来自 Spiny 小鼠模型的 Fibro-Adipogenic Progenitor 分离、扩增和分化

Summary

该方案概述了通过酶解离和荧光激活细胞分选从多刺小鼠 （Acomys） 中分离骨骼肌和心肌纤维成脂祖细胞 （FAP）。从该方案获得的 FAP 可以有效地扩增和分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。

Abstract

由于其特殊的修复程序，多刺鼠是再生医学的新兴研究模式。纤维成脂祖细胞是组织驻留细胞，能够分化为脂肪细胞、成纤维细胞和软骨细胞。纤维成脂祖细胞是协调组织再生的基础，因为它们负责损伤后的细胞外基质重塑。本研究的重点是研究纤维成脂祖细胞在刺鼠心脏修复和骨骼肌再生中的特异性作用。为此，已经优化了一种方案，用于通过流式细胞术从酶解离的骨骼肌和心肌中纯化多刺小鼠纤维成脂祖细胞。从该方案获得的群体能够在 体外扩增， 并且可以分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。该协议为研究人员提供了一个有价值的工具，以检查多刺鼠的独特特性，并将它们与 Mus musculus 进行比较。 这将提供见解，可以促进对这个有趣模型中再生机制的理解。

Introduction

刺鼠最初以其异常脆弱的皮肤和非凡的皮肤损伤修复能力而著称，与肌肉骨骼相比，刺鼠在各种器官系统中表现出卓越的再生能力，例如肌肉骨骼、肾脏、中枢神经系统和心血管 ^1,2。

纤维成脂祖细胞 （FAP） 是存在于各种组织（包括骨骼肌和心肌）中的基质细胞的一个亚群。这些细胞具有在体内和体外致力于纤维化和成脂谱系的独特能力 ^3,4。FAP 通过调节细胞外基质和支持参与修复过程的其他细胞类型的功能，在组织再生中起着至关重要的作用。在骨骼肌中，FAP 响应损伤而被激活，并促进肌肉干细胞分化和肌生成 ^5,6。在心脏缺血性损伤中，FAP 会沉积瘢痕组织以维持心肌的完整性。与肌肉相比，心脏 FAP 会慢性激活并导致病理重塑 ^7,8。

先前的研究表明，与

Protocol

所有动物维护和实验程序均根据不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准和不列颠哥伦比亚大学的规定进行。在标准条件 （12：12 明暗循环、21-23 °C 和 40%-60% 湿度水平） 下，将动物饲养在封闭的无病原体设施中，并 随意提供富含蛋白质的小鼠饮食和水。本研究使用成年 （4 至 6 个月大，50-60 g） 雌性和雄性 Acomys dimidiatus 小鼠。材料 表中列出了所有使用的试剂和设备的详细信息。

1. 溶液和缓冲液的制备

1. 准备 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
2. 通过混合 4 mL 的 0.5 M EDTA （2 mM） 和 996 mL 的 1x PBS，pH = 7.4 来制备 PBS-EDTA。
3. 通过将 2.7745 g CaCl₂ 添加到 100 mL 无核酸酶水中来制备 250 mM CaCl₂。
4. 制备消化缓冲液：在 DMEM/F12 中混合 50 μg/mL liberase、2.5 mM CaCl₂ 和 5% 胎牛血清 （FBS）。
5. 通过混合 488 mL 的 1x PBS、2 mL 的 0.5M EDTA 和....

Discussion

多刺小鼠组织对组织解离中的压力更敏感，并且该方案的几个方面旨在最大限度地减少压力以提高细胞活力。采用连续酶解离技术进行样品制备，以降低所需酶的浓度。随着酶消化的进行，酶活性降低。通过用新鲜酶代替它，可以更好地实现整个消化过程中一致的酶活性，并避免高浓度的酶。此外，避免了改变消化缓冲液以过度消化溶液中已经释放的细胞。其次，使用 AC.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL syringe	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D3571
40 μm cell strainer	Falcon	352340
48 well flat-bottom tissue culture plate	Falcon	53078
5 mL polypropylene	Falcon	352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
5 mL syringe	BD	309646
50 mL centrifuge tube	Falcon	352070
60 mm Petri dish	Falcon	353002
96 well V-bottom tissue culture plate	Corning	3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice)			kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Gibco	A10492-01
Anti-perilipin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Bovine serum albumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Donkey serum	Sigma	S30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasers	Beckman coulter	B52102
Fetal bovine serum	Gemini	100-500
Fine scissors	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Forceps	FST	11051-10
Hemostat	FST	91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)	Gibco	13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverted microscope - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement	STEMCELL technologies	5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyde	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140–122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidium iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Transport vial 5mL tube	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5