Isolamento, expansão e diferenciação de progenitores fibroadipogênicos do modelo de camundongo espinhoso

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência. As FAPs obtidas a partir deste protocolo podem ser efetivamente expandidas e diferenciadas para miofibroblastos e adipócitos.

Resumo

Devido ao seu programa de reparo excepcional, o rato espinhoso é um modelo de pesquisa emergente para a medicina regenerativa. Os progenitores fibroadipogênicos são células residentes no tecido que são capazes de se diferenciar em adipócitos, fibroblastos e condrócitos. Os progenitores fibroadipogênicos são fundamentais para orquestrar a regeneração tecidual, pois são responsáveis pela remodelação da matriz extracelular após a lesão. Este estudo se concentra em investigar o papel específico dos progenitores fibroadipogênicos no reparo cardíaco de camundongos espinhosos e na regeneração do músculo esquelético. Para este fim, um protocolo foi otimizado para a purificação de progenitores fibroadipogênicos de camundongos espinhosos por citometria de fluxo do músculo esquelético e cardíaco enzimaticamente dissociado. A população obtida a partir deste protocolo é capaz de se expandir in vitro, podendo ser diferenciada em miofibroblastos e adipócitos. Este protocolo oferece uma ferramenta valiosa para os pesquisadores examinarem as propriedades distintas do rato espinhoso e compará-las com o Mus musculus. Isso fornecerá insights que podem avançar na compreensão dos mecanismos regenerativos neste modelo intrigante.

Introdução

Inicialmente reconhecido por sua pele excepcionalmente frágil e notável capacidade de reparar lesões cutâneas, o camundongo espinhoso demonstrou capacidade regenerativa superior em vários sistemas orgânicos, como musculoesquelético, renal, sistema nervoso central e cardiovascular, quando comparado ao Mus musculus ^1,2.

Os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) são um subconjunto de células estromais que residem em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético e cardíaco. Essas células possuem uma capacidade única de se comprometer com linha....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e de manutenção animal foram conduzidos de acordo com a aprovação do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Colúmbia Britânica e os regulamentos da Universidade da Colúmbia Britânica. Os animais foram alojados em uma instalação fechada livre de patógenos sob condições padrão (ciclo claro-escuro 12:12, 21-23 ° C e nível de umidade de 40% a 60%) e forneceram uma dieta rica em proteínas e água ad libitum. Camundongos Acomys dimidiatus adultos (4 a 6 meses de idade, 50-60 g) fêmeas e machos foram utilizados para este estudo. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos ....

Discussão

Os tecidos espinhosos de camundongos são mais sensíveis às tensões na dissociação do tecido, e existem vários aspectos desse protocolo que visam minimizar o estresse para melhorar a viabilidade celular. A técnica de dissociação enzimática serial é empregada para a preparação de amostras para diminuir a concentração da enzima necessária. À medida que a digestão enzimática prossegue, a atividade enzimática diminui. Ao substituí-lo por enzimas frescas, a atividade enzi.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5