Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

Özet

Bu protokol, iskelet ve kalp kası fibro-adipojenik progenitörlerinin (FAP'ler) dikenli fareden (Acomys) enzimatik ayrışma ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması yoluyla izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden elde edilen FAP'lar etkili bir şekilde genişletilebilir ve miyofibroblastlara ve adipositlere farklılaştırılabilir.

Özet

Olağanüstü onarım programı nedeniyle, dikenli fare, rejeneratif tıp için gelişmekte olan bir araştırma modelidir. Fibro-adipojenik progenitörler, adipositlere, fibroblastlara ve kondrositlere farklılaşabilen dokuda yerleşik hücrelerdir. Fibro-adipojenik progenitörler, yaralanma sonrası hücre dışı matris yeniden şekillenmesinden sorumlu oldukları için doku rejenerasyonunu düzenlemek için temeldir. Bu çalışma, fibro-adipojenik progenitörlerin dikenli fare kardiyak onarımı ve iskelet kası rejenerasyonundaki spesifik rolünü araştırmaya odaklanmaktadır. Bu amaçla, enzimatik olarak ayrışmış iskelet ve kalp kasından akış sitometrisi ile dikenli fare fibro-adipojenik progenitörlerinin saflaştırılması için bir protokol optimize edilmiştir. Bu protokolden elde edilen popülasyon in vitro olarak genişleyebilir ve miyofibroblastlar ve adipositlere farklılaşabilir. Bu protokol, araştırmacıların dikenli farenin ayırt edici özelliklerini incelemeleri ve bunları Mus musculus ile karşılaştırmaları için değerli bir araç sunmaktadır. Bu, bu ilgi çekici modelde rejeneratif mekanizmaların anlaşılmasını ilerletebilecek içgörüler sağlayacaktır.

Giriş

Başlangıçta son derece kırılgan cildi ve cilt yaralanmalarını onarma konusundaki olağanüstü yeteneği ile tanınan dikenli fare, Mus musculus ^1,2 ile karşılaştırıldığında kas-iskelet sistemi, böbrek, merkezi sinir sistemi ve kardiyovasküler gibi çeşitli organ sistemlerinde üstün rejeneratif kapasite göstermiştir.

Fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler), iskelet ve kalp kası dahil olmak üzere çeşitli dokularda yerleşik olan stromal hücrelerin bir alt kümesidir. Bu hücreler, in vivo ve in vitro ^3,4 fibrojenik ve adipojenik soylara bağlanmak için benzersiz bir kapasiteye sahiptir. FAP'lar, hücre dışı matrisi modüle ederek ve onarım sürecinde yer alan diğer hücre tiplerinin işlevlerini destekleyerek doku rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynar. İskelet kasında, FAP'lar yaralanmaya yanıt olarak aktive olur ve kas kök hücre farklılaşmasını ve miyojenezi kolaylaştırır ^5,6. Kalbin iskemik hasarında, FAP'lar miyokardın bütünlüğünü korumak için skar dokusu bırakır. Kasın aksine, kardiyak FAP'lar kronik olarak aktive olur ve patolojik yeniden şekillenmeye katkıda bulunur ^7,8.

Önceki çalışmalar, dikenli fare hücre dışı matrisinin, Mus musculus^9,10 ile karşılaştırıldığında rejenerasyonu destekleyen farklı bileşim, yapı ve özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Kas ve kalp yaralanmalarında, FAP'ların dikenli farelerde üstün iyileşmeye katkıda bulunduğu kaydedilmiştir 11,12,13. Dikenli fare FAP'lerinin ve stroma'nın davranışını ve düzenleyici kontrolünü anlamak, rejeneratif yeteneklerinin arkasındaki mekanizmaya ışık tutabilir. FAP'lar, mus musculus^14,15 gibi diğer hayvan modellerinde kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, şu anda dikenli fare FAP'lerini izole etmek için yayınlanmış bir protokol bulunmamaktadır. Böyle bir protokolün geliştirilmesi, bu alandaki önemli bir boşluğu dolduracak ve araştırmacıların dikenli farenin rejeneratif potansiyelinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemelerini sağlayacaktır.

Bu protokol, iskelet ve kalp kası FAP'lerini dikenli fareden izole etmek, genişletmek ve ayırt etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokolü tanımlar. Burada açıklanan protokol, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için uygun olan yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar verir. Mus musculus FAP'larını¹⁶ ayırt etmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntem olan rh-TGFβ1 veya ticari olarak temin edilebilen uyumlu bir ortam kullanılarak, sıralanan dikenli FAP'lar sırasıyla fibrojenik soy ve adipojenik soy boyunca farklılaşma kapasitelerini korurlar (Şekil 1).

Protokol

Tüm hayvan bakım ve deney işlemleri, British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nin onayına ve British Columbia Üniversitesi'ndeki düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, standart koşullar altında (12:12 aydınlık-karanlık döngüsü, 21-23 °C ve %40-%60 nem seviyesi) patojen içermeyen kapalı bir tesiste barındırıldı ve protein açısından zengin bir fare diyeti ve su ad libitum sağlandı. Bu çalışma için erişkin (4-6 aylık, 50-60 g) dişi ve erkek Acomys dimidiatus fareleri kullanıldı. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çözelti ve tampon hazırlama

1. 1x Fosfat Tampon Salin (PBS) hazırlayın.
2. 4 mL 0.5 M EDTA (2 mM) ve 996 mL 1x PBS, pH = 7.4'ü karıştırarak PBS-EDTA'yı hazırlayın.
3. 100 mL nükleaz içermeyen suya 2.7745 g CaCl 2 ekleyerek 250 mM CaCl₂ hazırlayın.
4. Sindirim tamponu hazırlayın: DMEM / F12'de 50 μg / mL liberaz, 2.5 mM CaCl₂ ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) karıştırın.
5. 488 mL 1x PBS, 2 mL 0.5M EDTA ve 10 mL FBS'yi karıştırarak FACS tamponu hazırlayın.
6. FACS tamponunu propidyum iyodür (PI; 1 μg/mL) ile karıştırarak Canlılık tamponu hazırlayın.
7. DMEM/F12'yi %5 FBS ve %1 (h/v) kalem/strep ile karıştırarak Temel ortamı hazırlayın.
8. DMEM / F12'yi %10 FBS,% 1 (h / v) pen / strep ve 2.5 ng / mL bFGF ile karıştırarak Proliferasyon ortamını hazırlayın.
9. Bazik besiyeri ile 10 ng/mL rh-TGFβ1'i karıştırarak Mribojenik besiyeri hazırlayın,
10. DMEM/F12'yi %1 kalem/strep ve piyasada bulunan 10x fare adipojenik farklılaşma takviyesi ile karıştırarak Adipojenik ortam (1x) hazırlayın.
11. 1x PBS'ye %4 Paraformaldehit (a/h) ekleyerek %4 PFA hazırlayın.
12. 498,5 mL 1x PBS ve 1,5 mL TritonX-100'ü karıştırarak %0,3 PBS-Triton hazırlayın.
13. %5 (h/h) Eşek serumu, %1 BSA (a/h) ve %0.3 PBS-Triton'u karıştırarak Eşek engelleme tamponunu hazırlayın.
14. 2,5 mL Eşek engelleme tamponu ve 2 damla MOM bloğunu karıştırarak Eşek + MOM engelleme tamponunu hazırlayın.
15. 600 nM 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1x PBS'de karıştırarak DAPI boyama çözeltisi hazırlayın.

2. Doku toplama

1. Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi yönergelerini izleyerek hayvana ötenazi yapın. Dikenli fareler için, izofluran ve ardından CO₂ (kafes / dakika hacminin% 20'si) ve ölümü sağlamak için omurga çıkığı önerilir.
2. Fareyi sırtüstü pozisyonda diseksiyon aşamasına yerleştirin ve fare kürkü ile kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile iyice püskürtün.
3. Ventral orta hatta 2-3 cm'lik dikey bir kesi yapın ve göğüs kafesini ve karın kasını ortaya çıkarın. Ksifoid sürecinde kasları doku makasıyla kesin ve diyaframı açığa çıkarın. Diyaframı ve göğüs kafesini her iki taraftan kesin. Kesilen kaburgaları kelepçelemek ve soymak için bir kanama durdurucu kullanın.
4. Sağ atriyumu doku makasıyla çentikleyin, kalbin tepesine 20 mL'lik bir şırıngaya bağlı 23 G'lik bir iğne yerleştirin ve 20 mL 2 mM PBS-EDTA'yı yavaşça enjekte ederek perfüze edin.
5. Kalbi eksize edin, buz üzerinde 60 mm'lik bir Petri kabında soğuk 1x PBS'de durulayın, kulakçıkları çıkarın ve kanı mümkün olduğunca temizleyin.
6. Diz ekleminin üzerindeki cildi çıkarın. Fasyayı çıkarmak için ince forseps kullanın ve uyluk kemiğini kılavuz olarak kullanarak kuadrisep kasını makasla izole edin. Soğuk 1x PBS ile ayrı bir Petri kabına yerleştirin.
7. Diğer bacak için adım 2.6'yı tekrarlayın.

3. Doku sindirimi

1. Kalp için 5 mL'lik bir taşıma şişesine 2 mL sindirim tamponu ve iki kuadripepl kas için 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 4 mL sindirim tamponu ekleyin.
2. Petri kabının kapağındaki doku makası ile dokuyu 1 mm'den küçük³ parçaya doğrayın.
3. Kıyılmış dokuyu ilgili sindirim tüplerine ekleyin. Karıştırmak için düşük hızda 2 saniye boyunca girdap.
4. Hafifçe döndürerek ve çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.
5. 20 dakika sonra tüpleri döndürücüden çıkarın ve doku parçalarının yerleşmesine izin verin. Süpernatanı bir P1000 pipeti ile 50 mL santrifüj tüplerinde 20 mL buz gibi soğuk FACS tamponuna çıkarın.
6. Sindirim tüplerini kalp ve kas sindirimi için sırasıyla 2 mL ve 4 mL sindirim tamponu ile doldurun ve hafif döndürme ve çalkalama ile 37 ° C'ye geri yerleştirin.
7. Adım 3.5'ten adım 3.6'ya kadar 20 dakika sonra bir kez daha tekrarlayın. Süpernatanı adım 3.5'ten itibaren ilgili 50 mL santrifüj tüpüne koyun.
8. Sindirim tamponunu buz gibi soğuk FACS tamponu ile söndürerek 60 dakika sonra sindirimi durdurun.
9. Sindirim süspansiyonunu ve süpernatanı, 50 mL santrifüj tüplerinin üstündeki 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. FACS tamponu ile 40 mL'ye kadar doldurun.
10. Hücre süspansiyonunu 500 ° C'de 8 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 3 mL ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 5 dakika inkübe edin ve FACS tamponu ile 40 mL'ye kadar doldurun.
11. 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.
12. Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek 0,5 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
13. Süspansiyonu, hücre süzgeç kapaklı 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpler üzerindeki 40 μm'lik bir filtreden süzün.

4. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için boyama

1. Tek renk ve floresan eksi bir (FMO) kontroller için, önceden etiketlenmiş 1,5 mL santrifüj tüplerinde 2x çalışma konsantrasyonunda 30 μL boyama tamponu (FACS tamponunda seyreltilmiş antikorlar) hazırlayın. Antikor boyama tamponu kurulumu için Tablo 1'e bakın.
2. Kas ve kalp için tek renkler ve FMO kontrollerini ayrı ayrı hazırlayın.
3. 30 μL tek renk ve FMO kontrol boyama tamponunu 96 oyuklu bir plakaya aktarın. 20 μL FACS tamponu ile doldurun.
4. Numune FACS boyaması için, 1.5 mL santrifüj tüplerinde 2x çalışma konsantrasyonunda 0.5 mL boyama tamponu (FACS tamponunda seyreltilmiş antikor) hazırlayın.
5. Tek renk ve FMO kontrol kuyularına 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre süspansiyonunun geri kalanına boyama tamponu ekleyin ve yeniden askıya alın.
6. 4 °C'de inkübe edin, 30 dakika ışıktan koruyun.
7. Kuyucukları 100 μL FACS tamponu ve numune tüpünü 2 mL FACS tamponu ile doldurun.
8. 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
9. 4.7 ve 4.8 adımlarını tekrarlayın.
10. Hücre peletini canlılık tamponunda yeniden süspanse edin. Tek renk ve FMO kontrolleri için 100 μL, FACS sıralama numuneleri için 1 mL.
11. 1.7 mL'lik santrifüj tüplerine 300 μL proliferasyon ortamı ekleyerek toplama tüplerini hazırlayın.

5. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması

1. Geçit stratejisi: FSC'yi kullanın vs. Kalıntıları temizlemek için SSC (günlük). FSC-H ile karşılaştırın. Tekli kapılar için FSC-A. CD31 ile karşılaştırın. Canlı ve soy negatif hücrelere kapı açmak için PI. FAP'lere geçit vermek için PDGFRα kullanın (Şekil 2).
2. Önceden hazırlanmış toplama tüplerine ayırın.

6. Doku kültürü

1. Toplanan hücreleri 800 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
2. Süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın. Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
3. Peletleri kültür ortamında (250 μL/oyuk) yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu bir doku kültürü plakasında 25k hücre/kuyuda tohumlayın.
4. Bir inkübatörde kültür (37 °C,% 5 CO₂). Hücreler% 80 birleşme noktasına ulaşana kadar her 3 günde bir ortamı değiştirin.

7. Fibrojenik farklılaşma

1. Hücreler tedavi edilmeye hazır olduğunda, kullanmadan önce temel ortamı ve 1x DPBS'yi ılık bir banyoya veya oda sıcaklığına koyun.
2. Kültür medyasını aspire edin.
3. 200 μL 1x DPBS ile iki kez durulayın.
4. 200 μL bazik ortam ile bir kez durulayın.
5. İlgili kuyucuklara 250 μL fibrojenik veya bazik ortam ekleyin.
6. Hücreleri inkübatöre geri koyun (37 °C,% 5 CO₂).
7. 48 saat sonra farklılaşmayı durdurun.

8. Adipojenik farklılaşma

1. Hücreler tedavi edilmeye hazır olduğunda, kullanmadan önce temel ortamı, adipojenik ortamı ve 1x DPBS'yi ılık bir banyoya veya oda sıcaklığına yerleştirin.
2. Kültür medyasını aspire edin.
3. 200 μL 1x DPBS ile iki kez durulayın.
4. 200 μL bazik ortam ile bir kez durulayın.
5. İlgili kuyucuklara 400 μL adipojenik veya bazik ortam ekleyin.
6. İnkübatöre geri dönün (37 ° C,% 5 CO₂).
7. Her 2 günde bir, kuyucuklardan bir pipetle 200 μL ortamı çıkarın ve 200 μL taze adipojenik veya bazik ortam ekleyin.
8. İskelet kası FAP'ları için 6^{. günde} , kardiyak FAP'lar için 14^. günde farklılaşmayı durdurun.

9. İmmün boyama

1. Besiyerini aspire ederek ve 250 μL 1x PBS ile iki kez durulayarak farklılaşma testini durdurun. Hücre ayrılmasını önlemek için tüm yıkamaları 3 mL şırıngaya bağlı 18 G iğne ile yapın.
2. Kuyucuk başına 250 μL% 4 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında 7 dakika inkübe edin.
3. PFA'yı çıkarın ve her seferinde 250 μL 1x PBS ile 3 kez 5 dakika durulayın.
4. Son yıkamada 1x PBS'yi aspire edin ve 250 μL Eşek + MOM engelleme tamponu ekleyin.
5. Oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
6. Kuyucuk başına 100 μL'lik bir nihai hacim için Eşek bloke edici tamponda (anti-SMA ve anti-perilipin) birincil antikor boyama solüsyonu hazırlayın.
7. Boyama kuyularını aspire edin. Varsa, Eşek + MOM engelleme tamponunu kontrol kuyusunda bırakın.
8. İlgili kuyucuklara birincil antikor boyama solüsyonu ekleyin.
9. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
10. Ertesi gün, her seferinde 1x PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
11. Kuyucuk başına 100 μL'lik bir nihai hacme sahip Eşek bloke etme tamponunda ikincil antikor boyama çözeltisi hazırlayın.
12. Son yıkamayı aspire edin ve tüm kuyucuklara ikincil antikor boyama solüsyonu ekleyin.
13. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin (numuneler bu noktadan itibaren ışıktan korunmalıdır).
14. Her seferinde 1x PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
15. Son yıkamayı aspire edin ve 250 μL DAPI boyama solüsyonu ekleyin.
16. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
17. DAPI boyama solüsyonunu çıkarın ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca bir kez yıkayın.
18. Her kuyucuğa 100 μL Fluoromount-G ekleyin.
19. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakayı kapak ve parafin filmi ile kapatın. 4 °C'de, görüntülemeye kadar ışıktan koruyarak saklayın.
20. Mikroskop ile görüntü (Şekil 3 ve Şekil 4).
    NOT: Eşek serumu, bu protokolde kullanılan eşek tarafından yetiştirilen ikincil antikorlara karşı türe özgü bir blok olarak tamponu bloke etmek için kullanılır. Fare üzerinde fare engelleme reaktifi, farede yükselen anti-SMA birincil antikoruna karşı kullanılır.

Sonuçlar

İskelet kası ve kardiyak FAP'ları izole etmek ve kültürlemek için bu protokolün şeması Şekil 1'de özetlenmiştir. Doku toplanması için, karaciğerin renginin koyu kırmızıdan soluk sarıya değişmesi genellikle başarılı bir perfüzyonun göstergesidir. Dikenli farenin belirtilen yaş aralıklarında, kalp ağırlıkları tipik olarak 200 mg civarındayken, kuadrisep kası yaklaşık 350 mg'dır.

Adım 3.5-3.7'de...

Tartışmalar

Dikenli fare dokuları, doku ayrışmasındaki streslere karşı daha hassastır ve bu protokolün, hücre canlılığını artırmak için stresi en aza indirmeyi amaçlayan çeşitli yönleri vardır. Gerekli enzimin konsantrasyonunu düşürmek için numune hazırlama için seri enzimatik ayrışma tekniği kullanılır. Enzimatik sindirim ilerledikçe enzimatik aktivite azalır. Taze enzimlerle değiştirilerek, tüm sindirim boyunca tutarlı enzimatik aktivite daha iyi elde edilebil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5