Isolement, expansion et différenciation des progéniteurs fibro-adipogènes à partir du modèle de souris épineuses

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement des progéniteurs fibro-adipogéniques (FAP) du muscle squelettique et cardiaque de la souris épineuse (Acomys) par dissociation enzymatique et tri cellulaire activé par fluorescence. Les FAP obtenues à partir de ce protocole peuvent être efficacement étendues et différenciées en myofibroblastes et adipocytes.

Résumé

En raison de son programme de réparation exceptionnel, la souris épineuse est un modèle de recherche émergent pour la médecine régénérative. Les progéniteurs fibro-adipogènes sont des cellules tissulaires capables de se différencier en adipocytes, fibroblastes et chondrocytes. Les progéniteurs fibro-adipogènes sont fondamentaux pour orchestrer la régénération tissulaire car ils sont responsables du remodelage de la matrice extracellulaire après une blessure. Cette étude se concentre sur l’étude du rôle spécifique des progéniteurs fibro-adipogènes dans la réparation cardiaque et la régénération des muscles squelettiques de souris épineuses. À cette fin, un protocole a été optimisé pour la purification des progéniteurs fibro-adipogènes de souris épineuses par cytométrie en flux à partir de muscles squelettiques et cardiaques dissociés enzymatiquement. La population obtenue à partir de ce protocole est capable de s’étendre in vitro, et peut être différenciée en myofibroblastes et adipocytes. Ce protocole offre aux chercheurs un outil précieux pour examiner les propriétés distinctives de la souris épineuse et les comparer à la musculus musculus. Cela fournira des informations qui pourraient faire progresser la compréhension des mécanismes de régénération dans ce modèle intrigant.

Introduction

Initialement reconnue pour sa peau exceptionnellement fragile et sa remarquable capacité à réparer les lésions cutanées, la souris épineuse a démontré une capacité de régénération supérieure dans divers systèmes organiques, tels que l’appareil locomoteur, le rein, le système nerveux central et cardiovasculaire, par rapport au Mus musculus ^1,2.

Les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) sont un sous-ensemble de cellules stromales qui résident dans divers tissus, y compris le muscle squelettique et cardiaque. Ces cellules possèdent une capacité unique à s’engager dans des lignées fibrogènes et adipogéniques in vivo et in vitro ^3,4. Les FAP jouent un rôle crucial dans la régénération tissulaire en modulant la matrice extracellulaire et en soutenant les fonctions d’autres types de cellules impliquées dans le processus de réparation. Dans les muscles squelettiques, les PAF s’activent en réponse à une blessure et facilitent la différenciation des cellules souches musculaires et la myogenèse ^5,6. Dans les lésions ischémiques du cœur, les FAP déposent du tissu cicatriciel pour maintenir l’intégrité du myocarde. Contrairement au muscle, les PAF cardiaques s’activent de manière chronique et contribuent au remodelage pathologique ^7,8.

Des études antérieures ont démontré que la matrice extracellulaire de la souris épineuse a une composition, une structure et des propriétés différentes qui favorisent la régénération par rapport à Mus musculus ^9,10. Dans les lésions musculaires et cardiaques, il a été noté que les PAF contribuent à une guérison supérieure chez la souris épineuse 11,12,13. Comprendre le comportement et le contrôle réglementaire des FAP et du stroma de souris épineuses pourrait faire la lumière sur le mécanisme à l’origine de leurs capacités de régénération. Bien que les PAF soient largement étudiés dans d’autres modèles animaux, comme chez le mus musculus^14,15, il n’existe actuellement aucun protocole publié pour isoler les PAF de souris épineuses. Le développement d’un tel protocole comblerait une lacune importante dans le domaine et permettrait aux chercheurs d’examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents au potentiel de régénération de la souris épineuse.

Ce protocole décrit un protocole robuste et reproductible pour isoler, étendre et différencier les PAF des muscles squelettiques et cardiaques de la souris épineuse. Le protocole décrit ici permet d’obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité qui conviennent au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). En utilisant rh-TGFβ1 ou un milieu compatible disponible dans le commerce, deux méthodes largement utilisées pour différencier les FAP mus musculus ¹⁶, les FAP épineux triés conservent leur capacité à se différencier le long de la lignée fibrogène et de la lignée adipogénique, respectivement (Figure 1).

Protocole

Toutes les procédures d’entretien et d’expérimentation des animaux ont été effectuées conformément à l’approbation du comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique et aux règlements de l’Université de la Colombie-Britannique. Les animaux ont été logés dans une installation fermée exempte d’agents pathogènes dans des conditions standard (cycle lumière-obscurité 12:12, 21-23 °C et 40 à 60 % d’humidité) et ont reçu un régime de souris riche en protéines et de l’eau à volonté. Des souris Acomys dimidiatus femelles et mâles adultes (âgées de 4 à 6 mois, 50 à 60 g) ont été utilisées pour cette étude. Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation de la solution et du tampon

1. Préparez 1x tampon phosphate salin (PBS).
2. Préparez le PBS-EDTA en mélangeant 4 mL de 0,5 M EDTA (2 mM) et 996 mL de 1x PBS, pH = 7,4.
3. Préparez 250 mM de CaCl₂ en ajoutant 2,7745 g de CaCl₂ à 100 mL d’eau sans nucléases.
4. Préparez le tampon de digestion : Mélangez 50 μg/mL de libérase, 2,5 mM de CaCl₂ et 5 % de sérum fœtal bovin (FBS) dans du DMEM/F12.
5. Préparez le tampon FACS en mélangeant 488 ml de 1x PBS, 2 ml de 0,5M EDTA et 10 ml de FBS.
6. Préparez le tampon de viabilité en mélangeant le tampon FACS avec de l’iodure de propidium (PI ; 1 μg/mL).
7. Préparez le milieu de base en mélangeant du DMEM/F12 avec 5 % de FBS et 1 % (v/v) de stylo/streptocoque.
8. Préparez le milieu de prolifération en mélangeant le DMEM/F12 avec 10 % de FBS, 1 % (v/v) de stylo/streptocoque et 2,5 ng/mL de bFGF.
9. Préparer un milieu fibrogène en mélangeant un milieu basique et 10 ng/mL de rh-TGFβ1,
10. Préparez un milieu adipogénique (1x) en mélangeant DMEM/F12 avec 1% de pen/streptocoque et un supplément de différenciation adipogénique 10x de souris disponible dans le commerce.
11. Préparez 4 % de PFA en ajoutant 4 % de paraformaldéhyde (p/v) à 1 fois PBS.
12. Préparez 0,3 % de PBS-Triton en mélangeant 498,5 mL de 1x PBS et 1,5 mL de TritonX-100.
13. Préparez le tampon bloqueur d’âne en mélangeant 5 % (v/v) de sérum d’âne, 1 % de BSA (p/v) et 0,3 % de PBS-Triton.
14. Préparez le tampon de blocage Donkey + MOM en mélangeant 2,5 ml de tampon de blocage Donkey et 2 gouttes de bloc MOM.
15. Préparez la solution de coloration DAPI en mélangeant 600 nM de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans 1x PBS.

2. Prélèvement de tissus

1. Euthanasier l’animal conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux. Pour les souris épineuses, l’isoflurane suivi de CO₂ (20% du volume de la cage/min) et d’une luxation de la colonne vertébrale pour assurer la mort est recommandé.
2. Placez la souris sur la scène de dissection en position couchée et vaporisez abondamment d’éthanol à 70 % pour éviter la contamination par la fourrure de souris.
3. Faites une incision verticale de 2 à 3 cm au niveau de la ligne médiane ventrale et exposez la cage thoracique et le muscle abdominal. Coupez le muscle au niveau du processus xiphoïde avec des ciseaux à tissus et exposez le diaphragme. Coupez le diaphragme et la cage thoracique des deux côtés. À l’aide d’un hémostat, serrez et épluchez les côtes coupées.
4. Entaillez l’oreillette droite avec des ciseaux à tissus, placez une aiguille de 23 G attachée à une seringue de 20 ml dans l’apex du cœur et perfusez-la en injectant lentement 20 ml de PBS-EDTA de 2 mM.
5. Exciser le cœur, rincer à froid 1x PBS dans une boîte de Pétri de 60 mm sur de la glace, enlever les oreillettes et nettoyer le sang autant que possible.
6. Retirez la peau au-dessus de l’articulation du genou. Utilisez des pinces fines pour retirer le fascia et isolez le muscle quadriceps avec des ciseaux en utilisant le fémur comme guide. Placer dans une boîte de Pétri séparée avec du PBS froid.
7. Répétez l’étape 2.6 pour l’autre jambe.

3. Digestion des tissus

1. Ajoutez 2 ml de tampon de digestion dans un flacon de transport de 5 ml pour le cœur et 4 ml de tampon de digestion dans un tube de centrifugation de 15 ml pour deux muscles quadriceps.
2. Émincez le tissu avec des ciseaux à tissus sur le couvercle de la boîte de Pétri en morceaux de moins de 1 mm³ .
3. Ajoutez du tissu haché dans leurs tubes de digestion respectifs. Vortex pendant 2 s à basse vitesse pour mélanger.
4. Incuber à 37 °C en tournant doucement et en secouant.
5. Après 20 min, retirez les tubes du rotateur et laissez les morceaux de tissu se déposer. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette P1000 dans 20 ml de tampon FACS glacé dans des tubes à centrifuger de 50 ml.
6. Remplissez les tubes de digestion avec 2 ml et 4 ml de tampon de digestion pour la digestion cardiaque et musculaire respectivement, et remettez-les à 37 °C en les tournant doucement et en les secouant.
7. Répétez les étapes 3.5 à 3.6 une fois de plus après 20 minutes supplémentaires. Placez le surnageant dans le tube à centrifuger de 50 ml correspondant à l’étape 3.5.
8. Arrêtez la digestion après 60 minutes en trempant le tampon de digestion avec un tampon FACS glacé.
9. Filtrer la suspension de digestion et le surnageant à travers une crépine de 40 μm sur des tubes à centrifuger de 50 mL. Complétez jusqu’à 40 mL avec un tampon FACS.
10. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 8 min à 4 °C. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 3 mL de tampon de lyse ACK. Incuber sur glace pendant 5 min et compléter à 40 mL avec un tampon FACS.
11. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Décanter le surnageant.
12. Remettre en suspension dans 0,5 mL de tampon FACS, en pipetant de haut en bas pour s’assurer que les cellules sont uniformément dispersées.
13. Filtrez la suspension à travers un filtre de 40 μm sur des tubes en polystyrène à fond rond de 5 mL avec un capuchon de crépine à cellules.

4. Coloration pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

1. Pour les contrôles monochromes et de fluorescence moins un (FMO), préparez 30 μL de tampon de coloration (anticorps dilués dans un tampon FACS) à une concentration de travail x2x dans des tubes à centrifuger pré-marqués de 1,5 mL. Reportez-vous au tableau 1 pour la configuration du tampon de coloration des anticorps.
2. Préparez séparément les couleurs uniques et les commandes FMO pour le muscle et le cœur.
3. Transférez 30 μL de tampon de coloration monochrome et de contrôle FMO dans une plaque à 96 puits. Complétez avec 20 μL de tampon FACS.
4. Pour la coloration FACS de l’échantillon, préparer 0,5 mL de tampon de coloration (anticorps dilué dans un tampon FACS) à une concentration de travail x2 dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL.
5. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire dans les puits de contrôle monocolore et FMO. Ajoutez un tampon de coloration au reste de la suspension cellulaire et remettez-la en suspension.
6. Incuber à 4 °C, à l’abri de la lumière pendant 30 min.
7. Remplissez les puits avec 100 μL de tampon FACS et le tube d’échantillon avec 2 mL de tampon FACS.
8. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant.
9. Répétez les étapes 4.7 et 4.8.
10. Remettez en suspension la pastille de cellule dans le tampon de viabilité. 100 μL pour les contrôles monochromes et FMO, 1 mL pour le tri des échantillons FACS.
11. Préparez les tubes de collecte en ajoutant 300 μL de milieu de prolifération dans des tubes à centrifuger de 1,7 mL.

5. Tri cellulaire activé par fluorescence

1. Stratégie de contrôle : utilisez FSC vs. SSC (log) pour enlever les débris. Utiliser FSC-H vs. FSC-A à maillots de porte. Utiliser CD31 vs. PI pour se concentrer sur les cellules viables et négatives de lignée. Utilisez PDGFRα pour détecter les FAP (Figure 2).
2. Triez dans des tubes de collecte préalablement préparés.

6. Culture tissulaire

1. Centrifuger les cellules collectées à 800 x g pendant 10 min à 4 °C.
2. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette P1000. Veillez à ne pas déranger la pastille cellulaire.
3. Remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture (250 μL/puits) et ensemencer à 25k cellules/puits dans une plaque de culture tissulaire de 48 puits.
4. Culture en incubateur (37 °C, 5% CO₂). Changez de milieu tous les 3 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence.

7. Différenciation fibrogène

1. Une fois que les cellules sont prêtes à être traitées, placez le milieu de base et 1x DPBS dans un bain chaud ou à température ambiante avant de les utiliser.
2. Aspirer les milieux culturels.
3. Rincer deux fois avec 200 μL de 1x DPBS.
4. Rincer une fois avec 200 μL de produit de base.
5. Ajouter 250 μL de fluides fibrogènes ou basiques dans les puits respectifs.
6. Remettez les cellules dans l’incubateur (37 °C, 5 % CO₂).
7. Arrêtez la différenciation après 48 h.

8. Différenciation adipogénique

1. Une fois que les cellules sont prêtes à être traitées, placez les milieux de base, les milieux adipogènes et 1x DPBS dans un bain chaud ou à température ambiante avant de les utiliser.
2. Aspirer les milieux culturels.
3. Rincer deux fois avec 200 μL de 1x DPBS.
4. Rincer une fois avec 200 μL de produit de base.
5. Ajouter 400 μL de milieu adipogène ou basique dans les puits respectifs.
6. Retourner à l’incubateur (37°C, 5% CO₂).
7. Tous les 2 jours, prélever 200 μL de milieu à l’aide d’une pipette dans les puits et ajouter 200 μL de milieu adipogène ou basique frais.
8. Arrêter la différenciation le 6^ème jour pour les FAP du muscle squelettique, et le 14^ème jour pour les FAP cardiaques.

9. Immunomarquage

1. Arrêtez le test de différenciation en aspirant le milieu et en rinçant deux fois avec 250 μL de 1x PBS. Effectuez tous les lavages avec une aiguille de 18 g attachée à une seringue de 3 ml pour éviter le détachement des cellules.
2. Ajouter 250 μL de PFA à 4 % par puits et incuber à température ambiante pendant 7 min.
3. Retirez le PFA et rincez 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois avec 250 μL de 1x PBS.
4. Lors du dernier lavage, aspirez 1x PBS et ajoutez 250 μL de tampon de blocage Donkey + MOM.
5. Incuber à température ambiante pendant 60 min.
6. Préparer une solution primaire de coloration des anticorps dans un tampon bloquant l’âne (anti-SMA et anti-périlipine) pour un volume final de 100 μL par puits.
7. Aspirez les puits de coloration. Laissez bien le tampon de blocage Donkey + MOM en contrôle, le cas échéant.
8. Ajouter la solution de coloration primaire des anticorps dans les puits respectifs.
9. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
10. Le lendemain, lavez 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois avec 1x PBS.
11. Préparez une solution secondaire de coloration des anticorps dans un tampon de blocage d’âne avec un volume final de 100 μL par puits.
12. Aspirez le dernier lavage et ajoutez une solution de coloration d’anticorps secondaire dans tous les puits.
13. Incuber à température ambiante pendant 45 min (les échantillons doivent être protégés de la lumière à partir de ce moment).
14. Lavez 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois avec 1x PBS.
15. Aspirez le dernier lavage et ajoutez 250 μL de solution de coloration DAPI.
16. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
17. Retirez la solution de coloration DAPI et lavez une fois pendant 5 minutes avec 1x PBS.
18. Ajouter 100 μL de Fluoromount-G dans chaque puits.
19. Scellez la plaque avec le couvercle et le film de paraffine pour minimiser l’évaporation. Conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie.
20. Image au microscope (Figure 3 et Figure 4).
    REMARQUE : Le sérum d’âne est utilisé dans le tampon de blocage en tant que bloc spécifique à l’espèce contre les anticorps secondaires élevés par l’âne qui sont utilisés dans ce protocole. Le réactif bloquant souris sur souris est utilisé contre l’anticorps primaire anti-SMA qui est élevé chez la souris.

Résultats

Le schéma de ce protocole d’isolement et de culture des PAF musculaires squelettiques et cardiaques est résumé à la figure 1. Pour la collecte de tissus, le foie changeant de couleur du rouge foncé au jaune pâle est généralement indicatif d’une perfusion réussie. Avec les tranches d’âge spécifiées de la souris épineuse, le poids cardiaque est généralement d’environ 200 mg, tandis que le muscle quadriceps est d’environ 350 mg.

Discussion

Les tissus épineux de la souris sont plus sensibles aux stress de la dissociation des tissus, et plusieurs aspects de ce protocole visent à minimiser le stress pour améliorer la viabilité cellulaire. La technique de dissociation enzymatique en série est utilisée pour la préparation des échantillons afin d’abaisser la concentration de l’enzyme requise. Au fur et à mesure que la digestion enzymatique se poursuit, l’activité enzymatique diminue. En le remplaçant par des enz...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5