Isolamento, espansione e differenziazione dei progenitori fibro-adipogenici dal modello murino spinoso

Riepilogo

Questo protocollo delinea l'isolamento di progenitori fibro-adipogenici (FAP) scheletrici e cardiaci da topi spinosi (Acomys) tramite dissociazione enzimatica e smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. I FAP ottenuti da questo protocollo possono essere efficacemente espansi e differenziati a miofibroblasti e adipociti.

Abstract

Grazie al suo eccezionale programma di riparazione, il topo spinoso è un modello di ricerca emergente per la medicina rigenerativa. I progenitori fibro-adipogenici sono cellule residenti nei tessuti che sono in grado di differenziarsi in adipociti, fibroblasti e condrociti. I progenitori fibro-adipogenici sono fondamentali per orchestrare la rigenerazione dei tessuti in quanto sono responsabili del rimodellamento della matrice extracellulare dopo una lesione. Questo studio si concentra sullo studio del ruolo specifico dei progenitori fibro-adipogenici nella riparazione cardiaca del topo spinoso e nella rigenerazione del muscolo scheletrico. A tal fine, è stato ottimizzato un protocollo per la purificazione di progenitori fibro-adipogenici spinosi di topo mediante citometria a flusso da muscolo scheletrico e cardiaco enzimaticamente dissociato. La popolazione ottenuta da questo protocollo è in grado di espandersi in vitro, e può essere differenziata in miofibroblasti e adipociti. Questo protocollo offre uno strumento prezioso ai ricercatori per esaminare le proprietà distintive del topo spinoso e per confrontarle con il Mus musculus. Ciò fornirà informazioni che potrebbero far progredire la comprensione dei meccanismi rigenerativi in questo intrigante modello.

Introduzione

Inizialmente riconosciuto per la sua pelle eccezionalmente fragile e la notevole capacità di riparare le lesioni cutanee, il topo spinoso ha dimostrato una capacità rigenerativa superiore in vari sistemi di organi, come muscoloscheletrico, renale, sistema nervoso centrale e cardiovascolare, rispetto al Mus musculus ^1,2.

I progenitori fibro-adipogenici (FAP) sono un sottoinsieme di cellule stromali che risiedono in vari tessuti, tra cui il muscolo scheletrico e cardiaco. Queste cellule possiedono una capacità unica di impegnarsi in linee fibrogeniche e adipogeniche in vivo e in vitro ^3,4. I FAP svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione tissutale modulando la matrice extracellulare e supportando le funzioni di altri tipi di cellule coinvolte nel processo di riparazione. Nel muscolo scheletrico, i FAP si attivano in risposta a una lesione e facilitano la differenziazione delle cellule staminali muscolari e la miogenesi ^5,6. Nella lesione ischemica del cuore, le FAP depongono tessuto cicatriziale per mantenere l'integrità del miocardio. A differenza dei muscoli, i FAP cardiaci si attivano cronicamente e contribuiscono al rimodellamento patologico ^7,8.

Studi precedenti hanno dimostrato che la matrice extracellulare spinosa del topo ha composizione, struttura e proprietà diverse che supportano la rigenerazione rispetto a Mus musculus ^9,10. Nelle lesioni muscolari e cardiache, è stato notato che i FAP contribuiscono a una guarigione superiore nel topo spinoso 11,12,13. Comprendere il comportamento e il controllo regolatorio dei FAP e dello stroma spinosi del topo può far luce sul meccanismo alla base delle loro capacità rigenerative. Sebbene i FAP siano ampiamente studiati in altri modelli animali, come nel mus musculus^14,15, attualmente non esistono protocolli pubblicati per isolare i FAP spinosi del topo. Lo sviluppo di un tale protocollo colmerebbe una lacuna significativa nel campo e consentirebbe ai ricercatori di esaminare i meccanismi cellulari e molecolari alla base del potenziale rigenerativo del topo spinoso.

Questo protocollo descrive un protocollo robusto e riproducibile per isolare, espandere e differenziare i FAP del muscolo scheletrico e cardiaco dal topo spinoso. Il protocollo qui descritto produce sospensioni di singole cellule di alta qualità adatte alla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Utilizzando rh-TGFβ1 o un terreno compatibile disponibile in commercio, due metodi ampiamente utilizzati per differenziare i FAP mus musculus ¹⁶, i FAP spinosi selezionati mantengono la loro capacità di differenziarsi lungo il lignaggio fibrogenico e il lignaggio adipogenico, rispettivamente (Figura 1).

Protocollo

Tutte le procedure di mantenimento e sperimentazione degli animali sono state condotte in conformità con l'approvazione del Comitato per la cura degli animali dell'Università della British Columbia e i regolamenti dell'Università della British Columbia. Gli animali sono stati alloggiati in una struttura chiusa priva di agenti patogeni in condizioni standard (ciclo luce-buio 12:12, 21-23 °C e livello di umidità del 40%-60%) e hanno ricevuto una dieta ricca di proteine per topi e acqua ad libitum. Per questo studio sono stati utilizzati topi adulti (da 4 a 6 mesi, 50-60 g) femmine e maschi di Acomys dimidiatus . I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione della soluzione e del tampone

1. Preparare 1x tampone fosfato soluzione salina (PBS).
2. Preparare PBS-EDTA miscelando 4 mL di 0,5 M EDTA (2 mM) e 996 mL di 1x PBS, pH = 7,4.
3. Preparare 250 mM di CaCl₂ aggiungendo 2,7745 g di CaCl₂ a 100 mL di acqua priva di nucleasi.
4. Preparare il tampone per la digestione: Mescolare 50 μg/mL di liberasi, 2,5 mM di CaCl₂ e il 5% di siero fetale bovino (FBS) in DMEM/F12.
5. Preparare il tampone FACS miscelando 488 mL di 1x PBS, 2 mL di EDTA 0,5M e 10 mL di FBS.
6. Preparare il tampone di vitalità mescolando il tampone FACS con lo ioduro di propidio (PI; 1 μg/mL).
7. Preparare i terreni di base mescolando DMEM/F12 con il 5% di FBS e l'1% (v/v) di penna/streptococco.
8. Preparare i terreni di proliferazione mescolando DMEM/F12 con il 10% di FBS, l'1% (v/v) di penna/streptococco e 2,5 ng/mL di bFGF.
9. Preparare i terreni fibrogenici mescolando terreni basici e 10 ng/mL di rh-TGFβ1,
10. Preparare terreni adipogenici (1x) mescolando DMEM/F12 con l'1% di penna/streptococco e un integratore di differenziazione adipogenica di topo 10x disponibile in commercio.
11. Preparare il 4% di PFA aggiungendo il 4% di paraformaldeide (p/v) a 1x PBS.
12. Preparare lo 0,3% di PBS-Triton mescolando 498,5 mL di 1x PBS e 1,5 mL di TritonX-100.
13. Preparare il tampone di blocco dell'asino mescolando il 5% (v/v) di siero d'asina, l'1% di BSA (p/v) e lo 0,3% di PBS-Tritone.
14. Preparare il tampone di blocco Donkey + MOM mescolando 2,5 ml di tampone di blocco Donkey e 2 gocce di blocco MOM.
15. Preparare la soluzione di colorazione DAPI mescolando 600 nM di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in 1x PBS.

2. Raccolta dei tessuti

1. Sopprimere l'animale seguendo le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali. Per i topi spinosi, si raccomanda l'isoflurano seguito da CO₂ (20% del volume della gabbia/min) e lussazione spinale per garantire la morte.
2. Posizionare il topo sul palco di dissezione in posizione supina e spruzzare accuratamente con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione con il pelo del topo.
3. Praticare un'incisione verticale di 2-3 cm sulla linea mediana ventrale ed esporre la gabbia toracica e il muscolo addominale. Tagliare il muscolo nel processo xifoideo con le forbici per tessuti ed esporre il diaframma. Tagliare il diaframma e la gabbia toracica su entrambi i lati. Usa un emostatico per bloccare e staccare le costole tagliate.
4. Intacca l'atrio destro con le forbici per fazzoletti, posiziona un ago da 23 G attaccato a una siringa da 20 ml all'apice del cuore e perfondilo iniettando lentamente 20 ml di pbs-EDTA da 2 mM.
5. Asportare il cuore, sciacquare 1x PBS freddo in una capsula di Petri da 60 mm con ghiaccio, rimuovere gli atri e pulire il sangue il più possibile.
6. Rimuovere la pelle sopra l'articolazione del ginocchio. Usa una pinza fine per rimuovere la fascia e isola il muscolo quadricipite con le forbici usando il femore come guida. Mettere in una capsula di Petri separata con 1x PBS freddo.
7. Ripetere il passaggio 2.6 per l'altra gamba.

3. Digestione dei tessuti

1. Aggiungere 2 ml di tampone digestivo a una fiala di trasporto da 5 ml per il cuore e 4 ml di tampone digestivo a una provetta da centrifuga da 15 ml per due muscoli quadricipiti.
2. Tritare il fazzoletto con le forbici per fazzoletti sul coperchio della capsula di Petri in³ pezzi più piccoli di 1 mm.
3. Aggiungere il tessuto macinato alle rispettive provette di digestione. Vortice per 2 s a bassa velocità per mescolare.
4. Incubare a 37 °C con rotazione delicata e agitazione.
5. Dopo 20 minuti, togliere le provette dal rotatore e lasciare che i pezzi di tessuto si depositino. Togliere il surnatante con una pipetta P1000 in 20 mL di tampone FACS ghiacciato in provette da centrifuga da 50 mL.
6. Rabboccare le provette di digestione con 2 mL e 4 mL di tampone di digestione per la digestione del cuore e dei muscoli e riposizionarle a 37 °C ruotando delicatamente e agitando.
7. Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6 un'altra volta dopo altri 20 minuti. Inserire il surnatante nella rispettiva provetta da centrifuga da 50 mL dal passaggio 3.5.
8. Interrompere la digestione dopo 60 minuti estinguendo il tampone di digestione con un tampone FACS ghiacciato.
9. Filtrare la sospensione di digestione e il surnatante attraverso un filtro cellulare da 40 μm sopra provette da centrifuga da 50 mL. Rabboccare fino a 40 ml con tampone FACS.
10. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 8 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di tampone di lisi ACK. Incubare con ghiaccio per 5 minuti e rabboccare fino a 40 mL con tampone FACS.
11. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C. Decantare il surnatante.
12. Risospendere in 0,5 mL di tampone FACS, pipettando verso l'alto e verso il basso per garantire che le cellule siano disperse in modo uniforme.
13. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 μm su provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL con tappo a filtro.

4. Colorazione per la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS)

1. Per i controlli a colore singolo e a fluorescenza meno uno (FMO), preparare 30 μL di tampone di colorazione (anticorpi diluiti in tampone FACS) a una concentrazione di lavoro 2x in provette da centrifuga da 1,5 mL pre-marcate. Fare riferimento alla Tabella 1 per l'impostazione del tampone di colorazione degli anticorpi.
2. Prepara separatamente i colori singoli e i controlli FMO per muscoli e cuore.
3. Trasferire 30 μl di tampone di colorazione monocolore e di controllo FMO su una piastra a 96 pozzetti. Rabboccare con 20 μl di tampone FACS.
4. Per la colorazione FACS del campione, preparare 0,5 mL di tampone di colorazione (anticorpo diluito in tampone FACS) a 2 volte la concentrazione di lavoro in provette da centrifuga da 1,5 mL.
5. Aggiungere 10 μl di sospensione cellulare ai pozzetti di controllo monocolore e FMO. Aggiungere il tampone di colorazione al resto della sospensione cellulare e risospendere.
6. Incubare a 4 °C, al riparo dalla luce per 30 min.
7. Rabboccare i pozzetti con 100 μL di tampone FACS e la provetta del campione con 2 mL di tampone FACS.
8. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere il surnatante.
9. Ripetere i passaggi 4.7 e 4.8.
10. Risospendere il pellet di cella nel tampone di vitalità. 100 μl per i controlli a colore singolo e FMO, 1 mL per i campioni di smistamento FACS.
11. Preparare le provette di raccolta aggiungendo 300 μl di terreno di proliferazione in provette da centrifuga da 1,7 mL.

5. Smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza

1. Strategia di gating: utilizzare FSC vs. SSC (registro) per rimuovere i detriti. Utilizzare FSC-H vs. FSC-A per le canottiere gate. Usa CD31 vs. PI per il gate su cellule vitali e negative al lignaggio. Utilizzare PDGFRα per il gate per i FAP (Figura 2).
2. Smistare in provette di raccolta precedentemente preparate.

6. Coltura tissutale

1. Centrifugare le celle raccolte a 800 x g per 10 minuti a 4 °C.
2. Rimuovere il surnatante con una pipetta P1000. Fare attenzione a non disturbare il pellet della cella.
3. Risospendere il pellet in terreno di coltura (250 μL/pozzetto) e seminare a 25k cellule/pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti.
4. Coltura in incubatore (37 °C, 5% CO₂). Cambiare i terreni ogni 3 giorni fino a quando le celle non raggiungono l'80% di confluenza.

7. Differenziamento fibrogenico

1. Una volta che le cellule sono pronte per essere trattate, posizionare il terreno di base e 1x DPBS in un bagno caldo o a temperatura ambiente prima di utilizzarle.
2. Aspirare i terreni di coltura.
3. Risciacquare due volte con 200 μl di 1x DPBS.
4. Risciacquare una volta con 200 μl di terreno basico.
5. Aggiungere 250 μl di terreno fibrogenico o basico ai rispettivi pozzetti.
6. Rimettere le cellule nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂).
7. Interrompere la differenziazione dopo 48 ore.

8. Differenziazione adipogenica

1. Una volta che le cellule sono pronte per essere trattate, posizionare i terreni di base, i terreni adipogenici e 1x DPBS in un bagno caldo o a temperatura ambiente prima di utilizzarli.
2. Aspirare i terreni di coltura.
3. Risciacquare due volte con 200 μl di 1x DPBS.
4. Risciacquare una volta con 200 μl di terreno basico.
5. Aggiungere 400 μl di terreno adipogenico o basico ai rispettivi pozzetti.
6. Riportare all'incubatrice (37°C, 5% CO₂).
7. Ogni 2 giorni, rimuovere 200 μL di terreno con una pipetta dai pozzetti e aggiungere 200 μL di terreno adipogenico o basico fresco.
8. Interrompere la differenziazione il 6^{° giorno per} le FAP del muscolo scheletrico e il 14^° giorno per le FAP cardiache.

9. Immunocolorazione

1. Arrestare il test di differenziazione aspirando il terreno e risciacquando due volte con 250 μl di 1x PBS. Eseguire tutti i lavaggi con l'ago da 18 G collegato alla siringa da 3 ml per evitare il distacco delle cellule.
2. Aggiungere 250 μl di PFA al 4% per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 7 minuti.
3. Rimuovere il PFA e risciacquare 3 volte per 5 minuti ogni volta con 250 μl di 1x PBS.
4. All'ultimo lavaggio, aspirare 1x PBS e aggiungere 250 μl di tampone bloccante Donkey + MOM.
5. Incubare a temperatura ambiente per 60 min.
6. Preparare la soluzione di colorazione primaria dell'anticorpo nel tampone bloccante Donkey (anti-SMA e anti-perilipina) per un volume finale di 100 μl per pozzetto.
7. Aspirare i pozzetti di colorazione. Lascia il buffer di blocco Donkey + MOM nel pozzetto di controllo, se applicabile.
8. Aggiungere la soluzione colorante primaria degli anticorpi nei rispettivi pozzetti.
9. Incubare a 4 °C per una notte.
10. Il giorno successivo, lavare 3 volte per 5 minuti ogni volta con 1x PBS.
11. Preparare la soluzione di colorazione secondaria degli anticorpi nel tampone bloccante Donkey con un volume finale di 100 μl per pozzetto.
12. Aspirare l'ultimo lavaggio e aggiungere la soluzione colorante secondaria di anticorpi in tutti i pozzetti.
13. Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti (i campioni devono essere protetti dalla luce da questo punto in poi).
14. Lavare 3 volte per 5 minuti ogni volta con 1x PBS.
15. Aspirare l'ultimo lavaggio e aggiungere 250 μl di soluzione colorante DAPI.
16. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
17. Rimuovere la soluzione colorante DAPI e lavare una volta per 5 minuti con 1x PBS.
18. Aggiungere 100 μl di Fluoromount-G in ogni pozzetto.
19. Sigillare la piastra con il coperchio e la pellicola di paraffina per ridurre al minimo l'evaporazione. Conservare a 4 °C, al riparo dalla luce fino all'imaging.
20. Immagine con un microscopio (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: Il siero d'asino viene utilizzato nel tampone di blocco come blocco specie-specifico contro gli anticorpi secondari allevati dall'asino che vengono utilizzati in questo protocollo. Il reagente bloccante top-on-mouse viene utilizzato contro l'anticorpo primario anti-SMA che viene sollevato nel topo.

Risultati

Lo schema di questo protocollo per isolare e coltivare il muscolo scheletrico e le FAP cardiache è riassunto nella Figura 1. Per la raccolta dei tessuti, il fegato che cambia colore dal rosso scuro al giallo pallido è solitamente indicativo di una perfusione riuscita. Con le fasce di età specificate del topo spinoso, il peso cardiaco è in genere di circa 200 mg, mentre il muscolo quadricipite è di circa 350 mg.

Durante ogni c...

Discussione

I tessuti spinosi del topo sono più sensibili agli stress nella dissociazione tissutale e ci sono diversi aspetti di questo protocollo volti a ridurre al minimo lo stress per migliorare la vitalità cellulare. La tecnica di dissociazione enzimatica seriale viene impiegata per la preparazione del campione per abbassare la concentrazione dell'enzima richiesto. Man mano che la digestione enzimatica procede, l'attività enzimatica diminuisce. Sostituendolo con enzimi freschi, è possibile o...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5