يتم تقديم بروتوكول لتزجيج أنسجة المبيض ، كطريقة بديلة للحفظ بالتبريد لبروتوكول التجميد البطيء المستخدم على نطاق واسع.
يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) خيارا مهما للحفاظ على الخصوبة. بالنسبة للمرضى الذين لا يمكن تأجيل علاجاتهم السامة للغدد التناسلية أو للفتيات قبل سن البلوغ ، غالبا ما يكون الخيار الوحيد لحماية الخصوبة. يمكن إجراء الحفظ بالتبريد إما عن طريق التزجيج أو عن طريق التجميد البطيء. التجميد البطيء هو النهج القياسي حاليا. يشير عدد متزايد من الدراسات إلى أن التزجيج يمكن أن يحل محل التجميد البطيء في مختبرات الإخصاب في المختبر الحديثة (IVF) ، مما يحسن بشكل كبير معدلات البقاء على قيد الحياة في الذوبان ويبسط الجوانب التقنية للحفظ بالتبريد. تم وصف بروتوكول عالي الإنتاجية قائم على الشبكة المعدنية للتزجيج السريع لأنسجة قشرة المبيض ، وهو مناسب للروتين السريري. يضمن تعقيم الشبكات المعدنية والنيتروجين السائل جودة عالية ، وتلبية معايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP). تم إجراء التزجيج لضمان معدلات تبريد فائقة السرعة. بدلا من الذوبان ببطء ، تم تسخين العينات بسرعة. لتقييم صلاحية البصيلات ، تم إجراء تلطيخ الكالسين قبل الحفظ بالتبريد وبعد الاحترار السريع. تم الإبلاغ عن التطبيق الناجح للتزجيج والاحترار السريع باستخدام الشبكات المعدنية. لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في صلاحية البصيلات قبل التزجيج وبعد الاحترار السريع. تثبت هذه النتائج القدرة العالية على تزجيج الأنسجة للتطبيقات الروتينية السريرية كبديل محتمل لطريقة التجميد البطيء المستخدمة على نطاق واسع.
يعد الحفاظ على أنسجة المبيض بالتبريد خيارا مهما للحفاظ على الخصوبة. يتم الحفاظ على الأنسجة المزروعة التي تحتوي على بصيلات المبيض ، والتي يتم تضمين البويضات فيها. بعد التخزين ، يمكن إذابة أنسجة المبيض وتسخينها وإعادة زراعتها في المريض. بالنسبة للخلايا أو الأنسجة القابلة للحياة ، تتوفر طريقتان للحفظ بالتبريد: التجميد البطيء والتزجيج1.
يستخدم التزجيج للحفاظ على المواد البيولوجية ، مثل الأجنة والبويضات ، بمعدلات بقاء أعلى مقارنة ببروتوكول التجميد البطيء1،2،3،4. التجميد البطيء له قيود ، مثل تكوين بلورات الجليد ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بهياكل الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، فإن التجميد البطيء هو نهج مهم للحفظ بالتبريد يسهل تخزين العينات البيولوجية على المدى الطويل ، وقد أثبتت وظيفة هذه الطريقة على نطاقواسع 5. يؤدي التزجيج إلى حالة زجاجية من التراكم ، مما يمنع تكوين بلورات الجليد6،7. على المستوى الفني ، يبسط التزجيج بشكل كبير إجراء الحفظ بالتبريد عن طريق تقليل صيانة المعدات ، وتقليل احتمالية حدوث أخطاء فنية ، وتقصير مدة عملية الحفظ بالتبريد8،9. في الحفاظ على خصوبة الإناث ، يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد نهجا حاسما قبل علاج السرطان10. أثبتت مجموعات مختلفة بنجاح مفهوم حفظ الأنسجة بالتبريد وإذابتها وزرعها بناء على بروتوكول التجميد البطيء11،12،13،14 ، والذي يعتبر حاليا النهج القياسي15.
يعتبر تزجيج أنسجة المبيض طريقة بديلة واعدة16،17،18،19،20،21 ، من حيث توفير الموارد22 ، ومعدلات بقاء البصيلات ، ومستويات تجزئة الحمض النووي ، وإمكانات الأوعية الدموية المتوازنة23،24،25،26،27. يتم إثبات ذلك من خلال عمليات التسليم الناجحة في اليابان28 ، والولايات المتحدةالأمريكية 29 ، وألمانيا30.
تتعارض مقارنة الخيارين لتزجيج أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) مقابل الإجراء القياسي لنتائج التجميد البطيء جزئيا في التحليلات التلويةالحالية 16. قد تكون هناك عدة عوامل قد ساهمت في ذلك ، حيث تختلف بروتوكولات التزجيج الحالية اختلافا كبيرا. تشمل هذه الاختلافات اختيار مادة الواقيات بالتبريد أو مجموعة من المواد الواقية ، وتركيزها ، وتكوين الوسائط التي تصرف بدون وصفة طبية ، وحجم شظايا الأنسجة ، والجهاز المستخدم كحامل للأنسجة. وفقا لذلك ، لا يوجد بروتوكول احترار موحد.
نظرا لأن المؤلفين وجدوا طريقة تؤدي إلى نتائج مقنعة من حيث المعالجة ، والجدوى ، وظهور موت الخلايا المبرمج ، وإطلاق العوامل الوعائية ، وحتى تقرير عن الولادة بعد إعادة الزرع9،27 ، يتم توفير وصف مفصل للغاية للبروتوكول. تقدم الطريقة الموصوفة بروتوكولا صالحا وفعالا قد يساهم في توحيد تزجيج أنسجة المبيض.
تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى بون الجامعي (007/09). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض. تضمنت مجموعة الدراسة أنسجة المبيض البشري من 50 مريضا بمتوسط عمر 27.4 عاما قبل الحفظ بالتبريد ، كما هو موضح في الشكل 1. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
1. تحضير أجهزة التحميل
2. تحضير وسائط التزجيج
3. إعداد التزجيج
4. تزجيج الأنسجة
5. إعداد وسائط الاحترار السريع
6. التحضير السريع للاحترار
7. الاحترار السريع لأنسجة المبيض
8. تحديد صلاحية البصيلات
يعرض هذا البروتوكول إجراءات تحضير وسائط التزجيج ، وأجهزة التحميل ، والتزجيج ، وإعداد وسائط الاحترار السريع ، والاحترار السريع ، وتحديد صلاحية البصيلات. تم التحقق من صحة مقارنة مباشرة بين قابلية البصيلات والعوامل الوعائية بين التجميد البطيء والتزجيج ونشرها31،32.
تم تقييم النجاح العام لبروتوكول التزجيج الموصوف من خلال مقارنة عدد البصيلات الحيوية قبل وبعد التزجيج / الاحترار السريع. يظهر الإعداد التجريبي في الشكل 1 ، ويتم عرض النتائج في الشكل 6. في 50 مريضا ، لوحظ متوسط عدد 77.98 بصيلات حيوية قبل التزجيج و 62.99 بعد التزجيج / الاحترار السريع ، مما يعكس معدل بقاء قدره 80.8٪. لم يكن هذا مختلفا بشكل كبير وفقا لاختبار ويلكوكسون33.
يتم تخصيص الشبكات المعدنية بشكل فردي بمقص حاد بحجم 25 مم × 8 مم ، والذي يتناسب مع أغطية 1.8 مل من التبريد ، كما هو موضح في الشكل 2 أ ، ج. بعد التعقيم باستخدام التعقيم بالبخار ، يتم تجميع الشبكات والأغطية المكونة من قوارير 1.8 مل تحت مقعد تدفق رقائقي ، كما هو موضح في الشكل 2 ب. يوفر هذا الإعداد ثباتا آمنا في الغطاء دون الحاجة إلى إجراءات إضافية ويوفر مساحة كافية للأنسجة ذات الأحجام المختلفة. عادة ما تكون قطع الأنسجة من 5 مم × 10 مم للزراعة وقطع قطرها 2 مم لتقييم عدد البصيلات الحيوية بعد الذوبان السريع مزججة. كلا الحجمين يتناسبان تماما مع الشبكات المعدنية.
يتم إجراء التوازن مع محاليل التزجيج (VS1 و VS2 و VS3) في صفيحة مكونة من 6 آبار على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة تحت مقعد تدفق رقائقي ، كما هو موضح في الشكل 3. تضمن الأطر الزمنية في المخطط الامتصاص الفعال للإيثيلين جلايكول المجعد. يوصى باستخدام صفيحة مكونة من 6 آبار فوق أوعية مفردة لأنها تسهل الحركة السريعة للأنسجة بين المحاليل وتساعد على منع الاختلاط.
من أجل التزجيج الرأسي السريع في النيتروجين السائل ، يتم تقطيع أنسجة قشرة المبيض إلى قطع مناسبة (الشكل 4 أ). يتم وضع عينات قشرة المبيض على أجهزة التحميل (الشكل 4 ب ، ج) ويتم غمرها عموديا في النيتروجين السائل (الشكل 4 د) لتحقيق حالة زجاجية من التجميع من خلال التزجيج. تسمح الشبكات المعدنية المختارة بالتعامل الرأسي مع الأنسجة ، كما هو موضح في الشكل 4 د. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الشبكات المعدنية عالية التوصيل حراريا ، مما يضمن معدلات تبريد سريعة من 22 درجة مئوية إلى -196 درجة مئوية ، وهي خطوة مهمة للغاية في عملية التزجيج.
للاحترار السريع ، يتم تحضير RWS في كوب معقم عند 37 درجة مئوية ، ويتم تحضير ES و RS1 و RS2 في صفيحة من 6 آبار على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة ، كما هو موضح في الشكل 5. يمنع الحجم الكبير من RWS الدافئ مسبقا المحلول من التبريد بشكل مفرط عند إضافة الأنسجة المزججة ويضمن بيئة دافئة باستمرار للأنسجة طوال عملية الاحترار السريع.
لتقييم وضمان معايير الجودة العالية ، يتم تلطيخ لكمات الخزعة 2 مم × 2 مم بالكالسين قبل التزجيج وبعد الاحترار السريع لتحديد صلاحية البصيلات باستخدام الفحص المجهري الفلوري34،35 (الشكل 6). تنبعث من بصيلات قابلة للحياة مضان أخضر عند 495 نانومتر بعد امتصاص الكالسين داخل الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم صلاحية البصيلات (الجدول 3) باستخدام أصباغ حمراء محايدة36.
باتباع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول ، يتم تحويل أنسجة المبيض إلى حالة زجاجية من التراكم ، مما يسهل معدلات البقاء على قيد الحياة المرتفعة بعد الاحترار السريع ، كما يؤكده الفحص المجهري الفلوري.
الشكل 1: تصميم الدراسة. تم فحص عينات قشرية المبيض من 50 مريضا قبل (طازجة) وبعد التزجيج والاحترار السريع لعدد البصيلات القابلة للحياة. لكل مجموعة ، تم زراعة قطعتين من الأنسجة بقطر 2 مم لمدة 24 ساعة قبل تقييم عدد البصيلات. تم هضم الأنسجة بالكولاجيناز وتلطيخها بالكالسين لتقييم الجدوى. تم تحديد عدد البصيلات القابلة للحياة باستخدام المجهر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحضير أجهزة التحميل. تم قطع الشبكات المعدنية بحجم 8 مم × 25 مم (A). تم تعقيم الشبكات المعدنية المخصصة عن طريق التعقيم (ب). ثم تم إدخال الشبكات المعدنية المعقمة في أغطية من قوارير سعة 1.8 مل ، جاهزة للاستخدام (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحضير محاليل التزجيج. تم تحضير محاليل التزجيج (VS) ونقلها إلى صفيحة من 6 آبار. تظهر الآبار حجم كل محلول وأوقات الحضانة الفردية المستخدمة في بروتوكول التزجيج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معالجة قشرة المبيض وتزجيجها. تمت معالجة أنسجة قشرة المبيض للحفظ بالتبريد عن طريق إزالة النخاع وتقطيع الأنسجة إلى قطع 5 مم × 10 مم (A). بعد الحضانة في محاليل التزجيج الموضحة في الشكل 3 ، تم تحميل الأنسجة على جهاز تحميل التزجيج (B ، C). من أجل التزجيج الرأسي السريع لعينات قشرة المبيض ، تم إدخال الأغطية ذات الأنسجة المحملة بسرعة في النيتروجين السائل المعقم (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحضير حلول الاحترار السريع. تم تحضير محلول الاحترار السريع (RWS) ومحلول التوازن (ES) ومحاليل الشطف (RS) 1 و 2 ونقلها إلى صفيحة مكونة من 6 آبار. تظهر الأوعية والآبار حجم كل محلول وأوقات الحضانة المقابلة. لاحظ أن RWS يتم الحفاظ عليه عند 37.2 درجة مئوية على لوحة التسخين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: عدد الجدوى. لتقييم عدد البصيلات القابلة للحياة ، تم هضم قطع الأنسجة التي يبلغ قطرها 2 مم بالكولاجيناز وتلطيخها بالكالسين. تظهر الصور التمثيلية (أ) تلطيخ الكالسين ل 3 بصيلات مستردة قبل التزجيج. (ب) جريب قابل للحياة بعد التزجيج والاحترار السريع. (ج) جريب قابل للحياة تم استرداده قبل التجميد البطيء. (د) استعادة بصيلات قابلة للحياة بعد التجميد والذوبان البطيء. يشار إلى صلاحية البصيلات بواسطة الكالسيين ، وهي صبغة فلورية خضراء تنبعث منها مضان أخضر عند تحويلها إنزيميا بواسطة خلايا قابلة للحياة عند 495 نانومتر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مقابل 1 (15 مل) | جلايكول الإيثيلين | 10% | 1.5 مل |
SSS | 10% | 1.5 مل | |
جي MOPS + | 12 مل | ||
VS 2 (15 مل) | جلايكول الإيثيلين | 20% | 3 مل |
SSS | 10% | 1.5 مل | |
جي MOPS + | 10.5 مل | ||
VS 3 (15 مل) | جلايكول الإيثيلين | 35% | 5.25 مل |
SSS | 10% | 1.5 مل | |
سكروز | 0.5 مول / لتر | 2.57 جرام | |
لاعب ضد لاعب | 5 ٪ (وزن حجمي) | 0.75 جرام | |
جي MOPS + | إعلان 15 مل |
الجدول 1: تكوين محاليل التزجيج (VS).
RWS (30 مل) | سكروز | 0.8 مول / لتر | |
8.22 جرام | |||
SSS | 10% | 3 مل | |
جي MOPS + | إعلان 30 مل | ||
ES (15 مل) | سكروز | 0.4 مول / لتر | 2.05 جرام |
SSS | 10% | 1.5 مل | |
جي MOPS + | إعلان 15 مل | ||
RS 1 & 2 (15 مل) | SSS | 10% | 1.5 مل |
جي MOPS + | إعلان 15 مل |
الجدول 2: تكوين محلول الاحترار السريع (RWS) ، ومحلول التوازن (ES) ، ومحاليل الشطف (RS). يوفر هذا الجدول مكونات وتركيزات محلول الاحترار السريع (RWS) ومحلول التوازن (ES) ومحاليل الشطف (RS) المستخدمة في معالجة ما بعد التزجيج.
البارامتر | طازج | فترة | تسخين سريع بعد التزجيج | فترة | n | *قيمة P |
[سد] | [سد] | |||||
عدد الجدوى الجرابية [ن] | 77.98 | 0-386 | 62.99 | 0.5-349 | 50 | 0.130 |
77.95 | 80.02 | |||||
* اختبار ويلكوكسون |
الجدول 3: النتائج التمثيلية للبقاء الجريبي. يعرض هذا الجدول نتائج تقييمات صلاحية البصيلات قبل الحفظ بالتبريد وبعد الاحترار السريع. تم استخدام قطعتين من الأنسجة بقطر 2 مم لكل مريض لحساب عدد البصيلات القابلة للحياة قبل وبعد التزجيج / الاحترار السريع. تم تحليل عينات الأنسجة المزدوجة من 50 مريضا باستخدام اختبار ويلكوكسون.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول للتزجيج عالي الإنتاجية لأنسجة قشرة المبيض البشرية ، مناسب للروتين السريري. على غرار تزجيج البويضات أو الأجنة ، يتطلب التطبيق الناجح للإجراء التزاما مفصلا بالبروتوكول المتعلق بدرجة حرارة محاليل التزجيج والاحترار ، بالإضافة إلى فترة التوازن. من الضروري أيضا الامتثال لتوجيهات الاتحاد الأوروبيللأنسجة 37 فيما يتعلق بجودة الهواء والعقيم.
ينتج عن إجراء التزجيج حالة غير بلورية أو غير متبلورة أو زجاجية. بشكل عام ، يعد التزجيج عملية متعددة الاستخدامات لها آثار كبيرة في مختلف المجالات العلمية والتكنولوجية. الفائدة الأساسية للتزجيج هي قدرته على تحويل الأنسجة إلى حالة زجاجية ، وبالتالي منع تكوين بلورات الثلج38،39،40 ، مما قد يؤثر سلبا على سلامة الأنسجة ومكوناتها.
تسمح مكملات عوامل الحماية من التبريد (CPAs) بالبولي فينيل بيروليدون (PVP) بتقليل تركيز CPA دون المساس بجودة محاليل التزجيج41،42. علاوة على ذلك ، يوفر استخدام الشبكات المعدنية موصلية حرارية عالية مقارنة بأنظمة الناقل القائمة على البلاستيك. يسهل هيكل الشبكة أيضا التصاق السطح ، مما يضمن الحفظ بالتبريد الآمن والآمن لعينات الأنسجة ولكمات القشرة الصغيرة لتدابير الجودة. إذا تم استخدام أوعية التبريد من الشركات المصنعة الأخرى ، فمن المهم اختبار حجم الشبكات المعدنية مسبقا لضمان الثبات والقبضة المناسبة داخل غطاء cryovessel ، بالإضافة إلى ملاءمتها بشكل جيد للوعاء.
تشمل الخطوات الحاسمة لضمان التزجيج الناجح التزجيج السريع عن طريق غمر الأنسجة في النيتروجين السائل المعقم وإجراء الاحترار السريع دون تأخير لتجنب النتائج السلبية. من حيث الفعالية من حيث التكلفة ، فإن تزجيج الأنسجة أقل تطلبا مقارنة بإجراء التجميد البطيء ، مما قد يؤثر على تخطيط نشر الأفراد. بالإضافة إلى ذلك ، يلغي التزجيج الحاجة إلى شراء وخدمة المعدات اللازمة للتجميد البطيء.
أظهرت المقاييس البيولوجية والتحليلات التلوية قابلية المقارنة أو حتى مزايا التزجيج مقارنة بالتجميدالبطيء 43. ومع ذلك، يمكن أن تعزى الاختلافات في النتائج بعد التزجيج إلى عدم وجود تقييس في كل من جهاز التزجيج والبروتوكول، بما في ذلك المحاليل المستخدمة، والتي تختلف عبر الدراسات. يجب أن تستكشف الأبحاث المستقبلية إمكانات زراعة البصيلات من الأنسجة المزججة / سريعة التسخين لمراقبة النمو في المختبر ، كما هو موضح بنجاح في أنسجة مبيض الفأر من قبل عدة مجموعات44،45،46،47،48،49،50.
باختصار ، يعد تزجيج أنسجة المبيض بديلا مهما لبروتوكول التجميد البطيء المستخدم على نطاق واسع ، مدعوما بخمس ولادات ناجحة أبلغت عنها سوزوكي51 (اليابان) ، سيلبر52 (الولايات المتحدة الأمريكية) ، وسانجر53 (ألمانيا). على عكس وسائط ومجموعات التزجيج المتاحة تجاريا للخلايا ، هناك عدد قليل من الأنظمة المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية / CE لأنسجة المبيض ، والتي قد تحد من تطبيقها في البيئات السريرية. لذلك ، يوصى بتطوير مجموعات ووسائط معتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية / CE للتزجيج والاحترار السريع لأنسجة المبيض30.
اي.
نشكر كارا فاربر على التدقيق اللغوي. كاتارينا وولرسهايم ومارتن ماهلبيرج وليا كورتي وجاسمين ريبهولز لمساعدتهم الفنية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.8 mL vials | VWR International GmbH | 479-6837 | |
10 mL serological pipette | Sarstedt | 86.1254.001 | |
4 well plate | Gynemed | GYOOPW-FW04 | |
50 mL Tube | Sarstedt | 62.559.001 | |
6 well plates | Sarstedt | 83.3920 | |
Bacillol AF | Hartmann | 973385 | |
Calcein AM | Merck | 17783 | |
Collagenase type 1A | Merck | C2674 | |
Cryosure DMSO | WAK Chemie | WAK-DMSO-10 | |
Custodiol | Dr. Franz Köhler Chemie | 00867288 | |
DPBS CTS | Gibco Life technologies | A12856-01 | |
ErgoOne pipette aid | Starlab | S7166-0010 | |
Ethylene glycol | Sigma Aldrich | 102466 | |
Euronda sterilization container | euronda | 282021 | |
G-MOPS+ | Vitrolife | 10130 | |
Metal meshes | Sigma Aldrich | S0770 | |
Metzenbaum scissors | world precision instruments | 501262102 | |
N-Bath System | Nterilizer | N-Bath 3.0 | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | SAGE | ART-4005 | |
Serum substitute supplement (SSS) | Fujifilm Irvine scientific | 99193 | |
Sterile cup | Sarstedt | 75.562.105 | |
Sterile forceps | Carl Roth | KL05.1 | |
Sucrose | Merck | S0389 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved