تزجيج أنسجة قشرة المبيض لتحقيق حالة زجاجية من التراكم

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتزجيج أنسجة المبيض ، كطريقة بديلة للحفظ بالتبريد لبروتوكول التجميد البطيء المستخدم على نطاق واسع.

Abstract

يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) خيارا مهما للحفاظ على الخصوبة. بالنسبة للمرضى الذين لا يمكن تأجيل علاجاتهم السامة للغدد التناسلية أو للفتيات قبل سن البلوغ ، غالبا ما يكون الخيار الوحيد لحماية الخصوبة. يمكن إجراء الحفظ بالتبريد إما عن طريق التزجيج أو عن طريق التجميد البطيء. التجميد البطيء هو النهج القياسي حاليا. يشير عدد متزايد من الدراسات إلى أن التزجيج يمكن أن يحل محل التجميد البطيء في مختبرات الإخصاب في المختبر الحديثة (IVF) ، مما يحسن بشكل كبير معدلات البقاء على قيد الحياة في الذوبان ويبسط الجوانب التقنية للحفظ بالتبريد. تم وصف بروتوكول عالي الإنتاجية قائم على الشبكة المعدنية للتزجيج السريع لأنسجة قشرة المبيض ، وهو مناسب للروتين السريري. يضمن تعقيم الشبكات المعدنية والنيتروجين السائل جودة عالية ، وتلبية معايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP). تم إجراء التزجيج لضمان معدلات تبريد فائقة السرعة. بدلا من الذوبان ببطء ، تم تسخين العينات بسرعة. لتقييم صلاحية البصيلات ، تم إجراء تلطيخ الكالسين قبل الحفظ بالتبريد وبعد الاحترار السريع. تم الإبلاغ عن التطبيق الناجح للتزجيج والاحترار السريع باستخدام الشبكات المعدنية. لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في صلاحية البصيلات قبل التزجيج وبعد الاحترار السريع. تثبت هذه النتائج القدرة العالية على تزجيج الأنسجة للتطبيقات الروتينية السريرية كبديل محتمل لطريقة التجميد البطيء المستخدمة على نطاق واسع.

Introduction

يعد الحفاظ على أنسجة المبيض بالتبريد خيارا مهما للحفاظ على الخصوبة. يتم الحفاظ على الأنسجة المزروعة التي تحتوي على بصيلات المبيض ، والتي يتم تضمين البويضات فيها. بعد التخزين ، يمكن إذابة أنسجة المبيض وتسخينها وإعادة زراعتها في المريض. بالنسبة للخلايا أو الأنسجة القابلة للحياة ، تتوفر طريقتان للحفظ بالتبريد: التجميد البطيء والتزجيج¹.

يستخدم التزجيج للحفاظ على المواد البيولوجية ، مثل الأجنة والبويضات ، بمعدلات بقاء أعلى مقارنة ببروتوكول التجميد البطيء^1،2،3،4. التجميد البطيء له قيود ، مثل تكوين بلورات الجليد ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بهياكل الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، فإن التجميد البطيء هو نهج مهم للحفظ بالتبريد يسهل تخزين العينات البيولوجية على المدى الطويل ، وقد أثبتت وظيفة هذه الطريقة على نطاق^{واسع 5}. يؤدي التزجيج إلى حالة زجاجية من التراكم ، مما يمنع تكوين بلورات الجليد^6،7. على المستوى الفني ، يبسط التزجيج بشكل كبير إجراء الحفظ بالتبريد عن طريق تقليل صيانة المعدات ، وتقليل احتمالية حدوث أخطاء فنية ، وتقصير مدة عملية الحفظ بالتبريد^8،9. في الحفاظ على خصوبة الإناث ، يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد نهجا حاسما قبل علاج السرطان¹⁰. أثبتت مجموعات مختلفة بنجاح مفهوم حفظ الأنسجة بالتبريد وإذابتها وزرعها بناء على بروتوكول التجميد البطيء^{11،12،13،14} ، والذي يعتبر حاليا النهج القياسي¹⁵.

يعتبر تزجيج أنسجة المبيض طريقة بديلة واعدة^{16،17،18،19،20،21} ، من حيث توفير الموارد²² ، ومعدلات بقاء البصيلات ، ومستويات تجزئة الحمض النووي ، وإمكانات الأوعية الدموية المتوازنة^{23،24،25،26،27}. يتم إثبات ذلك من خلال عمليات التسليم الناجحة في اليابان²⁸ ، والولايات المتحدة^{الأمريكية 29} ، وألمانيا³⁰.

تتعارض مقارنة الخيارين لتزجيج أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) مقابل الإجراء القياسي لنتائج التجميد البطيء جزئيا في التحليلات التلوية^{الحالية 16}. قد تكون هناك عدة عوامل قد ساهمت في ذلك ، حيث تختلف بروتوكولات التزجيج الحالية اختلافا كبيرا. تشمل هذه الاختلافات اختيار مادة الواقيات بالتبريد أو مجموعة من المواد الواقية ، وتركيزها ، وتكوين الوسائط التي تصرف بدون وصفة طبية ، وحجم شظايا الأنسجة ، والجهاز المستخدم كحامل للأنسجة. وفقا لذلك ، لا يوجد بروتوكول احترار موحد.

نظرا لأن المؤلفين وجدوا طريقة تؤدي إلى نتائج مقنعة من حيث المعالجة ، والجدوى ، وظهور موت الخلايا المبرمج ، وإطلاق العوامل الوعائية ، وحتى تقرير عن الولادة بعد إعادة الزرع^9،27 ، يتم توفير وصف مفصل للغاية للبروتوكول. تقدم الطريقة الموصوفة بروتوكولا صالحا وفعالا قد يساهم في توحيد تزجيج أنسجة المبيض.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى بون الجامعي (007/09). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض. تضمنت مجموعة الدراسة أنسجة المبيض البشري من 50 مريضا بمتوسط عمر 27.4 عاما قبل الحفظ بالتبريد ، كما هو موضح في الشكل 1. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير أجهزة التحميل

1. قم بإعداد مقص جراحي وشبكات معدنية للتخصيص. قم بقص الشبكات إلى شرائح بقياس 25 مم × 8 مم ، كما هو موضح في الشكل 2 أ.
2. ضع الشبكات المعدنية المخصصة في حاوية تعقيم وأوتوكلاف لمدة ساعتين (الشكل 2 ب). بعد التعقيم ، ضع حاوية التعقيم وقوارير 1.8 مل تحت مقعد التدفق الرقائقي.
3. قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمقعد التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة للتعقيم الإضافي عند الطول الموجي 254 نانومتر.
4. افتح حاوية التعقيم ، وقم بإزالة الشبكات المعدنية ، وقم بوضعها في أغطية القوارير سعة 1.8 مل ، كما هو موضح في الشكل 2 ج. أغلق القوارير سعة 1.8 مل.
   ملاحظة: يجب إجراء جميع أعمال زراعة الأنسجة الموضحة أعلاه في غطاء التدفق الصفحي من الدرجة الثانية. قم بتنظيف مقعد التدفق الصفحي بمطهر السطح أثناء ارتداء قفازات المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ؛ يوصى باستخدام القفازات غير المسحوقة.

2. تحضير وسائط التزجيج

1. قم بإعداد ماصة مصلية واحدة سعة 10 مل ، وماصة إلكترونية واحدة ، وثلاثة أنابيب سعة 50 مل لمحلول التزجيج 1 (VS1) ، ومحلول التزجيج 2 (VS2) ، ومحلول التزجيج 3 (VS3) ، وكذلك لتسجيل تاريخ التحضير. قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمقعد التدفق الصفحي لمزيد من التعقيم.
2. بالنسبة ل VS1 (15 مل) ، ماصة 12 مل من وسط مناولة البويضات (مكمل بألبومين مصل بشري من قبل الشركة المصنعة) ، و 1.5 مل من SSS (مكمل بديل للمصل) ، و 1.5 مل من جلايكول الإيثيلين في أنبوب واحد سعة 50 مل.
3. بالنسبة إلى VS2 (15 مل)، ماصة 10.5 مل من وسط مناولة البويضات (مكمل بألبومين مصل بشري من قبل الشركة المصنعة)، 3 مل من جلايكول الإيثيلين، و1.5 مل من SSS في أنبوب واحد سعة 50 مل.
4. بالنسبة إلى VS3 ، ماصة 8.5 مل من وسط مناولة البويضات (مكملة بألبومين مصل بشري من قبل الشركة المصنعة) ، و 5.25 مل من جلايكول الإيثيلين ، وأضف 2.57 جم من السكروز و 0.75 جم من بولي فينيل بيروليدون (PVP) في أنبوب واحد سعة 50 مل. انظر الشكل 3 للحصول على التفاصيل. امزج جميع المحاليل عن طريق الدوامة عند 3,000 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يجب إجراء جميع أعمال زراعة الأنسجة الموضحة أعلاه في غطاء التدفق الصفحي من الدرجة الثانية. قم بتنظيف مقعد التدفق الصفحي بمطهر أثناء ارتداء قفازات المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ؛ يوصى باستخدام القفازات غير المسحوقة.

3. إعداد التزجيج

1. قم بتنظيف مقعد التدفق الصفحي بمطهر السطح أثناء ارتداء قفازات المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ؛ يوصى باستخدام القفازات غير المسحوقة.
2. قم بإعداد طبق واحد من 6 آبار ، ومصفاة خلوية ، ومشرط ، وملاقط ، وخزعة 2 مم ، وطبقين دائريين مقاس 90 مم. أيضا ، قم بإعداد الوسائط: محلول الحفظ لزراعة الأنسجة و VS1-3. ماصة 5 مل من كل محلول مبرد (VS1-3) في آبار منفصلة وانتظر 30 دقيقة حتى تصل المحاليل إلى درجة حرارة الغرفة.
3. تعقيم النيتروجين السائل بنظام تشعيع الأشعة فوق البنفسجية الآلي ؛ بدلا من ذلك ، استخدم الأشعة فوق البنفسجية لغطاء التدفق الصفحي لمدة 120 دقيقة.

4. تزجيج الأنسجة

1. تحضير أنسجة قشرة المبيض عن طريق إزالة النخاع. نظرا لأن القشرة عادة ما تكون أصعب من النخاع ، فيمكن تمييزها وفصلها بسهولة.
   1. قطع أنسجة قشرة المبيض إلى الأشكال المرغوبة (10 مم × 5 مم للزرع ؛ 2 مم × 2 مم لكمات لعد البصيلات القابلة للحياة قبل وبعد التزجيج) ، كما هو موضح في الشكل 4 أ.
      ملاحظة: تجنب إتلاف الأنسجة عن طريق الضغط بقوة ، والتعامل معها بعناية. قد تختلف عينات الأنسجة بين المرضى.
2. ضع مصفاة خلوية في البئر الأول من اللوحة المكونة من 6 آبار مع VS1. قم بموازنة أنسجة قشرة المبيض لمدة 5 دقائق في 5 مل من VS1 في البئر 1 من الصفيحة المكونة من 6 آبار باستخدام مصفاة الخلية.
   1. بعد ذلك ، انقل مصفاة الخلية بأنسجة القشرة إلى البئر 2 التي تحتوي على 5 مل من VS2 ، وتوازن لمدة 5 دقائق. أخيرا ، قم بالتوازن لمدة 6 دقائق في 5 مل من VS3 ، كما هو موضح في الشكل 3 والجدول 1.
3. افتح المبردات المعدة. املأ القوارير بالنيتروجين السائل المعقم وضعها في وعاء التبريد المملوء بالنيتروجين السائل. قم بتحميل عينات الأنسجة على الشبكة المعدنية لجهاز التزجيج في غضون 1 دقيقة (الشكل 4 ب ، ج).
   1. أدخل عينات الأنسجة المحملة على الشبكة المعدنية في النيتروجين السائل في المبردات المحضرة القائمة على الشبكة (الشكل 4 د).
      ملاحظة: يعد التجميد السريع للأنسجة المحملة على الشبكة المعدنية أمرا ضروريا لنجاح هذه الطريقة. يجب إجراء جميع أعمال زراعة الأنسجة الموضحة أعلاه في غطاء التدفق الصفحي من الدرجة الثانية. قم بتنظيف مقعد التدفق الصفحي بمطهر السطح أثناء ارتداء قفازات المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ؛ يوصى باستخدام القفازات غير المسحوقة.

5. إعداد وسائط الاحترار السريع

1. قم بإعداد الحلول كما هو مذكور في الشكل 5 والجدول 2. قم بوزن السكروز لمحلول الاحترار السريع (RWS) ومحلول التوازن (ES) وانقله إلى الأنبوب. أضف وسيط مناولة البويضات (المكمل بألبومين مصل بشري من قبل الشركة المصنعة) باستخدام ماصة مصلية ومساعد على سحب العينات. أضف SSS والسكروز كما هو مذكور في الجدول 2.
2. أغلق الأنابيب واتركها تتحرك على شاكر دحرجة حتى تذوب تماما.
   ملاحظة: يجب إجراء جميع أعمال زراعة الأنسجة الموضحة أعلاه في غطاء التدفق الصفحي من الدرجة الثانية. قم بتنظيف مقعد التدفق الصفحي بمطهر السطح أثناء ارتداء قفازات المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ؛ يوصى باستخدام القفازات غير المسحوقة.

6. التحضير السريع للاحترار

1. قبل يوم واحد من الاحترار السريع ، قم بإعداد المواد الاستهلاكية وتطهيرها باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مقعد التدفق الرقائقي: قم بإعداد دورق العينة ل RWS ، واللوحة المكونة من 6 آبار ل ES و RS1 و RS2 ، ودورق العينة لنقل الأنسجة بعد الاحترار السريع. ضع ملاقط معقمة يمكن التخلص منها ومعدات سحب العينات والمواد الاستهلاكية الأخرى في مقعد التدفق الرقائقي.
2. سخن لوح التسخين إلى 37.2 درجة مئوية. احتضان RWS عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
3. قم بإعداد صفيحة معقمة مكونة من 6 آبار مع 6 مل من ES و 6 مل من RS ل "RS1" و 6 مل أخرى من RS ل "RS2" في مقعد التدفق الرقائقي. راجع الشكل 5 للحصول على رسم تخطيطي للوحة المكونة من 6 آبار. دعها تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة قبل تسخين الأنسجة.
4. انقل RWS إلى دورق عينة معقم في ظروف معقمة وضعه على لوح التسخين. يجب الحفاظ على RWS عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يتطلب الاحترار السريع معدل تسخين سريع. من الأهمية بمكان تثبيت RWS عند 37 درجة مئوية لضمان نجاح الخطوة الأولى.

7. الاحترار السريع لأنسجة المبيض

1. انقل القوارير المحفوظة بالتبريد التي تحتوي على أنسجة قشرية المبيض المزجج في النيتروجين السائل إلى مقعد التدفق الرقائقي. افتح القوارير أثناء غمرها جزئيا تحت النيتروجين السائل. اغمر الشبكة بسرعة مع الأنسجة المزججة في RWS واترك الأنسجة تجلس هناك لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية أثناء الاحترار السريع ويجب إجراؤها دون أي تأخير.
2. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة إلى ES واحتضانها لمدة 3 دقائق مع رجها برفق على شاكر هزاز.
3. اشطف المنديل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق باستخدام كل منهما باستخدام RS1 و RS2 على شاكر هزاز ، كما هو موضح في الشكل 5.
4. انقل الأنسجة الدافئة إلى دورق عينة معقم يحتوي على 5 مل من محلول الحفظ لزراعة الأنسجة ، والذي يجب الاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية لنقله إلى موقع الزرع.
   ملاحظة: يجب إجراء جميع أعمال زراعة الأنسجة الموضحة أعلاه في غطاء التدفق الصفحي من الدرجة الثانية. قم بتنظيف مقعد التدفق الصفحي بمطهر السطح أثناء ارتداء قفازات المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ؛ يوصى باستخدام القفازات غير المسحوقة.

8. تحديد صلاحية البصيلات

1. أحضر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى درجة حرارة الغرفة طوال الليل للحصول على حالة سائلة. ماصة 100 ميكرولتر من DMSO في قارورة واحدة من الكالسين وإعادة تعليقها لإذابة الكالسين. ماصة 3 ميكرولتر من الكالسين المذاب في قاع أنبوب واحد سعة 1.5 مل وتخزين القوارير عند -20 درجة مئوية.
2. ضع 0.007 جم من الكولاجيناز في أنبوب واحد سعة 1.5 مل واحفظه عند -20 درجة مئوية.
3. أضف 997 ميكرولتر من DPBS إلى 3 ميكرولتر من الكالسيين المقتبسة والمجمدة في أنبوب واحد سعة 1.5 مل ، وأعد تعليقها لإذابة الكالسين. أضف 0.007 جم من الكولاجيناز للحصول على 1000 ميكرولتر من محلول العمل.
4. استخدم 500 ميكرولتر من محلول العمل لهضم قطعتين من شظايا قشرة المبيض مقاس 2 مم لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، محمية من الضوء ، في طبق مكون من 4 آبار. بعد 60 دقيقة و 70 دقيقة ، أعد تعليق المحلول بشكل متكرر. أخيرا ، حدد صلاحية البصيلات عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، كما هو موضح في الشكل 6.

النتائج

يعرض هذا البروتوكول إجراءات تحضير وسائط التزجيج ، وأجهزة التحميل ، والتزجيج ، وإعداد وسائط الاحترار السريع ، والاحترار السريع ، وتحديد صلاحية البصيلات. تم التحقق من صحة مقارنة مباشرة بين قابلية البصيلات والعوامل الوعائية بين التجميد البطيء والتزجيج ونشرها^31،32.

تم تقييم النجاح العام لبروتوكول التزجيج الموصوف من خلال مقارنة عدد البصيلات الحيوية قبل وبعد التزجيج / الاحترار السريع. يظهر الإعداد التجريبي في الشكل 1 ، ويتم عرض النتائج في الشكل 6. في 50 مريضا ، لوحظ متوسط عدد 77.98 بصيلات حيوية قبل التزجيج و 62.99 بعد التزجيج / الاحترار السريع ، مما يعكس معدل بقاء قدره 80.8٪. لم يكن هذا مختلفا بشكل كبير وفقا لاختبار ويلكوكسون³³.

يتم تخصيص الشبكات المعدنية بشكل فردي بمقص حاد بحجم 25 مم × 8 مم ، والذي يتناسب مع أغطية 1.8 مل من التبريد ، كما هو موضح في الشكل 2 أ ، ج. بعد التعقيم باستخدام التعقيم بالبخار ، يتم تجميع الشبكات والأغطية المكونة من قوارير 1.8 مل تحت مقعد تدفق رقائقي ، كما هو موضح في الشكل 2 ب. يوفر هذا الإعداد ثباتا آمنا في الغطاء دون الحاجة إلى إجراءات إضافية ويوفر مساحة كافية للأنسجة ذات الأحجام المختلفة. عادة ما تكون قطع الأنسجة من 5 مم × 10 مم للزراعة وقطع قطرها 2 مم لتقييم عدد البصيلات الحيوية بعد الذوبان السريع مزججة. كلا الحجمين يتناسبان تماما مع الشبكات المعدنية.

يتم إجراء التوازن مع محاليل التزجيج (VS1 و VS2 و VS3) في صفيحة مكونة من 6 آبار على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة تحت مقعد تدفق رقائقي ، كما هو موضح في الشكل 3. تضمن الأطر الزمنية في المخطط الامتصاص الفعال للإيثيلين جلايكول المجعد. يوصى باستخدام صفيحة مكونة من 6 آبار فوق أوعية مفردة لأنها تسهل الحركة السريعة للأنسجة بين المحاليل وتساعد على منع الاختلاط.

من أجل التزجيج الرأسي السريع في النيتروجين السائل ، يتم تقطيع أنسجة قشرة المبيض إلى قطع مناسبة (الشكل 4 أ). يتم وضع عينات قشرة المبيض على أجهزة التحميل (الشكل 4 ب ، ج) ويتم غمرها عموديا في النيتروجين السائل (الشكل 4 د) لتحقيق حالة زجاجية من التجميع من خلال التزجيج. تسمح الشبكات المعدنية المختارة بالتعامل الرأسي مع الأنسجة ، كما هو موضح في الشكل 4 د. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الشبكات المعدنية عالية التوصيل حراريا ، مما يضمن معدلات تبريد سريعة من 22 درجة مئوية إلى -196 درجة مئوية ، وهي خطوة مهمة للغاية في عملية التزجيج.

للاحترار السريع ، يتم تحضير RWS في كوب معقم عند 37 درجة مئوية ، ويتم تحضير ES و RS1 و RS2 في صفيحة من 6 آبار على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة ، كما هو موضح في الشكل 5. يمنع الحجم الكبير من RWS الدافئ مسبقا المحلول من التبريد بشكل مفرط عند إضافة الأنسجة المزججة ويضمن بيئة دافئة باستمرار للأنسجة طوال عملية الاحترار السريع.

لتقييم وضمان معايير الجودة العالية ، يتم تلطيخ لكمات الخزعة 2 مم × 2 مم بالكالسين قبل التزجيج وبعد الاحترار السريع لتحديد صلاحية البصيلات باستخدام الفحص المجهري الفلوري^34،35 (الشكل 6). تنبعث من بصيلات قابلة للحياة مضان أخضر عند 495 نانومتر بعد امتصاص الكالسين داخل الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم صلاحية البصيلات (الجدول 3) باستخدام أصباغ حمراء محايدة³⁶.

باتباع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول ، يتم تحويل أنسجة المبيض إلى حالة زجاجية من التراكم ، مما يسهل معدلات البقاء على قيد الحياة المرتفعة بعد الاحترار السريع ، كما يؤكده الفحص المجهري الفلوري.

الشكل 1: تصميم الدراسة. تم فحص عينات قشرية المبيض من 50 مريضا قبل (طازجة) وبعد التزجيج والاحترار السريع لعدد البصيلات القابلة للحياة. لكل مجموعة ، تم زراعة قطعتين من الأنسجة بقطر 2 مم لمدة 24 ساعة قبل تقييم عدد البصيلات. تم هضم الأنسجة بالكولاجيناز وتلطيخها بالكالسين لتقييم الجدوى. تم تحديد عدد البصيلات القابلة للحياة باستخدام المجهر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحضير أجهزة التحميل. تم قطع الشبكات المعدنية بحجم 8 مم × 25 مم (A). تم تعقيم الشبكات المعدنية المخصصة عن طريق التعقيم (ب). ثم تم إدخال الشبكات المعدنية المعقمة في أغطية من قوارير سعة 1.8 مل ، جاهزة للاستخدام (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحضير محاليل التزجيج. تم تحضير محاليل التزجيج (VS) ونقلها إلى صفيحة من 6 آبار. تظهر الآبار حجم كل محلول وأوقات الحضانة الفردية المستخدمة في بروتوكول التزجيج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: معالجة قشرة المبيض وتزجيجها. تمت معالجة أنسجة قشرة المبيض للحفظ بالتبريد عن طريق إزالة النخاع وتقطيع الأنسجة إلى قطع 5 مم × 10 مم (A). بعد الحضانة في محاليل التزجيج الموضحة في الشكل 3 ، تم تحميل الأنسجة على جهاز تحميل التزجيج (B ، C). من أجل التزجيج الرأسي السريع لعينات قشرة المبيض ، تم إدخال الأغطية ذات الأنسجة المحملة بسرعة في النيتروجين السائل المعقم (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تحضير حلول الاحترار السريع. تم تحضير محلول الاحترار السريع (RWS) ومحلول التوازن (ES) ومحاليل الشطف (RS) 1 و 2 ونقلها إلى صفيحة مكونة من 6 آبار. تظهر الأوعية والآبار حجم كل محلول وأوقات الحضانة المقابلة. لاحظ أن RWS يتم الحفاظ عليه عند 37.2 درجة مئوية على لوحة التسخين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: عدد الجدوى. لتقييم عدد البصيلات القابلة للحياة ، تم هضم قطع الأنسجة التي يبلغ قطرها 2 مم بالكولاجيناز وتلطيخها بالكالسين. تظهر الصور التمثيلية (أ) تلطيخ الكالسين ل 3 بصيلات مستردة قبل التزجيج. (ب) جريب قابل للحياة بعد التزجيج والاحترار السريع. (ج) جريب قابل للحياة تم استرداده قبل التجميد البطيء. (د) استعادة بصيلات قابلة للحياة بعد التجميد والذوبان البطيء. يشار إلى صلاحية البصيلات بواسطة الكالسيين ، وهي صبغة فلورية خضراء تنبعث منها مضان أخضر عند تحويلها إنزيميا بواسطة خلايا قابلة للحياة عند 495 نانومتر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مقابل 1 (15 مل)	جلايكول الإيثيلين	10%	1.5 مل
	SSS	10%	1.5 مل
	جي MOPS +		12 مل
VS 2 (15 مل)	جلايكول الإيثيلين	20%	3 مل
	SSS	10%	1.5 مل
	جي MOPS +		10.5 مل
VS 3 (15 مل)	جلايكول الإيثيلين	35%	5.25 مل
	SSS	10%	1.5 مل
	سكروز	0.5 مول / لتر	2.57 جرام
	لاعب ضد لاعب	5 ٪ (وزن حجمي)	0.75 جرام
	جي MOPS +		إعلان 15 مل

الجدول 1: تكوين محاليل التزجيج (VS).

RWS (30 مل)	سكروز	0.8 مول / لتر
			8.22 جرام
	SSS	10%	3 مل
	جي MOPS +		إعلان 30 مل
ES (15 مل)	سكروز	0.4 مول / لتر	2.05 جرام
	SSS	10%	1.5 مل
	جي MOPS +		إعلان 15 مل
RS 1 & 2 (15 مل)	SSS	10%	1.5 مل
	جي MOPS +		إعلان 15 مل

الجدول 2: تكوين محلول الاحترار السريع (RWS) ، ومحلول التوازن (ES) ، ومحاليل الشطف (RS). يوفر هذا الجدول مكونات وتركيزات محلول الاحترار السريع (RWS) ومحلول التوازن (ES) ومحاليل الشطف (RS) المستخدمة في معالجة ما بعد التزجيج.

البارامتر	طازج	فترة	تسخين سريع بعد التزجيج	فترة	n	*قيمة P
		[سد]		[سد]
عدد الجدوى الجرابية [ن]	77.98	0-386	62.99	0.5-349	50	0.130
		77.95		80.02
* اختبار ويلكوكسون

الجدول 3: النتائج التمثيلية للبقاء الجريبي. يعرض هذا الجدول نتائج تقييمات صلاحية البصيلات قبل الحفظ بالتبريد وبعد الاحترار السريع. تم استخدام قطعتين من الأنسجة بقطر 2 مم لكل مريض لحساب عدد البصيلات القابلة للحياة قبل وبعد التزجيج / الاحترار السريع. تم تحليل عينات الأنسجة المزدوجة من 50 مريضا باستخدام اختبار ويلكوكسون.

Discussion

هنا ، يتم تقديم بروتوكول للتزجيج عالي الإنتاجية لأنسجة قشرة المبيض البشرية ، مناسب للروتين السريري. على غرار تزجيج البويضات أو الأجنة ، يتطلب التطبيق الناجح للإجراء التزاما مفصلا بالبروتوكول المتعلق بدرجة حرارة محاليل التزجيج والاحترار ، بالإضافة إلى فترة التوازن. من الضروري أيضا الامتثال لتوجيهات الاتحاد الأوروبي^{للأنسجة 37} فيما يتعلق بجودة الهواء والعقيم.

ينتج عن إجراء التزجيج حالة غير بلورية أو غير متبلورة أو زجاجية. بشكل عام ، يعد التزجيج عملية متعددة الاستخدامات لها آثار كبيرة في مختلف المجالات العلمية والتكنولوجية. الفائدة الأساسية للتزجيج هي قدرته على تحويل الأنسجة إلى حالة زجاجية ، وبالتالي منع تكوين بلورات الثلج^38،39،40 ، مما قد يؤثر سلبا على سلامة الأنسجة ومكوناتها.

تسمح مكملات عوامل الحماية من التبريد (CPAs) بالبولي فينيل بيروليدون (PVP) بتقليل تركيز CPA دون المساس بجودة محاليل التزجيج^41،42. علاوة على ذلك ، يوفر استخدام الشبكات المعدنية موصلية حرارية عالية مقارنة بأنظمة الناقل القائمة على البلاستيك. يسهل هيكل الشبكة أيضا التصاق السطح ، مما يضمن الحفظ بالتبريد الآمن والآمن لعينات الأنسجة ولكمات القشرة الصغيرة لتدابير الجودة. إذا تم استخدام أوعية التبريد من الشركات المصنعة الأخرى ، فمن المهم اختبار حجم الشبكات المعدنية مسبقا لضمان الثبات والقبضة المناسبة داخل غطاء cryovessel ، بالإضافة إلى ملاءمتها بشكل جيد للوعاء.

تشمل الخطوات الحاسمة لضمان التزجيج الناجح التزجيج السريع عن طريق غمر الأنسجة في النيتروجين السائل المعقم وإجراء الاحترار السريع دون تأخير لتجنب النتائج السلبية. من حيث الفعالية من حيث التكلفة ، فإن تزجيج الأنسجة أقل تطلبا مقارنة بإجراء التجميد البطيء ، مما قد يؤثر على تخطيط نشر الأفراد. بالإضافة إلى ذلك ، يلغي التزجيج الحاجة إلى شراء وخدمة المعدات اللازمة للتجميد البطيء.

أظهرت المقاييس البيولوجية والتحليلات التلوية قابلية المقارنة أو حتى مزايا التزجيج مقارنة بالتجميد^{البطيء 43}. ومع ذلك، يمكن أن تعزى الاختلافات في النتائج بعد التزجيج إلى عدم وجود تقييس في كل من جهاز التزجيج والبروتوكول، بما في ذلك المحاليل المستخدمة، والتي تختلف عبر الدراسات. يجب أن تستكشف الأبحاث المستقبلية إمكانات زراعة البصيلات من الأنسجة المزججة / سريعة التسخين لمراقبة النمو في المختبر ، كما هو موضح بنجاح في أنسجة مبيض الفأر من قبل عدة مجموعات^{44،45،46،47،48،49،50}.

باختصار ، يعد تزجيج أنسجة المبيض بديلا مهما لبروتوكول التجميد البطيء المستخدم على نطاق واسع ، مدعوما بخمس ولادات ناجحة أبلغت عنها سوزوكي⁵¹ (اليابان) ، سيلبر⁵² (الولايات المتحدة الأمريكية) ، وسانجر⁵³ (ألمانيا). على عكس وسائط ومجموعات التزجيج المتاحة تجاريا للخلايا ، هناك عدد قليل من الأنظمة المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية / CE لأنسجة المبيض ، والتي قد تحد من تطبيقها في البيئات السريرية. لذلك ، يوصى بتطوير مجموعات ووسائط معتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية / CE للتزجيج والاحترار السريع لأنسجة المبيض³⁰.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL vials	VWR International GmbH	479-6837
10 mL serological pipette	Sarstedt	86.1254.001
4 well plate	Gynemed	GYOOPW-FW04
50 mL Tube	Sarstedt	62.559.001
6 well plates	Sarstedt	83.3920
Bacillol AF	Hartmann	973385
Calcein AM	Merck	17783
Collagenase type 1A	Merck	C2674
Cryosure DMSO	WAK Chemie	WAK-DMSO-10
Custodiol	Dr. Franz Köhler Chemie	00867288
DPBS CTS	Gibco Life technologies	A12856-01
ErgoOne pipette aid	Starlab	S7166-0010
Ethylene glycol	Sigma Aldrich	102466
Euronda sterilization container	euronda	282021
G-MOPS+	Vitrolife	10130
Metal meshes	Sigma Aldrich	S0770
Metzenbaum scissors	world precision instruments	501262102
N-Bath System	Nterilizer	N-Bath 3.0
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	SAGE	ART-4005
Serum substitute supplement (SSS)	Fujifilm Irvine scientific	99193
Sterile cup	Sarstedt	75.562.105
Sterile forceps	Carl Roth	KL05.1
Sucrose	Merck	S0389