とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

要約

このプロトコルは、酵素解離および蛍光活性化細胞ソーティングによるトゲマウス(Acomys)からの骨格筋および心筋線維脂肪形成前駆細胞(FAP)の単離を概説しています。このプロトコルから得られたFAPは、筋線維芽細胞および脂肪細胞に効果的に拡大および分化させることができます。

要約

その優れた修復プログラムにより、トゲネズミは再生医療の新たな研究モデルとなっています。線維脂肪形成前駆細胞は、脂肪細胞、線維芽細胞、軟骨細胞に分化することができる組織に常在する細胞です。線維脂肪形成前駆細胞は、損傷後の細胞外マトリックスリモデリングに関与しているため、組織再生を組織再生するための基本です。この研究は、トゲトゲマウスの心臓修復と骨格筋の再生における線維脂肪形成前駆細胞の特定の役割を調査することに焦点を当てています。この目的のために、酵素的に解離した骨格筋および心筋からのフローサイトメトリーによるトゲマウス線維脂肪形成前駆細胞の精製のためにプロトコルが最適化されています。このプロトコルから得られた集団は、 in vitro で拡大することができ、筋線維芽細胞および脂肪細胞に分化することができる。このプロトコールは、研究者がトゲネズミの特徴的な特性を調べ、 それらをMus musculus と比較するための貴重なツールを提供します。これにより、この興味深いモデルにおける再生メカニズムの理解を進める可能性のある洞察が得られます。

概要

当初、非常に壊れやすい皮膚と皮膚の損傷を修復する優れた能力で認識されていたトゲマウスは、Mus musculus ^1,2と比較して、筋骨格系、腎臓系、中枢神経系、心血管系などのさまざまな臓器系で優れた再生能力を示しています。

線維脂肪形成前駆細胞(FAP)は、骨格筋や心筋などのさまざまな組織に存在する間質細胞のサブセットです。これらの細胞は、in vivoおよびin vitroで線維形成および脂肪形成の系統に関与する独自の能力を持っています^3,4。FAPは、細胞外マトリックスを調節し、修復プロセスに関与する他の細胞タイプの機能をサポートすることにより、組織再生に重要な役割を果たします。骨格筋では、FAPは損傷に応答して活性化し、筋幹細胞の分化と筋形成を促進します^5,6。心臓の虚血性損傷では、FAPは心筋の完全性を維持するために瘢痕組織を敷設します。筋肉とは対照的に、心臓のFAPは慢性的に活性化され、病理学的リモデリングに寄与します^7,8。

これまでの研究では、トゲネズミの細胞外マトリックスは、Mus musculus ^9,10と比較して、再生をサポートする組成、構造、および特性が異なることが示されています。 筋肉および心臓の損傷では、FAPはとげのあるマウス11,12,13の優れた治癒に寄与することが注目されています。トゲトゲマウスのFAPと間質の行動と制御制御を理解することで、その再生能力の背後にあるメカニズムに光が当てられる可能性があります。FAPは、mus musculus^14,15などの他の動物モデルで広く研究されていますが、現在、とげのあるマウスのFAPを分離するための公開されたプロトコルはありません。このようなプロトコルを開発すれば、この分野の大きなギャップを埋めることができ、研究者はトゲネズミの再生能力の根底にある細胞および分子メカニズムを調べることができます。

このプロトコルは、とげのあるマウスから骨格筋および心筋のFAPを分離、拡張、および区別するための堅牢で再現性のあるプロトコルを説明しています。ここで説明するプロトコールは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)に適した高品質のシングルセル懸濁液をもたらします。rh−TGFβ1または適合する市販培地、すなわち筋^FAP16を鑑別するために広く使用されている2つの方法を使用することにより、選別されたトゲ状FAPは、それぞれ線維形成系統および脂肪形成系統に沿って分化する能力を維持する(図1)。

プロトコル

すべての動物の維持管理および実験手順は、ブリティッシュコロンビア大学動物管理委員会の承認およびブリティッシュコロンビア大学の規則に従って実施されました。動物は、標準的な条件(12:12明暗サイクル、21-23°C、湿度40%-60%)で病原体のない密閉施設に収容され、タンパク質が豊富なマウスの食事 と水を自由に提供しました。この研究には、成体(生後4〜6か月、50〜60 g)の雌と雄の Acomys dimidiatus マウスを使用しました。使用したすべての試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 溶液とバッファーの調製

1. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。
2. 4 mLの0.5 M EDTA(2 mM)と996 mLの1x PBS(pH = 7.4)を混合して、PBS-EDTAを調製します。
3. ヌクレアーゼフリーの水100 mLにCaCl 2.7745 gを添加し、250 mM CaCl 2を調製します。
4. 消化バッファーの調製:50 μg/mL リベラーゼ、2.5 mM CaCl₂、および 5% ウシ胎児血清 (FBS) を DMEM/F12 に混合します。
5. 488 mLの1x PBS、2 mLの0.5M EDTA、および10 mLのFBSを混合して、FACSバッファーを調製します。
6. FACSバッファーをヨウ化プロピジウム(PI;1 μg/mL)と混合して、生存率バッファーを調製します。
7. DMEM/F12 を 5% FBS、および 1% (v/v) ペン/連鎖球菌と混合して、基本培地を調製します。
8. DMEM/F12を10% FBS、1%(v/v)ペン/連鎖球菌、および2.5 ng/mL bFGFと混合して増殖培地を調製します。
9. 塩基性培地と10 ng/mL rh-TGFβ1を混合して線維形成培地を調製します。
10. DMEM/F12を1%ペン/連鎖球菌および市販の10xマウス脂肪原性分化サプリメントと混合して、脂肪原性培地(1x)を調製します。
11. 1x PBSに4%パラホルムアルデヒド(w / v)を添加して、4%PFAを調製します。
12. 498.5 mLの1x PBSと1.5 mLのTritonX-100を混合して、0.3% PBS-Tritonを調製します。
13. 5%(v / v)Donkey血清、1%BSA(w / v)、および0.3%PBS-Tritonを混合して、Donkeyブロッキングバッファーを調製します。
14. Donkey + MOM blocking bufferを調製するには、Donkey blocking buffer2.5 mLとMOM blockを2滴混合します。
15. 1x PBS中に600 nMの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を混合してDAPI染色溶液を調製します。

2. ティッシュコレクション

1. 動物管理委員会のガイドラインに従って動物を安楽死させます。トゲネズミの場合、イソフルランに続いてCO₂ (ケージの体積の20%)/分)と脊椎脱臼を併用して死亡を確実にすることが推奨されます。
2. マウスを解剖ステージの仰臥位に置き、マウスの毛皮による汚染を防ぐために70%エタノールを十分に噴霧します。
3. 腹側正中線に2〜3cmの垂直切開を行い、胸郭と腹筋を露出させます。剣状突起で筋肉を組織ハサミで切り抜き、横隔膜を露出させます。ダイヤフラムと胸郭の両側をカットします。止血器を使用して、カットしたリブをクランプして剥がします。
4. ティッシュハサミで右心房に切り込みを入れ、20mLの注射器に取り付けた23Gの針を心臓の頂点に置き、20mLの2mM PBS-EDTAをゆっくりと注入して灌流します。
5. 心臓を切除し、氷の上の60mmのペトリ皿に冷たい1x PBSをすすぎ、心房を取り除き、血液をできるだけきれいにします。
6. 膝関節の上の皮膚を取り除きます。細い鉗子を使用して筋膜を切除し、大腿骨をガイドとして使用してハサミで大腿四頭筋を分離します。冷たい1x PBSを入れた別のシャーレに入れます。
7. もう一方の脚についても手順2.6を繰り返します。

3.組織消化

1. 2 mLの消化バッファーを心臓用の5 mL輸送バイアルに加え、4 mLの消化バッファーを2つの大腿四頭筋用の15 mL遠心チューブに加えます。
2. ペトリ皿の蓋の上のティッシュハサミでティッシュを1mm未満の³ 個に細かく刻みます。
3. みじん切りにした組織をそれぞれの消化チューブに加えます。低速で2秒間渦巻き、混合します。
4. 37°Cで静かに回転させ、振とうしながらインキュベートします。
5. 20分後、チューブをローテーターから外し、ティッシュ片が落ち着くのを待ちます。P1000ピペットで上清を取り出し、50 mLの遠心分離チューブ内の20 mLの氷冷FACSバッファーに入れます。
6. 消化チューブに、心臓用と筋肉用の消化バッファー2 mLと筋肉用消化バッファーをそれぞれ補充し、穏やかに回転させ、振とうしながら37°Cに戻します。
7. 手順3.5から手順3.6を、さらに20分後にもう一度繰り返します。ステップ3.5からそれぞれの50 mL遠心チューブに上清を入れます。
8. 60分後に、消化バッファーを氷冷したFACSバッファーで急冷して、分解を停止します。
9. 消化懸濁液と上清を、50 mLの遠心チューブの上にある40 μmの細胞ストレーナーでろ過します。FACSバッファーで最大40mLを補充します。
10. 細胞懸濁液を500 x g で4°Cで8分間遠心分離します。 上清をデカントし、細胞ペレットを3 mLのACK溶解バッファーに再懸濁します。氷上で5分間インキュベートし、FACSバッファーを最大40 mLまで補充します。
11. 500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清をデカントします。
12. 0.5 mLのFACSバッファーに再懸濁し、ピペッティングで上下させて、細胞が均一に分散していることを確認します。
13. 細胞ストレーナーキャップ付きの5mLポリスチレン丸底チューブ上の40μmフィルターで懸濁液をろ過します。

4. 蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)のための染色

1. 単色および蛍光マイナス1(FMO)コントロールの場合、標識済みの1.5 mL遠心分離チューブに2倍の作業濃度で30 μLの染色バッファー(FACSバッファーで希釈した抗体)を調製します。抗体染色バッファーのセットアップについては、 表1 を参照してください。
2. 筋肉と心臓の単色とFMOコントロールを別々に準備します。
3. 30 μLの単色およびFMOコントロール染色バッファーを96ウェルプレートに移します。20μLのFACSバッファーを補充してください。
4. サンプルFACS染色には、1.5 mLの遠心チューブに2倍の使用濃度の0.5 mLの染色バッファー(FACSバッファーで希釈した抗体)を調製します。
5. 10 μLの細胞懸濁液を単色およびFMOコントロールウェルに加えます。残りの細胞懸濁液に染色バッファーを添加し、再懸濁します。
6. 4°Cでインキュベートし、30分間光から保護します。
7. ウェルに100 μLのFACSバッファーを補充し、サンプルチューブに2 mLのFACSバッファーを補充します。
8. 500 x g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去します。
9. 手順 4.7 と 4.8 を繰り返します。
10. 細胞ペレットを生存率バッファーに再懸濁します。単色および FMO コントロールの場合は 100 μL、FACS ソーティングサンプルの場合は 1 mL。
11. 1.7 mLの遠心分離チューブに300 μLの増殖培地を加えて、コレクションチューブを調製します。

5. 蛍光活性化細胞選別

1. ゲーティング戦略: FSC と破片を取り除くためのSSC(ログ)。FSC-H とを使用します。FSC-Aからゲートシングレットへ。CD31 とPIは、生存細胞および系統陰性細胞をゲートします。PDGFRαを使用してFAPをゲートします(図2)。
2. 事前に準備した収集チューブに選別します。

6. 組織培養

1. 収集した細胞を800 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
2. P1000ピペットで上清を取り除きます。細胞ペレットを乱さないように注意してください。
3. ペレットを培地(250 μL/ウェル)に再懸濁し、48ウェル組織培養プレートで25k細胞/ウェルで播種します。
4. インキュベーター(37°C、5%CO₂)で培養します。細胞の密度が80%に達するまで、3日ごとに培地を交換します。

7. 線維原性分化

1. 細胞を処理する準備ができたら、塩基性培地と1x DPBSを温かい浴または室温に置いてから使用してください。
2. 培地を吸引します。
3. 200 μL の 1x DPBS で 2 回すすぎます。
4. 200 μLの塩基性培地で一度すすいでください。
5. 250 μLの線維形成培地または塩基性培地をそれぞれのウェルに加えます。
6. 細胞をインキュベーター(37°C、5%CO₂)に戻します。
7. 48時間後に微分を停止します。

8.脂肪原性分化

1. 細胞を処理する準備ができたら、塩基性培地、脂肪形成培地、および1x DPBSを温かい浴槽または室温に置いてから使用してください。
2. 培地を吸引します。
3. 200 μL の 1x DPBS で 2 回すすぎます。
4. 200 μLの塩基性培地で一度すすいでください。
5. 400 μLの脂肪形成培地または塩基性培地をそれぞれのウェルに加えます。
6. インキュベーター(37°C、5%CO₂)に戻ります。
7. 2日ごとに、ピペットで200μLの培地をウェルから取り出し、200μLの新鮮な脂肪原性培地または塩基性培地を加えます。
8. 骨格筋FAPの場合は^6日目、 心筋FAPの場合は14^日目に 分化を停止します。

9. 免疫染色

1. 分化アッセイを停止し、培地を吸引し、250 μLの1x PBSで2回すすぎます。細胞の剥離を避けるために、18 Gの針を3 mLシリンジに取り付けてすべての洗浄を行います。
2. ウェルあたり250 μLの4% PFAを添加し、室温で7分間インキュベートします。
3. PFAを取り出し、1x PBS250μLで毎回5分間3回すすぎます。
4. 最後の洗浄では、1x PBSを吸引し、250 μLのDonkey + MOMブロッキングバッファーを加えます。
5. 室温で60分間インキュベートします。
6. Donkeyブロッキングバッファー(抗SMAおよび抗ペリリピン)で一次抗体染色溶液を調製し、最終容量をウェルあたり100 μLにします。
7. 染色ウェルを吸引します。ロバ+MOMブロッキングバッファは、該当する場合は適切に制御しておきます。
8. 一次抗体染色液をそれぞれのウェルに添加します。
9. 4°Cで一晩インキュベートします。
10. 翌日、1x PBSで毎回5分間3回洗浄します。
11. Donkeyブロッキングバッファーで二次抗体染色溶液を調製し、最終容量はウェルあたり100 μLです。
12. 最後の洗浄液を吸引し、すべてのウェルに二次抗体染色液を添加します。
13. 室温で45分間インキュベートします(この時点から先はサンプルを光から保護する必要があります)。
14. 1x PBSで毎回5分間3回洗浄します。
15. 最後の洗浄液を吸引し、250 μLのDAPI染色液を加えます。
16. 室温で5分間インキュベートします。
17. DAPI染色液を取り出し、1x PBSで5分間1回洗浄します。
18. 各ウェルに100 μLのFluoromount-Gを添加します。
19. プレートを蓋とパラフィンフィルムで密封し、蒸発を最小限に抑えます。4°Cで保存し、イメージングまで光から保護してください。
20. 顕微鏡で撮影した画像(図3 、 図4)。
    注:Donkey血清は、このプロトコルで使用されるDonkey産生二次抗体に対する種特異的ブロックとしてブロッキングバッファーに使用されます。マウスオンマウスブロッキング試薬は、マウスで産生された抗SMA一次抗体に対して使用されます。

結果

骨格筋と心臓のFAPを分離して培養するためのこのプロトコルの概略図を 図1にまとめています。組織採取の場合、肝臓の色が濃い赤から淡い黄色に変わることは、通常、灌流が成功したことを示しています。とげのあるマウスの指定された年齢範囲では、心臓の重量は通常約200 mgですが、大腿四頭筋は約350 mgです。

ステッ?...

ディスカッション

トゲネズミ組織は、組織解離のストレスに対してより敏感であり、このプロトコルには、ストレスを最小限に抑えて細胞の生存率を向上させることを目的としたいくつかの側面があります。サンプル調製には、必要な酵素の濃度を下げるためのシリアル酵素解離技術が採用されています。酵素消化が進むと、酵素活性は低下します。新鮮な酵素に置き換えることで、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5