Выделение, экспансия и дифференцировка фиброадипогенных предшественников из модели колючей мыши

Резюме

Этот протокол описывает выделение фиброадипогенных предшественников (FAP) скелета и сердечной мышцы от колючей мыши (Acomys) с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. FAP, полученные по этому протоколу, могут быть эффективно расширены и дифференцированы до миофибробластов и адипоцитов.

Аннотация

Благодаря своей исключительной программе восстановления, колючая мышь является новой исследовательской моделью для регенеративной медицины. Фиброадипогенные предшественники представляют собой тканевые резидентные клетки, способные дифференцироваться в адипоциты, фибробласты и хондроциты. Фиброадипогенные предшественники имеют основополагающее значение для организации регенерации тканей, поскольку они отвечают за ремоделирование внеклеточного матрикса после травмы. Это исследование сосредоточено на изучении специфической роли фиброадипогенных предшественников в восстановлении сердца у колючих мышей и регенерации скелетных мышц. С этой целью был оптимизирован протокол для очистки фиброадипогенных предшественников колючих мышей методом проточной цитометрии из ферментативно диссоциированных скелетных и сердечных мышц. Популяция, полученная по этому протоколу, способна расширяться in vitro, и может быть дифференцирована до миофибробластов и адипоцитов. Этот протокол предлагает исследователям ценный инструмент для изучения отличительных свойств колючей мыши и сравнения их с мускулатурой. Это позволит получить понимание, которое может продвинуть понимание регенеративных механизмов в этой интригующей модели.

Введение

Первоначально признанная своей исключительно хрупкой кожей и замечательной способностью восстанавливать повреждения кожи, колючая мышь продемонстрировала превосходную регенеративную способность в различных системах органов, таких как опорно-двигательный аппарат, почки, центральная нервная система и сердечно-сосудистая система, по сравнению с Mus musculus ^1,2.

Фиброадипогенные предшественники (ФАП) представляют собой подмножество стромальных клеток, которые являются резидентами в различных тканях, включая скелетные и сердечные мышцы. Эти кле....

протокол

Все процедуры содержания животных и эксперименты проводились в соответствии с одобрением Комитета по уходу за животными Университета Британской Колумбии и правилами Университета Британской Колумбии. Животные содержались в закрытом помещении, свободном от патогенов, в стандартных условиях (цикл свет-темнота 12:12, 21-23 °C и уровень влажности 40%-60%) и получали богатую белком мышиную диету и воду в неограниченном количестве. Для исследования были использованы взрослые (от 4 до 6 месяцев, 50-60 г) самки и самцы мышей Acomys dimidiatus . Подробная информация обо всех используемых реагентах и оборудовании приведена в

Результаты

Схема этого протокола для выделения и культивирования FAP скелетных мышц и сердца представлена на рисунке 1. При заборе тканей изменение цвета печени с темно-красного на бледно-желтый обычно свидетельствует об успешной перфузии. В указанных возрастных .......

Обсуждение

Колючие ткани мышей более чувствительны к стрессам при диссоциации тканей, и существует несколько аспектов этого протокола, направленных на минимизацию стресса для улучшения жизнеспособности клеток. Метод серийной ферментативной диссоциации используется для подг?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5