Isolamento, expansão e diferenciação de progenitores fibroadipogênicos do modelo de camundongo espinhoso

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência. As FAPs obtidas a partir deste protocolo podem ser efetivamente expandidas e diferenciadas para miofibroblastos e adipócitos.

Resumo

Devido ao seu programa de reparo excepcional, o rato espinhoso é um modelo de pesquisa emergente para a medicina regenerativa. Os progenitores fibroadipogênicos são células residentes no tecido que são capazes de se diferenciar em adipócitos, fibroblastos e condrócitos. Os progenitores fibroadipogênicos são fundamentais para orquestrar a regeneração tecidual, pois são responsáveis pela remodelação da matriz extracelular após a lesão. Este estudo se concentra em investigar o papel específico dos progenitores fibroadipogênicos no reparo cardíaco de camundongos espinhosos e na regeneração do músculo esquelético. Para este fim, um protocolo foi otimizado para a purificação de progenitores fibroadipogênicos de camundongos espinhosos por citometria de fluxo do músculo esquelético e cardíaco enzimaticamente dissociado. A população obtida a partir deste protocolo é capaz de se expandir in vitro, podendo ser diferenciada em miofibroblastos e adipócitos. Este protocolo oferece uma ferramenta valiosa para os pesquisadores examinarem as propriedades distintas do rato espinhoso e compará-las com o Mus musculus. Isso fornecerá insights que podem avançar na compreensão dos mecanismos regenerativos neste modelo intrigante.

Introdução

Inicialmente reconhecido por sua pele excepcionalmente frágil e notável capacidade de reparar lesões cutâneas, o camundongo espinhoso demonstrou capacidade regenerativa superior em vários sistemas orgânicos, como musculoesquelético, renal, sistema nervoso central e cardiovascular, quando comparado ao Mus musculus ^1,2.

Os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) são um subconjunto de células estromais que residem em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético e cardíaco. Essas células possuem uma capacidade única de se comprometer com linhagens fibrogênicas e adipogênicas in vivo e in vitro ^3,4. As FAPs desempenham um papel crucial na regeneração tecidual, modulando a matriz extracelular e apoiando as funções de outros tipos de células envolvidas no processo de reparo. No músculo esquelético, as PAFs são ativadas em resposta à lesão e facilitam a diferenciação e a miogênese das células-tronco musculares ^5,6. Na lesão isquêmica do coração, as FAPs estabelecem tecido cicatricial para manter a integridade do miocárdio. Em contraste com o músculo, as PAFs cardíacas tornam-se cronicamente ativadas e contribuem para o remodelamento patológico ^7,8.

Estudos anteriores demonstraram que a matriz extracelular de camundongo espinhoso tem composição, estrutura e propriedades diferentes que suportam a regeneração em comparação com Mus musculus ^9,10. Em lesões musculares e cardíacas, observou-se que as PAFs contribuem para a cicatrização superior em camundongos espinhosos 11,12,13. Compreender o comportamento e o controle regulatório de FAPs e estroma de camundongos espinhosos pode lançar luz sobre o mecanismo por trás de suas capacidades regenerativas. Embora as FAPs sejam extensivamente estudadas em outros modelos animais, como em mus musculus^14,15, atualmente, não há protocolos publicados para isolar FAPs de camundongos espinhosos. O desenvolvimento de tal protocolo preencheria uma lacuna significativa no campo e permitiria aos pesquisadores examinar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao potencial regenerativo do camundongo espinhoso.

Este protocolo descreve um protocolo robusto e reprodutível para isolar, expandir e diferenciar FAPs do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos. O protocolo descrito aqui produz suspensões de célula única de alta qualidade que são adequadas para classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Utilizando rh-TGFβ1 ou um meio compatível disponível comercialmente, dois métodos amplamente utilizados para diferenciar FAPs mus musculus ¹⁶, as FAPs espinhosas classificadas mantêm sua capacidade de se diferenciar ao longo da linhagem fibrogênica e adipogênica, respectivamente (Figura 1).

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e de manutenção animal foram conduzidos de acordo com a aprovação do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Colúmbia Britânica e os regulamentos da Universidade da Colúmbia Britânica. Os animais foram alojados em uma instalação fechada livre de patógenos sob condições padrão (ciclo claro-escuro 12:12, 21-23 ° C e nível de umidade de 40% a 60%) e forneceram uma dieta rica em proteínas e água ad libitum. Camundongos Acomys dimidiatus adultos (4 a 6 meses de idade, 50-60 g) fêmeas e machos foram utilizados para este estudo. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da solução e do tampão

1. Prepare 1x tampão fosfato salino (PBS).
2. Prepare PBS-EDTA misturando 4 mL de EDTA 0,5 M (2 mM) e 996 mL de 1x PBS, pH = 7,4.
3. Prepare 250 mM de CaCl₂ adicionando 2,7745 g de CaCl₂ a 100 mL de água livre de nuclease.
4. Prepare o tampão de digestão: Misture 50 μg / mL liberase, 2,5 mM CaCl₂ e 5% de soro fetal bovino (FBS) em DMEM / F12.
5. Prepare o tampão FACS misturando 488 mL de 1x PBS, 2 mL de EDTA 0,5M e 10 mL de FBS.
6. Prepare o tampão de viabilidade misturando o tampão FACS com iodeto de propídio (PI; 1 μg/mL).
7. Prepare a mídia básica misturando DMEM/F12 com 5% de FBS e 1% (v/v) de caneta/estreptococo.
8. Prepare meios de proliferação misturando DMEM / F12 com 10% de FBS, 1% (v / v) de caneta / estreptococo e 2,5 ng / mL de bFGF.
9. Prepare meios fibrogênicos misturando meios básicos e 10 ng/mL rh-TGFβ1,
10. Prepare meios adipogênicos (1x) misturando DMEM/F12 com caneta/estreptococo a 1% e um suplemento de diferenciação adipogênica de camundongo 10x disponível comercialmente.
11. Prepare 4% de PFA adicionando 4% de paraformaldeído (p / v) a 1x PBS.
12. Prepare 0,3% de PBS-Triton misturando 498,5 mL de 1x PBS e 1,5 mL de TritonX-100.
13. Prepare o tampão de bloqueio Donkey misturando 5% (v / v) de soro Donkey, 1% BSA (p / v) e 0,3% PBS-Triton.
14. Prepare o tampão de bloqueio Donkey + MOM misturando 2,5 mL de tampão de bloqueio Donkey e 2 gotas de bloco MOM.
15. Prepare a solução de coloração DAPI misturando 600 nM de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em 1x PBS.

2. Coleta de tecidos

1. Eutanasiar o animal seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Para camundongos espinhosos, recomenda-se isoflurano seguido de CO₂ (20% do volume da gaiola/min) e luxação da coluna vertebral para garantir a morte.
2. Coloque o mouse no estágio de dissecção em decúbito dorsal e borrife bem com etanol a 70% para evitar a contaminação com o pelo do camundongo.
3. Faça uma incisão vertical de 2-3 cm na linha média ventral e exponha a caixa torácica e o músculo abdominal. Corte o músculo no processo xifóide com uma tesoura de tecido e exponha o diafragma. Corte o diafragma e a caixa torácica em ambos os lados. Use um hemostático para prender e descascar as costelas cortadas.
4. Corte o átrio direito com uma tesoura de tecido, coloque uma agulha de 23 G presa a uma seringa de 20 mL no ápice do coração e perfunda-a injetando lentamente 20 mL de 2 mM PBS-EDTA.
5. Extirpar o coração, enxaguar em frio 1x PBS em uma placa de Petri de 60 mm no gelo, remover átrios e limpar o sangue o máximo possível.
6. Remova a pele acima da articulação do joelho. Use uma pinça fina para remover a fáscia e isole o músculo quadríceps com uma tesoura usando o fêmur como guia. Coloque em uma placa de Petri separada com PBS 1x frio.
7. Repita o passo 2.6 para a outra perna.

3. Digestão tecidual

1. Adicione 2 mL de tampão de digestão a um frasco de transporte de 5 mL para o coração e 4 mL de tampão de digestão a um tubo de centrífuga de 15 mL para dois músculos quadríceps.
2. Pique o tecido com uma tesoura de tecido na tampa da placa de Petri em pedaços menores que 1 mm^{e 3} .
3. Adicione tecido picado aos seus respectivos tubos de digestão. Vórtice por 2 s em baixa velocidade para misturar.
4. Incubar a 37 °C com rotação suave e agitação.
5. Após 20 minutos, retire os tubos do rotador e deixe os pedaços de tecido assentarem. Retire o sobrenadante com uma pipeta P1000 em 20 mL de tampão FACS gelado em tubos de centrífuga de 50 mL.
6. Encha os tubos de digestão com 2 mL e 4 mL de tampão de digestão para digestão cardíaca e muscular, respectivamente, e coloque-os de volta a 37 ° C com rotação suave e agitação.
7. Repita as etapas 3.5 a 3.6 mais uma vez após 20 minutos. Coloque o sobrenadante no respectivo tubo de centrífuga de 50 mL da etapa 3.5.
8. Pare a digestão após 60 minutos temperando o tampão de digestão com tampão FACS gelado.
9. Filtrar a suspensão de digestão e o sobrenadante através de um filtro de células de 40 μm sobre tubos de centrifugação de 50 ml. Complete até 40 mL com tampão FACS.
10. Centrifugue a suspensão da célula a 500 x g durante 8 min a 4 °C. Transvase o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 3 ml de tampão de lise ACK. Incube no gelo por 5 min e complete até 40 mL com tampão FACS.
11. Centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante.
12. Ressuspenda em 0,5 mL de tampão FACS, pipetando para cima e para baixo para garantir que as células sejam dispersas uniformemente.
13. Filtrar a suspensão através de um filtro de 40 μm em tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml com uma tampa do filtro de células.

4. Coloração para classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)

1. Para controles de cor única e fluorescência menos um (FMO), prepare 30 μL de tampão de coloração (anticorpos diluídos em tampão FACS) em concentração de trabalho 2x em tubos de centrífuga pré-marcados de 1,5 mL. Consulte a Tabela 1 para configuração do tampão de coloração de anticorpos.
2. Prepare cores únicas e controles FMO para músculos e coração separadamente.
3. Transfira 30 μL de tampão de coloração de cor única e controle FMO para uma placa de 96 poços. Complete com 20 μL de tampão FACS.
4. Para coloração FACS de amostra, prepare 0,5 mL de tampão de coloração (anticorpo diluído em tampão FACS) na concentração de trabalho 2x em tubos de centrífuga de 1,5 mL.
5. Adicione 10 μL da suspensão celular aos poços de controle de cor única e FMO. Adicione tampão de coloração ao resto da suspensão celular e ressuspenda.
6. Incubar a 4 °C, protegido da luz durante 30 min.
7. Encha os poços com 100 μL de tampão FACS e o tubo de amostra com 2 mL de tampão FACS.
8. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante.
9. Repita as etapas 4.7 e 4.8.
10. Ressuspenda o pellet celular no tampão de viabilidade. 100 μL para controles de cor única e FMO, 1 mL para amostras de classificação FACS.
11. Prepare os tubos de coleta adicionando 300 μL de meios de proliferação em tubos de centrífuga de 1,7 mL.

5. Classificação de células ativadas por fluorescência

1. Estratégia de gating: Use FSC vs. SSC (log) para remover detritos. Use FSC-H vs. FSC-A para portar camisetas. Use CD31 vs. PI para portar células viáveis e de linhagem negativa. Use PDGFRα para portar FAPs (Figura 2).
2. Separe em tubos de coleta previamente preparados.

6. Cultura de tecidos

1. Centrifugar as células recolhidas a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
2. Remova o sobrenadante com uma pipeta P1000. Tenha cuidado para não perturbar o pellet celular.
3. Ressuspenda o pellet em meio de cultura (250 μL/poço) e semeie a 25k células/poço em uma placa de cultura de tecidos de 48 poços.
4. Cultura em incubadora (37 °C, 5% CO₂). Troque o meio a cada 3 dias até que as células atinjam 80% de confluência.

7. Diferenciação fibrogênica

1. Quando as células estiverem prontas para serem tratadas, coloque o meio básico e 1x DPBS em um banho quente ou em temperatura ambiente antes de usá-los.
2. Aspirar os meios de cultura.
3. Enxágue com 200 μL de 1x DPBS duas vezes.
4. Enxágue com 200 μL de meio básico uma vez.
5. Adicionar 250 μL de meio fibrogênico ou básico aos respectivos poços.
6. Retorne as células para a incubadora (37 °C, 5% CO₂).
7. Pare a diferenciação após 48 h.

8. Diferenciação adipogênica

1. Quando as células estiverem prontas para serem tratadas, coloque meios básicos, meios adipogênicos e 1x DPBS em um banho quente ou em temperatura ambiente antes de usá-los.
2. Aspirar os meios de cultura.
3. Enxágue com 200 μL de 1x DPBS duas vezes.
4. Enxágue com 200 μL de meio básico uma vez.
5. Adicione 400 μL de meio adipogênico ou básico aos respectivos poços.
6. Retorno à incubadora (37°C, 5% CO₂).
7. A cada 2 dias, remova 200 μL de meio com uma pipeta dos poços e adicione 200 μL de meio adipogênico ou básico fresco.
8. Pare a diferenciação no^6º dia para FAPs do músculo esquelético e no^14º dia para FAPs cardíacas.

9. Imunocoloração

1. Pare o ensaio de diferenciação aspirando o meio e enxaguando com 250 μL de 1x PBS duas vezes. Realize todas as lavagens com agulha de 18 G acoplada a uma seringa de 3 mL para evitar o descolamento das células.
2. Adicione 250 μL de 4% de PFA por poço e incube em temperatura ambiente por 7 min.
3. Remova o PFA e enxágue 3 vezes por 5 min de cada vez com 250 μL de 1x PBS.
4. Na última lavagem, aspire 1x PBS e adicione 250 μL de tampão bloqueador Donkey + MOM.
5. Incubar à temperatura ambiente durante 60 min.
6. Preparar a solução de coloração de anticorpos primários em tampão de bloqueio de burro (anti-SMA e anti-perilipina) para um volume final de 100 μL por alvéolo.
7. Aspire os poços de coloração. Deixe o buffer de bloqueio Donkey + MOM no controle, se aplicável.
8. Adicione a solução de coloração de anticorpos primários nos respectivos poços.
9. Incubar a 4 °C durante a noite.
10. No dia seguinte, lave 3 vezes por 5 minutos de cada vez com 1x PBS.
11. Preparar a solução de coloração de anticorpos secundários em tampão de bloqueio de burro com um volume final de 100 μL por alvéolo.
12. Aspire a última lavagem e adicione solução secundária de coloração de anticorpos em todos os poços.
13. Incubar à temperatura ambiente durante 45 min (as amostras devem ser protegidas da luz a partir deste ponto).
14. Lave 3 vezes por 5 min de cada vez com 1x PBS.
15. Aspirar a última lavagem e adicionar 250 μL de solução de coloração DAPI.
16. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
17. Remova a solução de coloração DAPI e lave uma vez por 5 min com 1x PBS.
18. Adicione 100 μL de Fluoromount-G em cada poço.
19. Sele a placa com a tampa e o filme de parafina para minimizar a evaporação. Conservar a 4 °C, protegido da luz até à obtenção de imagens.
20. Imagem com microscópio (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: O soro de burro é usado no tampão de bloqueio como um bloqueio específico da espécie contra os anticorpos secundários criados pelo burro que são usados neste protocolo. O reagente de bloqueio de mouse contra mouse é usado contra o anticorpo primário anti-SMA que é criado no camundongo.

Resultados

O esquema para este protocolo de isolamento e cultura de FAPs do músculo esquelético e cardíaco está resumido na Figura 1. Para a coleta de tecidos, a mudança de cor do fígado de vermelho escuro para amarelo pálido geralmente é indicativa de uma perfusão bem-sucedida. Com as faixas etárias especificadas do camundongo espinhoso, os pesos do coração são normalmente em torno de 200 mg, enquanto o músculo quadríceps é de cerca de 350 mg.

Discussão

Os tecidos espinhosos de camundongos são mais sensíveis às tensões na dissociação do tecido, e existem vários aspectos desse protocolo que visam minimizar o estresse para melhorar a viabilidade celular. A técnica de dissociação enzimática serial é empregada para a preparação de amostras para diminuir a concentração da enzima necessária. À medida que a digestão enzimática prossegue, a atividade enzimática diminui. Ao substituí-lo por enzimas frescas, a atividade enzi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5