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Isolement, expansion et différenciation des progéniteurs fibro-adipogènes à partir du modèle de souris épineuses
Dans cet article
Résumé
Ce protocole décrit l’isolement des progéniteurs fibro-adipogéniques (FAP) du muscle squelettique et cardiaque de la souris épineuse (Acomys) par dissociation enzymatique et tri cellulaire activé par fluorescence. Les FAP obtenues à partir de ce protocole peuvent être efficacement étendues et différenciées en myofibroblastes et adipocytes.
Résumé
En raison de son programme de réparation exceptionnel, la souris épineuse est un modèle de recherche émergent pour la médecine régénérative. Les progéniteurs fibro-adipogènes sont des cellules tissulaires capables de se différencier en adipocytes, fibroblastes et chondrocytes. Les progéniteurs fibro-adipogènes sont fondamentaux pour orchestrer la régénération tissulaire car ils sont responsables du remodelage de la matrice extracellulaire après une blessure. Cette étude se concentre sur l’étude du rôle spécifique des progéniteurs fibro-adipogènes dans la réparation cardiaque et la régénération des muscles squelettiques de souris épineuses. À cette fin, un protocole a été optimisé pour la purification des progéniteurs fibro-adipogènes de souris épineuses par cytométrie en flux à partir de muscles squelettiques et cardiaques dissociés enzymatiquement. La population obtenue à partir de ce protocole est capable de s’étendre in vitro, et peut être différenciée en myofibroblastes et adipocytes. Ce protocole offre aux chercheurs un outil précieux pour examiner les propriétés distinctives de la souris épineuse et les comparer à la musculus musculus. Cela fournira des informations qui pourraient faire progresser la compréhension des mécanismes de régénération dans ce modèle intrigant.
Introduction
Initialement reconnue pour sa peau exceptionnellement fragile et sa remarquable capacité à réparer les lésions cutanées, la souris épineuse a démontré une capacité de régénération supérieure dans divers systèmes organiques, tels que l’appareil locomoteur, le rein, le système nerveux central et cardiovasculaire, par rapport au Mus musculus 1,2.
Les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) sont un sous-ensemble de cellules stromales qui résident dans divers tissus, y compris le muscle squelettique et cardiaque. Ces cellules possèdent une capacité ....
Protocole
Toutes les procédures d’entretien et d’expérimentation des animaux ont été effectuées conformément à l’approbation du comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique et aux règlements de l’Université de la Colombie-Britannique. Les animaux ont été logés dans une installation fermée exempte d’agents pathogènes dans des conditions standard (cycle lumière-obscurité 12:12, 21-23 °C et 40 à 60 % d’humidité) et ont reçu un régime de souris riche en protéines et de l’eau à volonté. Des souris Acomys dimidiatus femelles et mâles adultes (âgées de 4 à 6 mois, 50 à 60 g) ont été utilisées pour cette....
Résultats Représentatifs
Le schéma de ce protocole d’isolement et de culture des PAF musculaires squelettiques et cardiaques est résumé à la figure 1. Pour la collecte de tissus, le foie changeant de couleur du rouge foncé au jaune pâle est généralement indicatif d’une perfusion réussie. Avec les tranches d’âge spécifiées de la souris épineuse, le poids cardiaque est généralement d’environ 200 mg, tandis que le muscle quadriceps est d’environ 350 mg.
Discussion
Les tissus épineux de la souris sont plus sensibles aux stress de la dissociation des tissus, et plusieurs aspects de ce protocole visent à minimiser le stress pour améliorer la viabilité cellulaire. La technique de dissociation enzymatique en série est utilisée pour la préparation des échantillons afin d’abaisser la concentration de l’enzyme requise. Au fur et à mesure que la digestion enzymatique se poursuit, l’activité enzymatique diminue. En le remplaçant par des enz.......
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier Andy Johnson et Justin Wong, de l’équipe de base de l’UBC, pour leur expertise et leur aide à l’optimisation du protocole FACS, ainsi que le personnel de l’animalerie du Centre de recherche biomédicale de l’UBC pour les soins aux souris épineuses. La figure 1 a été réalisée à l’aide de Biorender. La figure 2 a été réalisée à l’aide du logiciel FlowJo.
....matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575–038 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 48 well flat-bottom tissue culture plate | Falcon | 53078 | |
| 5 mL polypropylene | Falcon | 352063 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Petri dish | Falcon | 353002 | |
| 96 well V-bottom tissue culture plate | Corning | 3894 | |
| Acomys dimidiatus mice (spiny mice) | kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky). | ||
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-perilipin (1:100) | Sigma | P1873 | |
| Anti-SMA (1:100) | Invitrogen | 14-9760-82 | |
| APC PDGFRa (1:800) | Abcam | ab270085 | |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G | BD | 305195 | |
| BD PrecisionGlide Needle 23 G | BD | 305145 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906-100g | |
| BV605 CD31 (1:500) | BD biosciences | 744359 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) | Invitrogen | A31570 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) | Invitrogen | A31573 | |
| Donkey serum | Sigma | S30-100ML | |
| FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers | Beckman coulter | B52102 | |
| Fetal bovine serum | Gemini | 100-500 | |
| Fine scissors | FST | 14058-11 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Forceps | FST | 11051-10 | |
| Hemostat | FST | 91308-12 | |
| human FGF-basic recombinant protein (bFGF) | Gibco | 13256029 | |
| Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) | eBiosciences | 14-8348-62 | |
| Incubator - Heracell 160i CO2 | ThermoFisher | 51033557 | |
| Inverted microscope - Revolve | ECHO | n/a | |
| Liberase | Roche | 5401127001 | |
| Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement | STEMCELL technologies | 5507 | |
| Mouse on mouse (MOM) blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648-500g | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140–122 | |
| PicoLab Mouse Diet 20 | LabDiet | 3005750-220 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Transport vial 5mL tube | Caplugs Evergreen | 222-3005-080 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 |
Références
- Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1 (2021).
- Sandoval, A. G. W., Maden, M.
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