Aislamiento, expansión y diferenciación de progenitores fibro-adipogénicos a partir del modelo de ratón espinoso

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) del músculo esquelético y cardíaco a partir de ratones espinosos (Acomys) mediante disociación enzimática y clasificación celular activada por fluorescencia. Los FAPs obtenidos de este protocolo pueden expandirse y diferenciarse eficazmente a miofibroblastos y adipocitos.

Resumen

Debido a su excepcional programa de reparación, el ratón espinoso es un modelo de investigación emergente para la medicina regenerativa. Los progenitores fibroadipogénicos son células residentes en tejidos que pueden diferenciarse en adipocitos, fibroblastos y condrocitos. Los progenitores fibroadipogénicos son fundamentales para orquestar la regeneración de tejidos, ya que son responsables de la remodelación de la matriz extracelular después de una lesión. Este estudio se centra en investigar el papel específico de los progenitores fibroadipogénicos en la reparación cardíaca y la regeneración del músculo esquelético del ratón. Con este fin, se ha optimizado un protocolo para la purificación de progenitores fibroadipogénicos de ratón espinoso mediante citometría de flujo a partir de músculo esquelético y cardíaco disociado enzimáticamente. La población obtenida de este protocolo es capaz de expandirse in vitro, y se puede diferenciar a miofibroblastos y adipocitos. Este protocolo ofrece una valiosa herramienta para que los investigadores examinen las propiedades distintivas del ratón espinoso y las comparen con el Mus musculus. Esto proporcionará información que podría avanzar en la comprensión de los mecanismos regenerativos en este intrigante modelo.

Introducción

Inicialmente reconocido por su piel excepcionalmente frágil y su notable capacidad para reparar lesiones cutáneas, el ratón espinoso ha demostrado una capacidad regenerativa superior en varios sistemas de órganos, como el musculoesquelético, el renal, el sistema nervioso central y el cardiovascular, en comparación con Mus musculus ^1,2.

Los progenitores fibroadipogénicos (FAP) son un subconjunto de células estromales que residen en varios tejidos, incluidos el músculo esquelético y el cardíaco. Estas células poseen una capacidad única para comprometerse con linajes fibrogénicos y adipogénicos in vivo e in vitro ^3,4. Las FAPs desempeñan un papel crucial en la regeneración de tejidos al modular la matriz extracelular y apoyar las funciones de otros tipos de células involucradas en el proceso de reparación. En el músculo esquelético, las FAP se activan en respuesta a una lesión y facilitan la diferenciación y miogénesis de las células madre musculares ^5,6. En la lesión isquémica del corazón, los FAP depositan tejido cicatricial para mantener la integridad del miocardio. A diferencia de los músculos, las FAP cardíacas se activan crónicamente y contribuyen a la remodelación patológica ^7,8.

Estudios previos han demostrado que la matriz extracelular espinosa del ratón tiene una composición, estructura y propiedades diferentes que apoyan la regeneración en comparación con Mus musculus ^9,10. En las lesiones musculares y cardíacas, se ha observado que los FAP contribuyen a una curación superior en ratones espinosos 11,12,13. Comprender el comportamiento y el control regulatorio de los FAP y el estroma de los ratones espinosos puede arrojar luz sobre el mecanismo detrás de sus capacidades regenerativas. Si bien las FAP se han estudiado ampliamente en otros modelos animales, como en mus musculus^14,15, actualmente no se han publicado protocolos para aislar las FAP de ratón espinoso. El desarrollo de un protocolo de este tipo llenaría un vacío significativo en el campo y permitiría a los investigadores examinar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen al potencial regenerativo del ratón espinoso.

Este protocolo describe un protocolo robusto y reproducible para aislar, expandir y diferenciar las PAF del músculo esquelético y cardíaco del ratón espinoso. El protocolo descrito aquí produce suspensiones unicelulares de alta calidad que son adecuadas para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Mediante el uso de rh-TGFβ1 o un medio compatible disponible comercialmente, dos métodos ampliamente utilizados para diferenciar las FAPs mus musculus ¹⁶, las FAPs espinosas clasificadas mantienen su capacidad de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico y el linaje adipogénico, respectivamente (Figura 1).

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y de mantenimiento de animales se llevaron a cabo de acuerdo con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica y las regulaciones de la Universidad de Columbia Británica. Los animales se alojaron en una instalación cerrada libre de patógenos en condiciones estándar (ciclo de luz-oscuridad 12:12, 21-23 °C y nivel de humedad del 40%-60%) y se les proporcionó una dieta de ratón rica en proteínas y agua ad libitum. Para este estudio se utilizaron ratones Acomys dimidiatus hembra y machos adultos (4 a 6 meses de edad, 50-60 g). Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la solución y del tampón

1. Prepare 1x solución salina tampón de fosfato (PBS).
2. Prepare PBS-EDTA mezclando 4 mL de EDTA 0,5 M (2 mM) y 996 mL de 1x PBS, pH = 7,4.
3. Prepare 250 mM de CaCl₂ añadiendo 2,7745 g de CaCl₂ a 100 mL de agua sin nucleasas.
4. Preparar tampón para la digestión: Mezclar 50 μg/mL de liberasa, 2,5 mM de CaCl₂ y 5% de suero fetal bovino (FBS) en DMEM/F12.
5. Prepare el tampón FACS mezclando 488 mL de 1x PBS, 2 mL de EDTA 0.5M y 10 mL de FBS.
6. Prepare el tampón de viabilidad mezclando el tampón FACS con yoduro de propidio (PI; 1 μg/mL).
7. Prepare los medios básicos mezclando DMEM/F12 con 5 % de FBS y 1 % (v/v) de pluma/estreptococo.
8. Prepare los medios de proliferación mezclando DMEM/F12 con 10% de FBS, 1% (v/v) de pluma/estreptococo y 2,5 ng/mL de bFGF.
9. Prepare los medios fibrogénicos mezclando los medios básicos y 10 ng/mL rh-TGFβ1,
10. Prepare medios adipogénicos (1x) mezclando DMEM/F12 con un 1% de pluma/estreptococo y un suplemento de diferenciación adipogénica de ratón 10x disponible en el mercado.
11. Prepare PFA al 4% agregando paraformaldehído al 4% (p/v) a 1x PBS.
12. Prepare PBS-Triton al 0,3% mezclando 498,5 mL de 1x PBS y 1,5 mL de TritonX-100.
13. Prepare el tampón de bloqueo de Burro mezclando 5% (v/v) de suero de Burro, 1% de BSA (p/v) y 0.3% de PBS-Triton.
14. Prepare el tampón de bloqueo Donkey + MOM mezclando 2,5 mL de tampón de bloqueo Donkey y 2 gotas de bloque MOM.
15. Prepare la solución de tinción DAPI mezclando 600 nM de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en 1x PBS.

2. Recolección de tejidos

1. Sacrificar al animal siguiendo las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Para los ratones espinosos, se recomienda isoflurano seguido de CO₂ (20% del volumen de la jaula/min) y luxación espinal para asegurar la muerte.
2. Coloque el ratón en la etapa de disección en posición supina y rocíe a fondo con etanol al 70% para evitar la contaminación con piel de ratón.
3. Realice una incisión vertical de 2-3 cm en la línea media ventral y exponga la caja torácica y el músculo abdominal. Corta el músculo en la apófisis xifoides con tijeras de tejido y expone el diafragma. Corta el diafragma y la caja torácica por ambos lados. Use un hemostático para sujetar y pelar las costillas cortadas.
4. Corta la aurícula derecha con unas tijeras de tejido, coloca una aguja de 23 g unida a una jeringa de 20 ml en el vértice del corazón y perfunde inyectando lentamente 20 ml de 2 mM PBS-EDTA.
5. Extirpe el corazón, enjuague con 1x PBS frío en una placa de Petri de 60 mm con hielo, retire las aurículas y limpie la sangre tanto como sea posible.
6. Retire la piel por encima de la articulación de la rodilla. Use pinzas finas para quitar la fascia y aísle el músculo cuádriceps con tijeras usando el fémur como guía. Coloque en una placa de Petri separada con 1x PBS frío.
7. Repita el paso 2.6 para la otra pierna.

3. Digestión de tejidos

1. Agregue 2 mL de tampón de digestión a un vial de transporte de 5 mL para el corazón, y 4 mL de tampón de digestión a un tubo de centrífuga de 15 mL para dos músculos cuádriceps.
2. Pica el pañuelo con unas tijeras de la tapa de la placa de Petri en trozos menores de 1 mm^{y 3} .
3. Añadir tejido picado a sus respectivos tubos de digestión. Vórtice durante 2 s a baja velocidad para mezclar.
4. Incubar a 37 °C con rotación y agitación suaves.
5. Después de 20 minutos, retire los tubos del rotador y deje que los trozos de tejido se asienten. Retire el sobrenadante con una pipeta P1000 en 20 mL de tampón FACS helado en tubos de centrífuga de 50 mL.
6. Rellene los tubos de digestión con 2 mL y 4 mL de tampón de digestión para la digestión cardíaca y muscular respectivamente, y vuelva a colocarlos a 37 °C con una suave rotación y agitación.
7. Repita los pasos 3.5 a 3.6 una vez más después de otros 20 minutos. Coloque el sobrenadante en el tubo de centrífuga de 50 ml correspondiente del paso 3.5.
8. Detenga la digestión después de 60 minutos enfriando el tampón de digestión con tampón FACS helado.
9. Filtre la suspensión de digestión y el sobrenadante a través de un filtro de células de 40 μm sobre tubos de centrífuga de 50 mL. Recarga de hasta 40 mL con tampón FACS.
10. Centrifugar la suspensión de la célula a 500 x g durante 8 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 3 mL de tampón de lisis ACK. Incubar en hielo durante 5 min y rellenar hasta 40 mL con tampón FACS.
11. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante.
12. Vuelva a suspender en 0,5 ml de tampón FACS, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar que las células se dispersen uniformemente.
13. Filtre la suspensión a través de un filtro de 40 μm en tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL con un tapón de filtro de celdas.

4. Tinción para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

1. Para controles de un solo color y fluorescencia menos uno (FMO), prepare 30 μL de tampón de tinción (anticuerpos diluidos en tampón FACS) a una concentración de trabajo 2x en tubos de centrífuga de 1,5 mL premarcados. Consulte la Tabla 1 para conocer la configuración del tampón de tinción de anticuerpos.
2. Prepare colores individuales y controles FMO para músculo y corazón por separado.
3. Transfiera 30 μL de tampón de tinción de un solo color y control FMO a una placa de 96 pocillos. Rellene con 20 μL de tampón FACS.
4. Para la tinción de muestras de FACS, prepare 0,5 mL de tampón de tinción (anticuerpo diluido en tampón FACS) a una concentración de trabajo 2x en tubos de centrífuga de 1,5 mL.
5. Agregue 10 μL de la suspensión de celda a los pocillos de control de un solo color y FMO. Agregue tampón de tinción al resto de la suspensión celular y vuelva a suspender.
6. Incubar a 4 °C, protegido de la luz durante 30 min.
7. Rellene los pocillos con 100 μL de tampón FACS y el tubo de muestra con 2 mL de tampón FACS.
8. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
9. Repita los pasos 4.7 y 4.8.
10. Vuelva a suspender el pellet de celda en el tampón de viabilidad. 100 μL para controles de un solo color y FMO, 1 mL para muestras de clasificación FACS.
11. Prepare los tubos de recolección añadiendo 300 μL de medios de proliferación en tubos de centrífuga de 1,7 mL.

5. Clasificación de células activadas por fluorescencia

1. Estrategia de compuertas: Usar FSC vs. SSC (registro) para eliminar escombros. Utilice FSC-H vs. FSC-A a singletes de puerta. Usar CD31 vs. PI para atacar células viables y de linaje negativo. Utilice PDGFRα para controlar los FAP (Figura 2).
2. Clasificar en tubos de recolección previamente preparados.

6. Cultivo de tejidos

1. Centrifugar las células recogidas a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
2. Retire el sobrenadante con una pipeta P1000. Tenga cuidado de no perturbar la pellet de la celda.
3. Vuelva a suspender el pellet en un medio de cultivo (250 μL/pocillo) y siembre a 25k células/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos.
4. Cultivo en incubadora (37 °C, 5% CO₂). Cambie el medio cada 3 días hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.

7. Diferenciación fibrogénica

1. Una vez que las células estén listas para ser tratadas, coloque los medios básicos y 1x DPBS en un baño tibio o a temperatura ambiente antes de usarlos.
2. Aspirar los medios de cultura.
3. Enjuague con 200 μL de 1x DPBS dos veces.
4. Enjuague con 200 μL de medios básicos una vez.
5. Agregue 250 μL de medio fibrogénico o básico a los pocillos respectivos.
6. Regrese las celdas a la incubadora (37 °C, 5% CO₂).
7. Detenga la diferenciación después de 48 h.

8. Diferenciación adipogénica

1. Una vez que las células estén listas para ser tratadas, coloque los medios básicos, los medios adipogénicos y 1x DPBS en un baño tibio o a temperatura ambiente antes de usarlos.
2. Aspirar los medios de cultura.
3. Enjuague con 200 μL de 1x DPBS dos veces.
4. Enjuague con 200 μL de medios básicos una vez.
5. Agregue 400 μL de medios adipogénicos o básicos a los pocillos respectivos.
6. Regreso a la incubadora (37°C, 5% CO₂).
7. Cada 2 días, retire 200 μL de medios con una pipeta de los pocillos y agregue 200 μL de medios adipogénicos o básicos frescos.
8. Detener la diferenciación al^6º día para las PAF del músculo esquelético y al^14º día para las PAF cardíacas.

9. Inmunotinción

1. Detenga el ensayo de diferenciación aspirando el medio y enjuagando con 250 μL de 1x PBS dos veces. Realice todos los lavados con una aguja de 18 G conectada a una jeringa de 3 ml para evitar el desprendimiento de células.
2. Añadir 250 μL de PFA al 4% por pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 7 min.
3. Retire el PFA y enjuague 3 veces durante 5 minutos cada vez con 250 μL de 1x PBS.
4. En el último lavado, aspirar 1x PBS y añadir 250 μL de Donkey + tampón de bloqueo MOM.
5. Incubar a temperatura ambiente durante 60 min.
6. Prepare la solución de tinción primaria de anticuerpos en tampón bloqueante Donkey (anti-SMA y anti-perilipina) para un volumen final de 100 μL por pocillo.
7. Aspirar los pocillos de tinción. Deje el tampón de bloqueo Donkey + MOM en el pozo de control si corresponde.
8. Agregue la solución de tinción de anticuerpos primarios en los pocillos respectivos.
9. Incubar a 4 °C durante la noche.
10. Al día siguiente, lávese 3 veces durante 5 minutos cada vez con 1x PBS.
11. Prepare la solución de tinción de anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo Donkey con un volumen final de 100 μL por pocillo.
12. Aspire el último lavado y agregue la solución de tinción de anticuerpos secundarios en todos los pocillos.
13. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos (las muestras deben protegerse de la luz a partir de este momento).
14. Lave 3 veces durante 5 minutos cada vez con 1x PBS.
15. Aspirar el último lavado y añadir 250 μL de solución de tinción DAPI.
16. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
17. Retire la solución de tinción DAPI y lávese una vez durante 5 minutos con 1x PBS.
18. Agregue 100 μL de Fluoromount-G en cada pocillo.
19. Selle la placa con la tapa y la película de parafina para minimizar la evaporación. Conservar a 4 °C, protegido de la luz hasta la toma de imágenes.
20. Imagen con un microscopio (Figura 3 y Figura 4).
    NOTA: El suero de burro se utiliza en el tampón de bloqueo como un bloqueo específico de la especie contra los anticuerpos secundarios criados por burro que se utilizan en este protocolo. El reactivo de bloqueo de ratón contra ratón se utiliza contra el anticuerpo primario anti-SMA que se genera en el ratón.

Resultados

En la Figura 1 se resume el esquema de este protocolo para aislar y cultivar músculo esquelético y PAF cardíacos. Para la recolección de tejidos, el cambio de color del hígado de rojo oscuro a amarillo pálido suele ser indicativo de una perfusión exitosa. Con los rangos de edad especificados del ratón espinoso, el peso del corazón suele ser de alrededor de 200 mg, mientras que el músculo cuádriceps es de alrededor de 350 mg.

Discusión

Los tejidos espinosos de ratón son más sensibles a las tensiones en la disociación de los tejidos, y hay varios aspectos de este protocolo destinados a minimizar el estrés para mejorar la viabilidad celular. La técnica de disociación enzimática en serie se emplea para la preparación de muestras con el fin de reducir la concentración de la enzima requerida. A medida que avanza la digestión enzimática, la actividad enzimática disminuye. Al reemplazarlo con enzimas frescas, se p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5