Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model(스파이니 마우스 모델로부터의 섬유-지방형성 전구세포 분리, 확장 및 분화)

요약

이 프로토콜은 효소 해리 및 형광 활성화 세포 분류를 통해 가시쥐(Acomys)에서 골격 및 심장 근육 섬유-지방 생성 전구세포(FAP)를 분리하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에서 얻은 FAP는 근섬유아세포 및 지방세포로 효과적으로 확장되고 분화될 수 있습니다.

초록

뛰어난 복구 프로그램 덕분에 가시 쥐는 재생 의학의 새로운 연구 모델입니다. 섬유지방형성 전구세포(Fibro-adipogenic progenitor)는 지방세포(adipocyte), 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte)로 분화할 수 있는 조직 상주 세포입니다. 섬유-지방 생성 전구세포는 손상 후 세포외 기질 리모델링을 담당하기 때문에 조직 재생을 조율하는 데 필수적입니다. 이 연구는 가시 쥐의 심장 복구 및 골격근 재생에서 섬유-지방 생성 전구 세포의 특정 역할을 조사하는 데 중점을 둡니다. 이를 위해 효소로 해리된 골격근 및 심장 근육의 유세포 분석을 통해 가시 쥐의 섬유-지방 생성 전구 세포를 정제할 수 있도록 프로토콜이 최적화되었습니다. 이 프로토콜에서 얻은 집단은 시험관 내에서 증식할 수 있으며 근섬유아세포(myofibroblast) 및 지방세포(adipocyte)로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 가시쥐의 독특한 특성을 조사하고 이를 Mus musculus 와 비교할 수 있는 귀중한 도구를 제공합니다. 이것은 이 흥미로운 모델에서 재생 메커니즘에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 통찰력을 제공할 것입니다.

서문

초기에 유난히 연약한 피부와 피부 손상을 복구하는 놀라운 능력으로 인정받은 가시쥐는 Mus musculus ^1,2와 비교할 때 근골격계, 신장계, 중추신경계, 심혈관계와 같은 다양한 장기 시스템에서 우수한 재생 능력을 입증했습니다.

섬유지방형성 전구세포(Fibro-adipogenic progenitors, FAPs)는 골격근과 심장근을 포함한 다양한 조직에 존재하는 기질 세포의 하위 집합입니다. 이 세포는 in vivo 및 in vitro ^3,4에서 섬유생성 및 지방형성 계통에 전념할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있습니다. FAP는 세포외 기질을 조절하고 복구 과정에 관여하는 다른 세포 유형의 기능을 지원함으로써 조직 재생에 중요한 역할을 합니다. 골격근에서 FAPs는 부상에 대한 반응으로 활성화되고 근육 줄기 세포 분화 및 근육 형성을 촉진합니다 ^5,6

프로토콜

모든 동물 관리 및 실험 절차는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물 보호 위원회의 승인과 브리티시 컬럼비아 대학교의 규정에 따라 수행되었습니다. 동물은 표준 조건(12:12 명암 주기, 21-23°C, 40%-60% 습도 수준)에서 밀폐된 병원체가 없는 시설에 수용되었으며 단백질이 풍부한 쥐 식단과 물을 즉시 제공했습니다. 이 연구에는 성체(4-6개월, 50-60g) 암컷 및 수컷 Acomys dimidiatus 마우스가 사용되었습니다. 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 용액 및 완충액 준비

1. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다.
2. 4mL의 0.5M EDTA(2mM)와 996mL의 1x PBS(pH = 7.4)를 혼합하여 PBS-EDTA를 제조합니다.
3. 2.7745g의 CaCl₂를 100mL의 뉴클레아제가 없는 물에 첨가하여 250mM CaCl₂를 준비합니다.
4. 분해 완충액 준비: DMEM/F12에 50μg/mL 리베라제, 2.5mM CaCl....

토론

가시 쥐 조직은 조직 해리의 스트레스에 더 민감하며, 이 프로토콜에는 세포 생존력을 향상시키기 위해 스트레스를 최소화하는 것을 목표로 하는 여러 측면이 있습니다. 연속 효소 해리 기법은 필요한 효소의 농도를 낮추기 위해 시료 준비에 사용됩니다. 효소 소화가 진행됨에 따라 효소 활성은 감소합니다. 신선한 효소로 대체하면 전체 소화에 걸쳐 일관된 효소 활성을 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5