Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

Özet

Bu protokol, iskelet ve kalp kası fibro-adipojenik progenitörlerinin (FAP'ler) dikenli fareden (Acomys) enzimatik ayrışma ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması yoluyla izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden elde edilen FAP'lar etkili bir şekilde genişletilebilir ve miyofibroblastlara ve adipositlere farklılaştırılabilir.

Özet

Olağanüstü onarım programı nedeniyle, dikenli fare, rejeneratif tıp için gelişmekte olan bir araştırma modelidir. Fibro-adipojenik progenitörler, adipositlere, fibroblastlara ve kondrositlere farklılaşabilen dokuda yerleşik hücrelerdir. Fibro-adipojenik progenitörler, yaralanma sonrası hücre dışı matris yeniden şekillenmesinden sorumlu oldukları için doku rejenerasyonunu düzenlemek için temeldir. Bu çalışma, fibro-adipojenik progenitörlerin dikenli fare kardiyak onarımı ve iskelet kası rejenerasyonundaki spesifik rolünü araştırmaya odaklanmaktadır. Bu amaçla, enzimatik olarak ayrışmış iskelet ve kalp kasından akış sitometrisi ile dikenli fare fibro-adipojenik progenitörlerinin saflaştırılması için bir protokol optimize edilmiştir. Bu protokolden elde edilen popülasyon in vitro olarak genişleyebilir ve miyofibroblastlar ve adipositlere farklılaşabilir. Bu protokol, araştırmacıların dikenli farenin ayırt edici özelliklerini incelemeleri ve bunları Mus musculus ile karşılaştırmaları için değerli bir araç sunmaktadır. Bu, bu ilgi çekici modelde rejeneratif mekanizmaların anlaşılmasını ilerletebilecek içgörüler sağlayacaktır.

Giriş

Başlangıçta son derece kırılgan cildi ve cilt yaralanmalarını onarma konusundaki olağanüstü yeteneği ile tanınan dikenli fare, Mus musculus ^1,2 ile karşılaştırıldığında kas-iskelet sistemi, böbrek, merkezi sinir sistemi ve kardiyovasküler gibi çeşitli organ sistemlerinde üstün rejeneratif kapasite göstermiştir.

Fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler), iskelet ve kalp kası dahil olmak üzere çeşitli dokularda yerleşik olan stromal hücrelerin bir alt kümesidir. Bu hücreler, in vivo ve in vitro ^3,....

Protokol

Tüm hayvan bakım ve deney işlemleri, British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nin onayına ve British Columbia Üniversitesi'ndeki düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, standart koşullar altında (12:12 aydınlık-karanlık döngüsü, 21-23 °C ve %40-%60 nem seviyesi) patojen içermeyen kapalı bir tesiste barındırıldı ve protein açısından zengin bir fare diyeti ve su ad libitum sağlandı. Bu çalışma için erişkin (4-6 aylık, 50-60 g) dişi ve erkek Acomys dimidiatus fareleri kullanıldı. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

....

Tartışmalar

Dikenli fare dokuları, doku ayrışmasındaki streslere karşı daha hassastır ve bu protokolün, hücre canlılığını artırmak için stresi en aza indirmeyi amaçlayan çeşitli yönleri vardır. Gerekli enzimin konsantrasyonunu düşürmek için numune hazırlama için seri enzimatik ayrışma tekniği kullanılır. Enzimatik sindirim ilerledikçe enzimatik aktivite azalır. Taze enzimlerle değiştirilerek, tüm sindirim boyunca tutarlı enzimatik aktivite daha iyi elde edilebil.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5