来自 Spiny 小鼠模型的 Fibro-Adipogenic Progenitor 分离、扩增和分化

摘要

该方案概述了通过酶解离和荧光激活细胞分选从多刺小鼠 （Acomys） 中分离骨骼肌和心肌纤维成脂祖细胞 （FAP）。从该方案获得的 FAP 可以有效地扩增和分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。

摘要

由于其特殊的修复程序，多刺鼠是再生医学的新兴研究模式。纤维成脂祖细胞是组织驻留细胞，能够分化为脂肪细胞、成纤维细胞和软骨细胞。纤维成脂祖细胞是协调组织再生的基础，因为它们负责损伤后的细胞外基质重塑。本研究的重点是研究纤维成脂祖细胞在刺鼠心脏修复和骨骼肌再生中的特异性作用。为此，已经优化了一种方案，用于通过流式细胞术从酶解离的骨骼肌和心肌中纯化多刺小鼠纤维成脂祖细胞。从该方案获得的群体能够在 体外扩增， 并且可以分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。该协议为研究人员提供了一个有价值的工具，以检查多刺鼠的独特特性，并将它们与 Mus musculus 进行比较。 这将提供见解，可以促进对这个有趣模型中再生机制的理解。

引言

刺鼠最初以其异常脆弱的皮肤和非凡的皮肤损伤修复能力而著称，与肌肉骨骼相比，刺鼠在各种器官系统中表现出卓越的再生能力，例如肌肉骨骼、肾脏、中枢神经系统和心血管 ^1,2。

纤维成脂祖细胞 （FAP） 是存在于各种组织（包括骨骼肌和心肌）中的基质细胞的一个亚群。这些细胞具有在体内和体外致力于纤维化和成脂谱系的独特能力 ^3,4。FAP 通过调节细胞外基质和支持参与修复过程的其他细胞类型的功能，在组织再生中起着至关重要的作用。在骨骼肌中，FAP 响应损伤而被激活，并促进肌肉干细胞分化和肌生成 ^5,6。在心脏缺血性损伤中，FAP 会沉积瘢痕组织以维持心肌的完整性。与肌肉相比，心脏 FAP 会慢性激活并导致病理重塑 ^7,8。

先前的研究表明，与 Mus musculus 相比，多刺小鼠细胞外基质具有不同的组成、结构和特性，支持再生 ^9,10。 在肌肉和心脏损伤中，已注意到 FAP 有助于多刺小鼠的出色愈合 11,12,13。了解多刺小鼠 FAP 和基质的行为和调节控制可能有助于阐明其再生能力背后的机制。虽然 FAP 在其他动物模型中进行了广泛研究，例如肌肉^14,15，但目前还没有已发表的分离棘鼠 FAP 的方案。开发这样的方案将填补该领域的重大空白，并使研究人员能够检查刺鼠再生潜力背后的细胞和分子机制。

该方案描述了一种稳健且可重复的方案，用于从棘鼠中分离、扩增和区分骨骼肌和心肌 FAP。此处描述的方案产生了适用于荧光激活细胞分选 （FACS） 的高质量单细胞悬液。通过使用 rh-TGFβ1 或兼容的市售培养基，两种广泛用于区分 肌肉 FAPs¹⁶ 的方法，分选的棘状 FAP 分别保持其沿纤维化谱系和成脂谱系分化的能力（图 1）。

研究方案

所有动物维护和实验程序均根据不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准和不列颠哥伦比亚大学的规定进行。在标准条件 （12：12 明暗循环、21-23 °C 和 40%-60% 湿度水平） 下，将动物饲养在封闭的无病原体设施中，并 随意提供富含蛋白质的小鼠饮食和水。本研究使用成年 （4 至 6 个月大，50-60 g） 雌性和雄性 Acomys dimidiatus 小鼠。材料 表中列出了所有使用的试剂和设备的详细信息。

1. 溶液和缓冲液的制备

1. 准备 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
2. 通过混合 4 mL 的 0.5 M EDTA （2 mM） 和 996 mL 的 1x PBS，pH = 7.4 来制备 PBS-EDTA。
3. 通过将 2.7745 g CaCl₂ 添加到 100 mL 无核酸酶水中来制备 250 mM CaCl₂。
4. 制备消化缓冲液：在 DMEM/F12 中混合 50 μg/mL liberase、2.5 mM CaCl₂ 和 5% 胎牛血清 （FBS）。
5. 通过混合 488 mL 的 1x PBS、2 mL 的 0.5M EDTA 和 10 mL 的 FBS 来制备 FACS 缓冲液。
6. 通过将 FACS 缓冲液与碘化丙啶 （PI;1 μg/mL） 混合来制备活力缓冲液。
7. 通过将 DMEM/F12 与 5% FBS 和 1% （v/v） 笔/链球菌混合来制备基础培养基。
8. 通过将 DMEM/F12 与 10% FBS、1% （v/v） 笔/链球菌和 2.5 ng/mL bFGF 混合来制备增殖培养基。
9. 通过混合碱性培养基和 10 ng/mL rh-TGFβ1 制备纤维化培养基，
10. 通过将 DMEM/F12 与 1% pen/strep 和市售的 10x 小鼠成脂分化补充剂混合来制备成脂培养基 （1x）。
11. 通过向 1x PBS 中加入 4% 多聚甲醛 （w/v） 来制备 4% PFA。
12. 通过混合 498.5 mL 的 1x PBS 和 1.5 mL 的 TritonX-100 制备 0.3% PBS-Triton。
13. 通过混合 5% （v/v） 驴血清、1% BSA （w/v） 和 0.3% PBS-Triton 来制备驴封闭缓冲液。
14. 通过混合 2.5 mL 的 Donkey 封闭缓冲液和 2 滴 MOM 阻滞来制备 Donkey + MOM 封闭缓冲液。
15. 通过在 1x PBS 中混合 600 nM 的 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 来制备 DAPI 染色溶液。

2. 组织采集

1. 按照机构动物护理和使用委员会的指导方针对动物实施安乐死。对于多刺鼠，建议异氟醚后跟 CO₂ （笼体积的 20%/分钟）和脊柱脱位以确保死亡。
2. 将鼠标仰卧位放在解剖台上，并用 70% 乙醇彻底喷洒，以防止被小鼠皮毛污染。
3. 在腹侧中线做一个 2-3 厘米的垂直切口，露出胸腔和腹肌。用组织剪刀切开剑突处的肌肉并露出横膈膜。切开两侧的隔膜和肋骨。使用止血钳夹住并剥开切好的肋骨。
4. 用组织剪刀划伤右心房，将一根 23 G 针头连接到 20 mL 注射器的心尖处，然后缓慢注射 20 mL 的 2 mM PBS-EDTA 灌注。
5. 切除心脏，在冰上的 60 mm 培养皿中用冷的 1x PBS 冲洗，去除心房，并尽可能清洁血液。
6. 去除膝关节上方的皮肤。使用细镊子去除筋膜，并以股骨为导向，用剪刀隔离股四头肌。放入装有 1x PBS 的单独培养皿中。
7. 对另一条腿重复步骤 2.6。

3. 组织消化

1. 将 2 mL 消化缓冲液加入到用于心脏的 5 mL 运输瓶中，将 4 mL 消化缓冲液加入 15 mL 离心管中，用于两块股四头肌。
2. 用纸巾剪刀在培养皿的盖子上将组织切成小于 1 毫米³ 的小块。
3. 将切碎的组织添加到各自的消化管中。以低速涡旋 2 秒混合。
4. 在 37 °C 下孵育，轻轻旋转和摇动。
5. 20 分钟后，从旋转器上取下管子，让组织块沉淀。用 P1000 移液管将上清液取出到 50 mL 离心管中的 20 mL 冰冷的 FACS 缓冲液中。
6. 分别用 2 mL 和 4 mL 的消化缓冲液加满消化管，用于心脏和肌肉消化，然后轻轻旋转和摇动将它们放回 37 °C。
7. 再重复 20 分钟后，再次重复步骤 3.5 到步骤 3.6。将上清液放入步骤 3.5 中的相应 50 mL 离心管中。
8. 用冰冷的 FACS 缓冲液淬灭消化缓冲液，在 60 分钟后停止消化。
9. 通过 50 mL 离心管顶部的 40 μm 细胞过滤器过滤消化悬浮液和上清液。用 FACS 缓冲液加满 40 mL。
10. 将细胞悬液在 4 °C 下以 500 x g 离心 8 分钟。 倒出上清液，并将细胞沉淀重悬于 3 mL ACK 裂解缓冲液中。在冰上孵育 5 分钟，然后用 FACS 缓冲液加满 40 mL。
11. 在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。 倒出上清液。
12. 重悬于 0.5 mL FACS 缓冲液中，上下吹打以确保细胞均匀分散。
13. 在带有细胞过滤器盖的 5 mL 聚苯乙烯圆底管上通过 40 μm 过滤器过滤悬浮液。

4. 荧光激活细胞分选 （FACS） 染色

1. 对于单色和荧光减一 （FMO） 对照，在预先标记的 1.5 mL 离心管中制备 2 倍工作浓度的 30 μL 染色缓冲液（在 FACS 缓冲液中稀释的抗体）。有关抗体染色缓冲液设置，请参阅 表 1 。
2. 分别为肌肉和心脏准备单色和 FMO 对照。
3. 将 30 μL 单色和 FMO 对照染色缓冲液转移到 96 孔板中。用 20 μL 的 FACS 缓冲液填充。
4. 对于样品 FACS 染色，在 1.5 mL 离心管中制备 2 倍工作浓度的 0.5 mL 染色缓冲液（在 FACS 缓冲液中稀释的抗体）。
5. 将 10 μL 细胞悬液添加到单色和 FMO 对照孔中。将染色缓冲液添加到细胞悬液的其余部分并重新悬浮。
6. 在 4 °C 下孵育，避光 30 分钟。
7. 用 100 μL 的 FACS 缓冲液填充孔，用 2 mL 的 FACS 缓冲液填充样品管。
8. 在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。
9. 重复步骤 4.7 和 4.8。
10. 将细胞沉淀重悬于活力缓冲液中。100 μL 用于单色和 FMO 对照，1 mL 用于 FACS 分选样品。
11. 通过在 1.7 mL 离心管中加入 300 μL 增殖培养基来制备收集管。

5. 荧光激活细胞分选

1. 门控策略：使用 FSC 与SSC （log） 清除碎屑。使用 FSC-H 与FSC-A 到门单透镜。使用 CD31 vs.PI 对活细胞和谱系阴性细胞进行设门。使用 PDGFRα 对 FAP 进行门控（图 2）。
2. 分类到预先准备好的收集管中。

6. 组织培养

1. 将收集的细胞在 4 °C 下以 800 x g 离心 10 分钟。
2. 用 P1000 移液器去除上清液。小心不要打扰细胞沉淀。
3. 将沉淀重悬于培养基（250 μL/孔）中，并以 25k 个细胞/孔的浓度接种在 48 孔组织培养板中。
4. 在培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中培养。每 3 天更换一次培养基，直到细胞达到 80% 汇合。

7. 纤维化分化

1. 一旦细胞准备好进行处理，请在使用前将碱性培养基和 1x DPBS 置于温水浴或室温下。
2. 吸出培养基。
3. 用 200 μL 的 1x DPBS 冲洗两次。
4. 用 200 μL 碱性填料冲洗一次。
5. 向相应的孔中加入 250 μL 纤维化或碱性培养基。
6. 将细胞放回培养箱（37 °C，5% CO₂ ）。
7. 48 小时后停止分化。

8. 成脂分化

1. 一旦细胞准备好进行处理，请在使用前将碱性培养基、成脂培养基和 1x DPBS 置于温水浴或室温下。
2. 吸出培养基。
3. 用 200 μL 的 1x DPBS 冲洗两次。
4. 用 200 μL 碱性填料冲洗一次。
5. 将 400 μL 的成脂或碱性培养基添加到相应的孔中。
6. 放回培养箱（37°C，5% CO₂）。
7. 每 2 天，用移液管从孔中取出 200 μL 培养基，并加入 200 μL 新鲜的成脂或碱性培养基。
8. 骨骼肌 FAPs 在^第 6 天停止分化，心脏 FAP 在^第 14 天停止分化。

9. 免疫染色

1. 通过吸出培养基并用 250 μL 的 1x PBS 冲洗两次来停止分化测定。使用连接到 3 mL 注射器的 18 G 针头进行所有洗涤，以避免细胞脱离。
2. 每孔加入 250 μL 4% PFA，并在室温下孵育 7 分钟。
3. 去除 PFA 并用 250 μL 1x PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 在最后一次洗涤时，吸出 1x PBS 并加入 250 μL Donkey + MOM 封闭缓冲液。
5. 在室温下孵育 60 分钟。
6. 在 Donkey 封闭缓冲液（抗 SMA 和抗 perilipin）中制备一抗染色溶液，每孔的最终体积为 100 μL。
7. 吸出染色孔。如果适用，将 Donkey + MOM 封闭缓冲液留在对照中。
8. 在相应的孔中加入一抗染色溶液。
9. 在 4 °C 孵育过夜。
10. 第二天，用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
11. 在 Donkey 封闭缓冲液中制备二抗染色溶液，终体积为每孔 100 μL。
12. 吸出最后一次洗涤液，并在所有孔中加入二抗染色溶液。
13. 在室温下孵育 45 分钟（从此时起，样品应避光）。
14. 用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
15. 吸出最后一次洗涤液并加入 250 μL DAPI 染色溶液。
16. 在室温下孵育 5 分钟。
17. 取出 DAPI 染色溶液，用 1x PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。
18. 在每个孔中加入 100 μL Fluoromount-G。
19. 用盖子和石蜡膜密封板，以尽量减少蒸发。储存在 4 °C，避光直至成像。
20. 显微镜图像（图 3 和 图 4）。
    注意：驴血清用于封闭缓冲液中，作为针对本方案中使用的驴饲养的二抗的物种特异性阻断。mouse-on-mouse 封闭试剂用于对抗小鼠中产生的抗 SMA 一抗。

结果

图 1 总结了分离和培养骨骼肌和心脏 FAP 的方案的示意图。对于组织收集，肝脏颜色从深红色变为淡黄色通常表明灌注成功。对于指定年龄范围的多刺鼠，心脏重量通常在 200 毫克左右，而股四头肌约为 350 毫克。

在步骤 3.5-3.7 中每次更换消化缓冲液期间，随着细胞从组织中释放，消化管中的消化缓冲液看起来不透明。在消化结?...

讨论

多刺小鼠组织对组织解离中的压力更敏感，并且该方案的几个方面旨在最大限度地减少压力以提高细胞活力。采用连续酶解离技术进行样品制备，以降低所需酶的浓度。随着酶消化的进行，酶活性降低。通过用新鲜酶代替它，可以更好地实现整个消化过程中一致的酶活性，并避免高浓度的酶。此外，避免了改变消化缓冲液以过度消化溶液中已经释放的细胞。其次，使用 AC...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5