウスを使用しました。使用したすべての試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 溶液とバッファーの調製

1. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。
2. 4 mLの0.5 M EDTA(2 mM)と996 mLの1x PBS(pH = 7.4)を混合して、PBS-EDTAを調製します。
3. ヌクレアーゼフリーの水100 mLにCaCl 2.7745 gを添加し、250 mM CaCl 2を調製します。
4. 消化バッファーの調製:50 μg/mL リベラーゼ、2.5 mM CaCl₂、および 5% ウシ胎児血清 (FBS) を DMEM/F1....

ディスカッション

トゲネズミ組織は、組織解離のストレスに対してより敏感であり、このプロトコルには、ストレスを最小限に抑えて細胞の生存率を向上させることを目的としたいくつかの側面があります。サンプル調製には、必要な酵素の濃度を下げるためのシリアル酵素解離技術が採用されています。酵素消化が進むと、酵素活性は低下します。新鮮な酵素に置き換えることで、.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5