Выделение, экспансия и дифференцировка фиброадипогенных предшественников из модели колючей мыши

Резюме

Этот протокол описывает выделение фиброадипогенных предшественников (FAP) скелета и сердечной мышцы от колючей мыши (Acomys) с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. FAP, полученные по этому протоколу, могут быть эффективно расширены и дифференцированы до миофибробластов и адипоцитов.

Аннотация

Благодаря своей исключительной программе восстановления, колючая мышь является новой исследовательской моделью для регенеративной медицины. Фиброадипогенные предшественники представляют собой тканевые резидентные клетки, способные дифференцироваться в адипоциты, фибробласты и хондроциты. Фиброадипогенные предшественники имеют основополагающее значение для организации регенерации тканей, поскольку они отвечают за ремоделирование внеклеточного матрикса после травмы. Это исследование сосредоточено на изучении специфической роли фиброадипогенных предшественников в восстановлении сердца у колючих мышей и регенерации скелетных мышц. С этой целью был оптимизирован протокол для очистки фиброадипогенных предшественников колючих мышей методом проточной цитометрии из ферментативно диссоциированных скелетных и сердечных мышц. Популяция, полученная по этому протоколу, способна расширяться in vitro, и может быть дифференцирована до миофибробластов и адипоцитов. Этот протокол предлагает исследователям ценный инструмент для изучения отличительных свойств колючей мыши и сравнения их с мускулатурой. Это позволит получить понимание, которое может продвинуть понимание регенеративных механизмов в этой интригующей модели.

Введение

Первоначально признанная своей исключительно хрупкой кожей и замечательной способностью восстанавливать повреждения кожи, колючая мышь продемонстрировала превосходную регенеративную способность в различных системах органов, таких как опорно-двигательный аппарат, почки, центральная нервная система и сердечно-сосудистая система, по сравнению с Mus musculus ^1,2.

Фиброадипогенные предшественники (ФАП) представляют собой подмножество стромальных клеток, которые являются резидентами в различных тканях, включая скелетные и сердечные мышцы. Эти клетки обладают уникальной способностью связываться с фиброгенными и адипогенными линиями in vivo и in vitro ^3,4. FAP играют решающую роль в регенерации тканей, модулируя внеклеточный матрикс и поддерживая функции других типов клеток, участвующих в процессе восстановления. В скелетных мышцах FAP активируются в ответ на травму и способствуют дифференцировке мышечных стволовых клеток и миогенезу ^5,6. При ишемическом повреждении сердца ФАП закладывают рубцовую ткань для поддержания целостности миокарда. В отличие от мышечной, сердечные FAP становятся хронически активными и способствуют патологическому ремоделированию ^7,8.

Предыдущие исследования показали, что внеклеточный матрикс колючей мыши имеет другой состав, структуру и свойства, которые поддерживают регенерацию по сравнению с Mus musculus ^9,10. Было отмечено, что при мышечных и сердечных травмах FAP способствуют превосходному заживлению у колючих мышей 11,12,13. Понимание поведения и регуляторного контроля FAP и стромы колючих мышей может пролить свет на механизм, лежащий в основе их регенеративных способностей. В то время как FAP широко изучаются на других животных моделях, таких как mus musculus^14,15, в настоящее время нет опубликованных протоколов для выделения FAP у колючих мышей. Разработка такого протокола заполнила бы значительный пробел в этой области и позволила бы исследователям изучить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе регенеративного потенциала колючей мыши.

Этот протокол описывает надежный и воспроизводимый протокол для выделения, расширения и дифференциации FAP скелетных и сердечных мышц от колючей мыши. Описанный здесь протокол позволяет получить высококачественные суспензии одиночных клеток, пригодные для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Используя rh-TGFβ1 или совместимую коммерчески доступную среду, два метода, широко используемых для дифференциации mus musculus FAP¹⁶, отсортированные колючие FAP сохраняют свою способность к дифференцировке по фиброгенной линии и адипогенной линии соответственно (рис. 1).

протокол

Все процедуры содержания животных и эксперименты проводились в соответствии с одобрением Комитета по уходу за животными Университета Британской Колумбии и правилами Университета Британской Колумбии. Животные содержались в закрытом помещении, свободном от патогенов, в стандартных условиях (цикл свет-темнота 12:12, 21-23 °C и уровень влажности 40%-60%) и получали богатую белком мышиную диету и воду в неограниченном количестве. Для исследования были использованы взрослые (от 4 до 6 месяцев, 50-60 г) самки и самцы мышей Acomys dimidiatus . Подробная информация обо всех используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление раствора и буфера

1. Приготовьте 1x Фосфатный буферный раствор (PBS).
2. Приготовьте PBS-EDTA, смешав 4 мл 0,5 М ЭДТА (2 мМ) и 996 мл 1x PBS, pH = 7,4.
3. Приготовьте 250 мМ CaCl₂ , добавив 2,7745 г CaCl₂ к 100 мл воды, не содержащей нуклеаз.
4. Приготовьте буфер для пищеварения: смешайте 50 мкг/мл либеразы, 2,5 мМ CaCl₂ и 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в DMEM/F12.
5. Приготовьте буфер FACS, смешав 488 мл 1x PBS, 2 мл 0,5M EDTA и 10 мл FBS.
6. Приготовьте буфер жизнеспособности, смешав буфер FACS с йодидом пропидия (PI; 1 мкг/мл).
7. Приготовьте базовую среду, смешав DMEM/F12 с 5% FBS и 1% (v/v) пера/стрептококка.
8. Приготовьте пролиферативную среду, смешав DMEM/F12 с 10% FBS, 1% (v/v) pen/strepping и 2,5 нг/мл bFGF.
9. Приготовьте фиброгенную среду, смешав основные среды и 10 нг/мл rh-TGFβ1,
10. Приготовьте адипогенную среду (1x), смешав DMEM/F12 с 1% пер/стрептококком и коммерчески доступной добавкой для 10-кратной адипогенной дифференцировки мышей.
11. Приготовьте 4% PFA, добавив 4% параформальдегида (w/v) в 1x PBS.
12. Приготовьте 0,3% PBS-Triton, смешав 498,5 мл 1x PBS и 1,5 мл TritonX-100.
13. Приготовьте буфер для блокировки Donkey, смешав 5% (v/v) сыворотки Donkey, 1% BSA (w/v) и 0,3% PBS-Triton.
14. Приготовьте блокирующий буфер Donkey + MOM, смешав 2,5 мл блокирующего буфера Donkey и 2 капли блока MOM.
15. Приготовьте раствор для окрашивания DAPI, смешав 600 нМ 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в 1x PBS.

2. Забор тканей

1. Усыпьте животное в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных в учреждениях. Для колючих мышей рекомендуется изофлуран с последующим последующим выбросом_CO2 (20% объема клетки/мин) и вывихом позвоночника для обеспечения смерти.
2. Поместите мышь на ступень вскрытия в лежачем положении и тщательно распылите 70% этанол для предотвращения загрязнения шерсти мыши.
3. Сделайте вертикальный разрез на 2-3 см по вентральной средней линии и обнажите грудную клетку и мышцу живота. Разрежьте мышцу в области мечевидного отростка тканевыми ножницами и обнажите диафрагму. Разрежьте диафрагму и грудную клетку с обеих сторон. С помощью кровоостанавливателя зажмите и очистите срезанные ребра.
4. Проткните правое предсердие тканевыми ножницами, поместите иглу 23 G, прикрепленную к шприцу объемом 20 мл в верхушку сердца, и перфузируйте ее, медленно вводя 20 мл 2 мл 2 мМ PBS-EDTA.
5. Сердцевину исчерпать, прополоскать в холоде 1х ПБС в чашке Петри 60 мм на льду, удалить предсердия, и максимально очистить кровь.
6. Снимите кожу над коленным суставом. Используйте тонкие щипцы для удаления фасции и изолируйте четырехглавую мышцу ножницами, используя бедренную кость в качестве ориентира. Поместите в отдельную чашку Петри с холодным 1x PBS.
7. Повторите шаг 2.6 для другой ноги.

3. Пищеварение тканей

1. Добавьте 2 мл буфера для пищеварения в транспортный флакон объемом 5 мл для сердца и 4 мл буфера для пищеварения в центрифугу объемом 15 мл для двух четырехглавых мышц.
2. Измельчите ткань тканевыми ножницами на крышке чашки Петри на менее 1 мм³ штуки.
3. Добавьте измельченную салфетку в соответствующие пищеварительные трубки. Вихрь в течение 2 с на небольшой скорости для перемешивания.
4. Инкубировать при температуре 37 °C при осторожном вращении и встряхивании.
5. Через 20 минут снимите трубки с вращателя и дайте кусочкам ткани осесть. Извлеките надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000 в 20 мл ледяного буфера FACS в центрифужных пробирках объемом 50 мл.
6. Наполните пищеварительные трубки 2 мл и 4 мл буфера для пищеварения сердца и мышц соответственно и установите их обратно при температуре 37 °C с легким вращением и встряхиванием.
7. Повторите шаг с 3.5 по шаг 3.6 еще раз через 20 минут. Поместите надосадочную жидкость в соответствующую центрифужную пробирку объемом 50 мл, начиная с шага 3.5.
8. Остановите разложение через 60 минут, охладив буфер для разложения ледяным буфером FACS.
9. Фильтруйте взвесь и надосадочную жидкость через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм на вершине центрифужных пробирок объемом 50 мл. Долейте до 40 мл с помощью буфера FACS.
10. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 x g в течение 8 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 3 мл буфера для лизиса ACK. Инкубировать на льду в течение 5 минут и долить до 40 мл с буфером FACS.
11. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость.
12. Ресуспендируйте в 0,5 мл буфера FACS, пипетируя вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
13. Отфильтровать суспензию через фильтр 40 мкм на полистирольных трубках с круглым дном объемом 5 мл с крышкой из ячейки-фильтра.

4. Окрашивание для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS)

1. Для одноцветного и флуоресцентного контроля (FMO) приготовьте 30 мкл окрашивающего буфера (антитела, разведенные в буфере FACS) в 2-кратной рабочей концентрации в предварительно помеченных центрифужных пробирках объемом 1,5 мл. В таблице 1 приведена информация о настройке буфера для окрашивания антителами.
2. Подготовьте отдельные цвета и регуляторы FMO для мышц и сердца отдельно.
3. Перенесите 30 μL одноцветного и контрольного буфера для окрашивания FMO на 96-луночный планшет. Долейте 20 μL буфера FACS.
4. Для окрашивания образца методом FACS приготовьте 0,5 мл окрашивающего буфера (антитело, разведенное в буфере FACS) в 2-кратной рабочей концентрации в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
5. Добавьте 10 мкл суспензии ячеек в одноцветные и контрольные лунки FMO. Добавьте буфер для окрашивания к остальной суспензии клеток и повторите.
6. Инкубировать при температуре 4 °C в защищенном от света месте в течение 30 минут.
7. Долейте в лунки 100 мкл буфера FACS, а пробирку с образцом — 2 мл буфера FACS.
8. Центрифугируйте при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
9. Повторите шаги 4.7 и 4.8.
10. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере жизнеспособности. 100 мкл для одноцветных и FMO-регуляторов, 1 мл для сортировки образцов FACS.
11. Подготовьте пробирки для сбора, добавив 300 мкл пролиферационной среды в центрифужные пробирки объемом 1,7 мл.

5. Сортировка клеток, активируемых флуоресценцией

1. Стратегия стробирования: используйте FSC против SSC (бревно) для удаления мусора. Используйте FSC-H в сравнении. FSC-A для синглетов ворот. Используйте CD31 по сравнению с ПИ для гейта на жизнеспособных и линейно-отрицательных клетках. Используйте PDGFRα для гейта для FAP (рис. 2).
2. Отсортируйте по заранее подготовленным пробиркам для сбора.

6. Культура тканей

1. Центрифугируйте собранные клетки при давлении 800 x g в течение 10 мин при 4 °C.
2. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000. Будьте осторожны, чтобы не потревожить клеточную гранулу.
3. Ресуспендируйте гранулу в питательных средах (250 μл/лунку) и затравите при 25 тыс. клеток/лунку в 48-луночном планшете для культивирования тканей.
4. Культура в инкубаторе (37 °C, 5%_СО2). Меняйте среду каждые 3 дня до тех пор, пока клетки не достигнут 80% конфлюенции.

7. Фиброгенная дифференцировка

1. Как только клетки будут готовы к обработке, поместите основные среды и 1x DPBS в теплую ванну или при комнатной температуре перед их использованием.
2. Отсасывайте питательные среды.
3. Промойте 200 мкл 1x DPBS дважды.
4. Промойте 200 мкл основного средства один раз.
5. Добавьте 250 μL фиброгенной или основной среды в соответствующие лунки.
6. Верните клетки в инкубатор (37 °C, 5%_CO2).
7. Прекратите дифференцировку через 48 ч.

8. Адипогенная дифференцировка

1. Как только клетки будут готовы к обработке, поместите основные среды, адипогенные среды и 1x DPBS в теплую ванну или при комнатной температуре перед их использованием.
2. Отсасывайте питательные среды.
3. Промойте 200 мкл 1x DPBS дважды.
4. Промойте 200 мкл основного средства один раз.
5. Добавьте в соответствующие лунки 400 μл адипогенных или основных сред.
6. Возврат в инкубатор (37°C, 5%_CO2).
7. Каждые 2 дня удаляйте пипеткой 200 мкл среды из лунок и добавляйте 200 мкл свежей адипогенной или основной среды.
8. Прекратите дифференцировку на^6-й день для ФАП скелетных мышц и на^14-й день для сердечных ФАПов.

9. Иммуноокрашивание

1. Остановите дифференцировочный анализ, аспирационировав среду и промыв 250 мкл 1x PBS дважды. Выполняйте все промывки с помощью иглы 18 G, прикрепленной к шприцу объемом 3 мл, чтобы избежать отслоения клеток.
2. Добавьте 250 μл 4% PFA на лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 7 минут.
3. Удалите PFA и промойте 3 раза в течение 5 минут каждый раз 250 мкл 1x PBS.
4. На последней промывке аспирируйте 1x PBS и добавьте 250 μL буфера для блокировки Donkey + MOM.
5. Выдерживать при комнатной температуре в течение 60 минут.
6. Приготовьте первичный раствор для окрашивания антител в блокирующем буфере Donkey (анти-SMA и анти-перилипин) для конечного объема 100 мкл на лунку.
7. Отсасывайте из окрашивающих лунок. Оставьте буфер блокировки Donkey + MOM под контролем, если это возможно.
8. Добавьте раствор первичного окрашивания антител в соответствующие лунки.
9. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
10. На следующий день умыться 3 раза по 5 минут каждый раз с 1x PBS.
11. Приготовьте раствор для вторичного окрашивания антител в блокирующем буфере Donkey с конечным объемом 100 мкл на лунку.
12. Отсадите последнюю промывку и добавьте во все лунки вторичный раствор для окрашивания антител.
13. Инкубировать при комнатной температуре в течение 45 минут (с этого момента образцы должны быть защищены от света).
14. Стирайте 3 раза по 5 минут каждый раз с 1x PBS.
15. Отсадите последнюю стирку и добавьте 250 мкл раствора для окрашивания DAPI.
16. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
17. Удалите раствор для окрашивания DAPI и постирайте один раз в течение 5 минут 1x PBS.
18. Добавьте по 100 мкл Fluoromount-G в каждую лунку.
19. Закройте тарелку крышкой и парафиновой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до момента визуализации.
20. Изображение с помощью микроскопа (рисунок 3 и рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка Donkey используется в блокирующем буфере в качестве видоспецифичного блока против вторичных антител, поднятых Donkey Raised, которые используются в этом протоколе. Реагент, блокирующий мышь-мышь, используется против первичного антитела против СМА, которое вырабатывается у мыши.

Результаты

Схема этого протокола для выделения и культивирования FAP скелетных мышц и сердца представлена на рисунке 1. При заборе тканей изменение цвета печени с темно-красного на бледно-желтый обычно свидетельствует об успешной перфузии. В указанных возрастных ...

Обсуждение

Колючие ткани мышей более чувствительны к стрессам при диссоциации тканей, и существует несколько аспектов этого протокола, направленных на минимизацию стресса для улучшения жизнеспособности клеток. Метод серийной ферментативной диссоциации используется для подг?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5