Представлен протокол витрификации ткани яичника, как альтернативный метод криоконсервации широко используемому протоколу медленной заморозки.
Криоконсервация ткани яичников (ОТК) является важным вариантом сохранения фертильности. Для пациенток, чье гонадотоксическое лечение не может быть отложено, или для девочек препубертатного возраста, это часто является единственным вариантом защиты фертильности. Криоконсервация может быть выполнена как методом витрификации, так и методом медленной заморозки. Медленная заморозка в настоящее время является стандартным подходом. Все большее число исследований указывает на то, что витрификация может заменить медленное замораживание в современных лабораториях экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), значительно улучшая показатели выживаемости при размораживании и упрощая технические аспекты криоконсервации. Описан протокол на основе металлической сетки с высокой пропускной способностью для быстрой витрификации ткани коры яичников, подходящий для клинической рутины. Стерилизация металлических решеток и жидкий азот обеспечивают высокое качество, соответствующее стандартам надлежащей производственной практики (GMP). Витрификация была проведена для обеспечения сверхбыстрой скорости охлаждения. Вместо медленного размораживания образцы быстро нагревались. Для оценки жизнеспособности фолликулов окрашивание кальцеином проводили как до криоконсервации, так и после быстрого прогревания. Сообщается об успешном применении остекловывания и быстром прогревании с использованием металлических сеток. До витрификации и после быстрого потепления не наблюдалось существенных различий в жизнеспособности фолликулов. Эти результаты обосновывают высокую способность витрификации тканей для клинического рутинного применения в качестве потенциальной замены широко используемого метода медленной заморозки.
Криоконсервация ткани яичников является важным вариантом сохранения фертильности. Эксплантированная ткань, содержащая фолликулы яичников, в которые встроены ооциты, криоконсервируется. После хранения ткань яичника может быть разморожена, согрета и реимплантирована пациентке. Для жизнеспособных клеток или тканей доступны два метода криоконсервации: медленная заморозка и витрификация1.
Витрификация используется для сохранения биологических материалов, таких как эмбрионы и ооциты, с более высокими показателями выживаемости по сравнению с протоколом медленной заморозки 1,2,3,4. Медленное замораживание имеет ограничения, такие как образование кристаллов льда, которые потенциально могут повредить клеточные и тканевые структуры. Тем не менее, медленная заморозка является важным подходом к криоконсервации, который способствует долгосрочному хранению биологических образцов, и функциональность этого методашироко доказана5. Витрификация вызывает стеклообразное состояние агрегата, предотвращая образование кристаллов льда 6,7. На техническом уровне витрификация значительно упрощает процедуру криоконсервации за счет сокращения технического обслуживания оборудования, снижения вероятности технических ошибок и сокращения продолжительностипроцесса криоконсервации8,9. В деле сохранения женской фертильности криоконсервация ткани яичников является решающим подходом перед лечением рака10. В различных группах была успешно продемонстрирована концепция криоконсервации, размораживания и трансплантации тканей на основе протокола медленного замораживания 11,12,13,14, который в настоящее время рассматривается как стандартный подход15.
Витрификация ткани яичников рассматривается как перспективный альтернативный метод 16,17,18,19,20,21, с точки зрения ресурсосберегаемости22, выживаемости фолликулов, уровней фрагментации ДНК и сбалансированного ангиогенного потенциала 23,24,25,26,27. Это подтверждается успешными поставками вЯпонию 28, США29,Германию 30.
Сравнение двух вариантов криоконсервации ткани яичников (ОТС)-витрификации со стандартной процедурой медленной заморозки частично противоречат друг другу в современных мета-анализах16. Этому могли способствовать несколько факторов, поскольку современные протоколы витрификации сильно различаются. К таким различиям относятся выбор криопротектора или комбинации протекторов, их концентрация, состав безрецептурных сред, размер фрагментов тканей, а также устройство, используемое в качестве тканевого носителя. Соответственно, нет и стандартизированного протокола потепления.
Поскольку авторы нашли метод, который дает убедительные результаты с точки зрения обработки, жизнеспособности, начала апоптоза, высвобождения ангиогенных факторов и даже сообщения о рождении после реимплантации, приводится очень подробное описание протокола. Описанный метод предлагает действенный и эффективный протокол, который может способствовать стандартизации витрификации ткани яичников.
Исследование было одобрено комитетом по этике Университетской клиники Бонна (007/09). От каждого пациента было получено письменное информированное согласие. В исследуемую группу была включена ткань яичников человека от 50 пациенток, средний возраст которых до криоконсервации составлял 27,4 года, как показано на рисунке 1. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.
1. Подготовка загрузочных устройств
2. Подготовка сред для остекловывания
3. Подготовка к остекловыванию
4. Витрификация тканей
5. Приготовление быстросогревающих сред
6. Быстрая подготовка к разогреванию
7. Быстрое прогревание тканей яичников
8. Определение жизнеспособности фолликулов
В этом протоколе представлены процедуры приготовления витрификационных сред, нагрузочных устройств, витрификации, приготовления быстрых согревающих сред, быстрого согревания и определения жизнеспособности фолликулов. Прямое сравнение жизнеспособности фолликулов и ангиогенных факторов между медленным замораживанием и витрификацией было валидировано и опубликовано31,32.
Общий успех описанного протокола витрификации оценивали путем сравнения количества жизненно важных фолликулов до и после витрификации/быстрого потепления. Экспериментальная установка показана на рисунке 1, а результаты представлены на рисунке 6. У 50 пациентов среднее количество жизненно важных фолликулов составляло 77,98 до витрификации и 62,99 после витрификации/быстрого нагревания, что соответствует выживаемости 80,8%. Это существенно не отличалось по сравнению с тестом Вилкоксона33.
Металлические сетки индивидуально подгоняются острыми ножницами до размера 25 мм х 8 мм, который помещается в колпачки криовиалов объемом 1,8 мл, как показано на рисунке 2A, C. После стерилизации с помощью парового автоклавирования решетки и колпачки флаконов объемом 1,8 мл собираются под стендом ламинарного потока, как показано на рисунке 2В. Такая установка обеспечивает надежную фиксацию в колпачке без необходимости дополнительных действий и предлагает достаточную площадь для тканей различных размеров. Как правило, витрифицируются кусочки ткани размером 5 мм x 10 мм для трансплантации и кусочки диаметром 2 мм для оценки жизненно важного количества фолликулов после быстрого размораживания. Оба размера идеально ложатся на металлические решетки.
Уравновешивание с помощью растворов для витрификации (VS1, VS2 и VS3) проводится в 6-луночном планшете на качающемся вибростенде при комнатной температуре под ламинарным проточным стендом, как показано на рисунке 3. Временные рамки в схеме обеспечивают эффективное поглощение криопротектора этиленгликоля. Рекомендуется использовать 6-луночный планшет над отдельными сосудами, так как это способствует быстрому перемещению ткани между растворами и помогает предотвратить путаницу.
Для быстрой вертикальной витрификации в жидком азоте ткань коры яичников разрезается на подходящие куски (рисунок 4А). Образцы коры яичников помещают на загрузочные устройства (рис. 4B, C) и погружают вертикально в жидкий азот (рис. 4D) для достижения стеклообразного агрегатного состояния путем витрификации. Выбранные металлические сетки позволяют осуществлять вертикальную обработку ткани, как показано на рисунке 4D. Кроме того, металлические решетки обладают высокой теплопроводностью, что обеспечивает быструю скорость охлаждения от 22 °C до -196 °C, что является критически важным этапом в процессе остеклования.
Для быстрого прогрева RWS готовят в стерильной чашке при 37 °C. ES, RS1 и RS2 готовят в 6-луночном планшете на качающемся шейкере при комнатной температуре, как показано на рисунке 5. Большой объем предварительно нагретой RWS предотвращает чрезмерное охлаждение раствора при добавлении витрифицированной ткани и обеспечивает постоянно теплую среду для ткани на протяжении всего процесса быстрого нагрева.
Для оценки и обеспечения высоких стандартов качества биопсийные пункции размером 2 мм x 2 мм окрашивают кальцеином перед витрификацией и после быстрого нагревания для определения жизнеспособности фолликулов с помощью флуоресцентной микроскопии34,35 (Рисунок 6). Жизнеспособные фолликулы излучают зеленую флуоресценцию на длине волны 495 нм после внутриклеточного поглощения кальцеина. В качестве альтернативы жизнеспособность фолликулов (Таблица 3) может быть оценена с использованием нейтральных красных красителей36.
Следуя описанным шагам в этом протоколе, ткань яичников преобразуется в стеклообразное агрегатное состояние, что способствует высоким показателям выживаемости после быстрого нагревания, что подтверждено флуоресцентной микроскопией.
Рисунок 1: Дизайн исследования. Образцы коры яичников у 50 пациенток исследовали до (свежие) и после витрификации и быстрого прогревания на количество жизнеспособных фолликулов. Для каждой группы в течение 24 ч до оценки количества фолликулов культивировали два кусочка ткани диаметром 2 мм. Ткань расщепляли коллагеназой и окрашивали кальцеином для оценки жизнеспособности. Количество жизнеспособных фолликулов определяли с помощью микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Подготовка загрузочных устройств. Металлические сетки были нарезаны до размера 8 мм х 25 мм (А). Изготовленные по индивидуальному заказу металлические сетки были стерилизованы автоклавированием (В). Затем стерилизованные металлические сетки помещали в колпачки объемом 1,8 мл, готовые к использованию (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Приготовление растворов для остекловывания. Готовили растворы для витрификации (ВС) и переносили их в 6-луночный планшет. Лунки показывают объем каждого раствора и индивидуальное время инкубации, используемое в протоколе витрификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Обработка коры яичников и витрификация. Ткань коры яичников обрабатывали для криоконсервации путем удаления мозгового вещества и разрезания ткани на кусочки размером 5 мм х 10 мм (А). После инкубации в растворах для витрификации, показанных на рисунке 3, ткань загружали в загрузочное устройство витрификации (B,C). Для быстрой вертикальной витрификации образцов коры яичников колпачки с загруженной тканью быстро вводили в стерилизованный жидкий азот (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Приготовление растворов для быстрого прогревания. Быстро нагревающий раствор (RWS), уравновешивающий раствор (ES) и промывочные растворы (RS) 1 и 2 готовили и переносили на 6-луночный планшет. На сосудах и лунках отображается объем каждого раствора и соответствующее время инкубации. Обратите внимание, что RWS поддерживается на уровне 37,2 °C на нагревательной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Подсчет жизнеспособности. Для оценки количества жизнеспособных фолликулов кусочки ткани диаметром 2 мм расщепляли коллагеназой и окрашивали кальцеином. Репрезентативные изображения показывают (А) окрашивание кальцеином 3 восстановленных фолликулов до витрификации. (B) Восстановленный жизнеспособный фолликул после витрификации и быстрого нагревания. (C) Восстановленный жизнеспособный фолликул до медленной заморозки. (D) Восстановленные жизнеспособные фолликулы после медленного замораживания и оттаивания. На жизнеспособность фолликулов указывает кальцеин, зеленый флуоресцентный краситель, который излучает зеленую флуоресценцию при ферментативном преобразовании жизнеспособными клетками при длине волны 495 нм. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
VS 1 (15 мл) | Этиленгликоль | 10% | 1,5 мл |
СНО | 10% | 1,5 мл | |
G-MOPS+ | 12 мл | ||
VS 2 (15 мл) | Этиленгликоль | 20% | 3 мл |
СНО | 10% | 1,5 мл | |
G-MOPS+ | 10,5 мл | ||
VS 3 (15 мл) | Этиленгликоль | 35% | 5,25 мл |
СНО | 10% | 1,5 мл | |
Сахароза | 0,5 моль/л | 2,57 г | |
ПВП | 5 % (по объему) | 0,75 г | |
G-MOPS+ | ад 15 мл |
Таблица 1: Состав растворов для витрификации (ВС).
RWS (30 мл) | Сахароза | 0,8 моль/л | |
8,22 г | |||
СНО | 10% | 3 мл | |
G-MOPS+ | около 30 мл | ||
ES (15 мл) | Сахароза | 0,4 моль/л | 2,05 г |
СНО | 10% | 1,5 мл | |
G-MOPS+ | ад 15 мл | ||
RS 1 и 2 (15 мл) | СНО | 10% | 1,5 мл |
G-MOPS+ | ад 15 мл |
Таблица 2: Состав раствора для быстрого нагрева (RWS), уравновешивающего раствора (ES) и промывочных растворов (RS). В этой таблице приведены компоненты и концентрации раствора для быстрого нагрева (RWS), уравновешивающего раствора (ES) и промывочных растворов (RS), используемых при обработке после остеклования.
Параметр | Свежий | Интервал | Быстрый прогрев после остеклования | Интервал | n | *P-значение |
СД | СД | |||||
Количество жизнеспособности фолликулов [n] | 77.98 | 0-386 | 62.99 | 0.5-349 | 50 | 0.130 |
77.95 | 80.02 | |||||
*Тест Вилкоксона |
Таблица 3: Репрезентативные результаты жизнеспособности фолликулов. В данной таблице представлены результаты оценки жизнеспособности фолликулов до криоконсервации и после быстрого нагревания. С помощью двух кусочков ткани диаметром 2 мм на пациента подсчитывали количество жизнеспособных фолликулов до и после витрификации/быстрого нагревания. Парные образцы тканей 50 пациентов были проанализированы с помощью теста Вилкоксона.
Здесь представлен протокол высокопроизводительной витрификации ткани коры яичников человека, подходящий для клинической рутины. Подобно витрификации ооцитов или эмбрионов, успешное применение процедуры требует тщательного соблюдения протокола, касающегося температуры витрификационных и согревающих растворов, а также периода равновесия. Соблюдение Директивы ЕС37 по качеству воздуха и стерильности также имеет важное значение.
Процедура витрификации приводит к некристаллическому, аморфному или стекловидному состоянию. В целом, витрификация является универсальным процессом, имеющим значительные последствия в различных научных и технологических областях. Основным преимуществом витрификации является ее способность переводить ткань в стеклообразное состояние, тем самым предотвращая образование кристаллов льда 38,39,40, которые могут негативно повлиять на целостность ткани и ее компонентов.
Добавление криопротекторов (КИП) поливинилпирролидоном (ПВП) позволяет снизить концентрацию ХПА без ущерба для качества растворов для витрификации41,42. Кроме того, использование металлических решеток обеспечивает высокую теплопроводность по сравнению с несущими системами на основе пластика. Сетчатая структура также облегчает адгезию поверхности, обеспечивая безопасную и надежную криоконсервацию образцов тканей и небольшие отверстия в коре головного мозга для измерения качества. Если используются криогенные сосуды других производителей, важно предварительно проверить размер металлических решеток, чтобы обеспечить устойчивость и правильное сцепление внутри крышки криососуда, а также хорошую посадку в сосуд.
Важнейшие шаги для обеспечения успешной витрификации включают быструю витрификацию путем погружения ткани в стерилизованный жидкий азот и выполнение быстрого нагревания без промедления во избежание неблагоприятных результатов. С точки зрения экономической эффективности, витрификация тканей менее требовательна по сравнению с процедурой медленной заморозки, что может повлиять на планирование распределения персонала. Кроме того, остеклование избавляет от необходимости приобретать и обслуживать оборудование, необходимое для медленной заморозки.
Биологические измерения и метаанализы продемонстрировали сопоставимость или даже преимущества витрификации по сравнению с медленным замораживанием43. Тем не менее, различия в результатах после витрификации могут быть связаны с отсутствием стандартизации как в устройстве для витрификации, так и в протоколе, включая используемые решения, которые варьируются в разных исследованиях. Будущие исследования должны изучить потенциал культивирования фолликулов из витрифицированной/быстро разогретой ткани для мониторинга роста in vitro, что было успешно продемонстрировано в ткани яичников мышей несколькими группами 44,45,46,47,48,49,50.
Таким образом, витрификация ткани яичников является важной альтернативой широко используемому протоколу медленной заморозки, чему способствовали пять успешных доставок, о которых сообщили Suzuki51 (Япония), Silber52 (США) и Sänger53 (Германия). В отличие от коммерчески доступных сред для витрификации и наборов для клеток, существует мало одобренных FDA/CE систем для ткани яичников, что может ограничивать их применение в клинических условиях. Поэтому рекомендуется разработка одобренных FDA/CE наборов и сред для витрификации и быстрого нагрева ткани яичников30.
Никакой.
Мы благодарим Кару Фербер за корректуру; Катарине Воллершайм, Мартину Мальбергу, Леа Корте и Ясмин Ребхольц за техническую помощь.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.8 mL vials | VWR International GmbH | 479-6837 | |
10 mL serological pipette | Sarstedt | 86.1254.001 | |
4 well plate | Gynemed | GYOOPW-FW04 | |
50 mL Tube | Sarstedt | 62.559.001 | |
6 well plates | Sarstedt | 83.3920 | |
Bacillol AF | Hartmann | 973385 | |
Calcein AM | Merck | 17783 | |
Collagenase type 1A | Merck | C2674 | |
Cryosure DMSO | WAK Chemie | WAK-DMSO-10 | |
Custodiol | Dr. Franz Köhler Chemie | 00867288 | |
DPBS CTS | Gibco Life technologies | A12856-01 | |
ErgoOne pipette aid | Starlab | S7166-0010 | |
Ethylene glycol | Sigma Aldrich | 102466 | |
Euronda sterilization container | euronda | 282021 | |
G-MOPS+ | Vitrolife | 10130 | |
Metal meshes | Sigma Aldrich | S0770 | |
Metzenbaum scissors | world precision instruments | 501262102 | |
N-Bath System | Nterilizer | N-Bath 3.0 | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | SAGE | ART-4005 | |
Serum substitute supplement (SSS) | Fujifilm Irvine scientific | 99193 | |
Sterile cup | Sarstedt | 75.562.105 | |
Sterile forceps | Carl Roth | KL05.1 | |
Sucrose | Merck | S0389 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены