ויטריפיקציה של רקמת קליפת המוח השחלתית להשגת מצב זגוגי של צבירה

Summary

מוצג פרוטוקול לוויטריפיקציה של רקמת השחלה, כשיטת שימור הקפאה חלופית להקפאה איטית הנפוצה.

Abstract

שימור רקמת שחלה בהקפאה (OTC) הוא אופציה חשובה לשימור פוריות. עבור מטופלות שלא ניתן לדחות את הטיפולים הגונדוטוקסיים שלהן או עבור נערות לפני גיל ההתבגרות, זו לעתים קרובות האפשרות היחידה להגנה על פוריות. שימור בהקפאה יכול להתבצע על ידי ויטריפיקציה או על ידי הקפאה איטית. הקפאה איטית היא כיום הגישה הסטנדרטית. מספר גדל והולך של מחקרים מצביעים על כך שויטריפיקציה יכולה להחליף הקפאה איטית במעבדות המתקדמות ביותר להפריה חוץ גופית (IVF), לשפר משמעותית את שיעורי ההפשרה ולפשט את ההיבטים הטכניים של שימור בהקפאה. מתואר פרוטוקול מבוסס רשת מתכת, בתפוקה גבוהה לוויטריפיקציה מהירה של רקמת קליפת השחלות, המתאים לשגרה קלינית. עיקור רשתות מתכת וחנקן נוזלי מבטיח איכות גבוהה ועמידה בתקני תנאי ייצור נאותים (GMP). הוויטריפיקציה בוצעה כדי להבטיח קצבי קירור אולטרה-מהירים. במקום להפשיר לאט, הדגימות התחממו במהירות. כדי להעריך את הכדאיות הפוליקולרית, צביעת קלצאין בוצעה הן לפני שימור בהקפאה והן לאחר התחממות מהירה. היישום המוצלח של ויטריפיקציה והתחממות מהירה באמצעות רשתות מתכת מדווח. לא נצפו הבדלים משמעותיים בכדאיות הזקיקים לפני הוויטריפיקציה ולאחר ההתחממות המהירה. תוצאות אלה מאששות את הקיבולת הגבוהה של ויטריפיקציה רקמתית ליישומים קליניים שגרתיים כתחליף פוטנציאלי לשיטת ההקפאה האיטית הנפוצה.

Introduction

שימור בהקפאה של רקמת השחלה הוא אופציה חשובה לשימור פוריות. רקמה מושתלת המכילה זקיקי שחלות, שבה מוטמעים ביציות, נשמרת בהקפאה. לאחר האחסון, ניתן להפשיר, לחמם ולהשתיל מחדש את רקמת השחלה במטופלת. עבור תאים או רקמות קיימא, שתי שיטות שימור קריוגני זמינות: הקפאה איטית ויטריפיקציה¹.

ויטריפיקציה משמשת לשימור חומרים ביולוגיים, כגון עוברים וביציות, עם שיעורי הישרדות גבוהים יותר בהשוואה לפרוטוקול הקפאה איטית 1,2,3,4. להקפאה איטית יש מגבלות, כגון היווצרות גבישי קרח, שעלולים לפגוע במבני תאים ורקמות. עם זאת, הקפאה איטית היא גישה חשובה לשימור בהקפאה המאפשרת אחסון לטווח ארוך של דגימות ביולוגיות, והפונקציונליות של שיטה זו הוכחה באופן נרחב⁵. ויטריפיקציה גורמת למצב זכוכית של צבירה, ומונעת היווצרות גבישי קרח ^6,7. ברמה הטכנית, ויטריפיקציה מפשטת באופן משמעותי את הליך ההקפאה על ידי הפחתת תחזוקת הציוד, הפחתת הסבירות לשגיאות טכניות וקיצור משך תהליך ההקפאה ^8,9. בשימור פוריות האישה, שימור רקמת שחלה בהקפאה הוא גישה מכרעת לפני טיפול בסרטן¹⁰. קבוצות שונות הדגימו בהצלחה את הרעיון של שימור בהקפאה, הפשרה והשתלה של רקמה בהתבסס על פרוטוקול הקפאה איטית 11,12,13,14, הנחשב כיום לגישה הסטנדרטית¹⁵.

ויטריפיקציה של רקמת שחלה נחשבת לשיטה חלופית מבטיחה 16,17,18,19,20,21, במונחים של חיסכון במשאבים²², שיעורי הישרדות זקיקים, רמות פיצול DNA ופוטנציאל אנגיוגני מאוזן 23,24,25,26,27. עדות לכך היא מסירות מוצלחות ביפן²⁸, ארה"ב²⁹ וגרמניה³⁰.

השוואת שתי האפשרויות לשימור רקמת שחלה בהקפאה (OTC) לעומת ההליך הסטנדרטי של תוצאות הקפאה איטית סותרות חלקית במטא-אנליזות הנוכחיות¹⁶. ייתכן שמספר גורמים תרמו לכך, שכן פרוטוקולי הוויטריפיקציה הנוכחיים משתנים מאוד. הבדלים אלה כוללים את הבחירה של cryoprotectant או שילוב של protectants, הריכוז שלהם, הרכב של מדיה OTC, את גודל שברי רקמות, ואת המכשיר המשמש נשא רקמות. בהתאם לכך, אין פרוטוקול התחממות סטנדרטי.

מכיוון שהמחברים מצאו שיטה שמניבה תוצאות משכנעות מבחינת טיפול, כדאיות, הופעת אפופטוזיס, שחרור גורמים אנגיוגניים, ואפילו דיווח על לידה לאחר השתלה מחדש ^9,27, ניתן תיאור מפורט מאוד של הפרוטוקול. השיטה המתוארת מציעה פרוטוקול תקף ויעיל שעשוי לתרום לסטנדרטיזציה של ויטריפיקציה של רקמת השחלה.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה בבית החולים האוניברסיטאי בון (007/09). התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל מטופל. קבוצת המחקר כללה רקמת שחלה אנושית מ-50 מטופלות בגיל ממוצע של 27.4 שנים לפני ההקפאה, כפי שניתן לראות באיור 1. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מכשירי טעינה

1. הכינו מספריים כירורגיים ורשתות מתכת להתאמה אישית. חתכו את רשתות הרשת לרצועות בגודל 25 מ"מ x 8 מ"מ, כפי שמצוין באיור 2A.
2. הניחו את רשתות המתכת המותאמות אישית במיכל עיקור ובאוטוקלאבה למשך שעתיים (איור 2B). לאחר autoclaving, מניחים את מיכל העיקור ובקבוקונים 1.8 מ"ל מתחת לספסל זרימה למינרית.
3. הפעל את הקרינה האולטרה סגולה (UV) של ספסל הזרימה הלמינרית למשך 30 דקות לעיקור נוסף באורך גל של 254 ננומטר.
4. פתחו את מיכל העיקור, הסירו את רשתות המתכת והכניסו אותן למכסים של בקבוקוני 1.8 מ"ל, כפי שמצוין באיור 2C. סגור את בקבוקוני 1.8 מ"ל.
   הערה: כל עבודת תרבית הרקמה המתוארת לעיל צריכה להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית Class II. נקה את ספסל הזרימה הלמינרית עם חומר חיטוי משטח תוך לבישת כפפות מעבדה חד פעמיות; מומלץ להשתמש בכפפות ללא אבקה.

2. הכנת מדיה ויטריפיקציה

1. הכינו פיפטה סרולוגית אחת של 10 מ"ל, עזר פיפטה אלקטרוני אחד ושלוש שפופרות של 50 מ"ל עבור פתרון ויטריפיקציה 1 (VS1), פתרון ויטריפיקציה 2 (VS2) ופתרון ויטריפיקציה 3 (VS3), וכן לרישום תאריך ההכנה. הפעל את הקרינה האולטרה סגולה (UV) של ספסל הזרימה הלמינרית לצורך עיקור נוסף.
2. עבור VS1 (15 מ"ל), פיפטה 12 מ"ל של מדיום טיפול בביציות (בתוספת אלבומין בסרום אנושי על ידי היצרן), 1.5 מ"ל של SSS (תוסף תחליף סרום), ו 1.5 מ"ל של אתילן גליקול לתוך צינור אחד 50 מ"ל.
3. עבור VS2 (15 מ"ל), פיפטה 10.5 מ"ל של מדיום טיפול בביציות (בתוספת אלבומין בסרום אנושי על ידי היצרן), 3 מ"ל אתילן גליקול, ו 1.5 מ"ל של SSS לתוך צינור אחד 50 מ"ל.
4. עבור VS3, פיפטה 8.5 מ"ל של מדיום טיפול בביציות (בתוספת אלבומין בסרום אנושי על ידי היצרן), 5.25 מ"ל של אתילן גליקול, ולהוסיף 2.57 גרם סוכרוז ו 0.75 גרם של פוליוויניל פירולידון (PVP) לתוך צינור אחד 50 מ"ל. ראו איור 3 לפרטים. ערבבו את כל הפתרונות על ידי מערבולות ב-3,000 סל"ד.
   הערה: כל עבודת תרבית הרקמה המתוארת לעיל צריכה להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית Class II. לנקות את ספסל זרימה למינרית עם חומר חיטוי תוך לבישת כפפות מעבדה חד פעמיות; מומלץ להשתמש בכפפות ללא אבקה.

3. הכנת ויטריפיקציה

1. נקה את ספסל הזרימה הלמינרית עם חומר חיטוי משטח תוך לבישת כפפות מעבדה חד פעמיות; מומלץ להשתמש בכפפות ללא אבקה.
2. הכינו צלחת אחת של 6 בארות, מסננת תאים, אזמל, פינצטה, ניקוב ביופסיה אחד בקוטר 2 מ"מ ושתי מנות בעלות תחתית עגולה בקוטר 90 מ"מ. כמו כן, הכינו מדיה: פתרון שימור להשתלת רקמות VS1-3. פיפטה 5 מ"ל מכל תמיסה מצוננת (VS1-3) לבארות נפרדות וממתינים 30 דקות עד שהתמיסות יגיעו לטמפרטורת החדר.
3. עיקור חנקן נוזלי באמצעות מערכת הקרנת UV אוטומטית; לחלופין, השתמש בקרינת UV של מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית למשך 120 דקות.

4. ויטריפיקציה של רקמות

1. הכן רקמת קליפת השחלות על ידי הסרת medulla. מאחר שקליפת המוח בדרך כלל קשה יותר מהמדולה, ניתן להבחין ביניהם ולהפריד ביניהם בקלות.
   1. חתכו את רקמת קליפת המוח השחלתית לצורות הרצויות (10 מ"מ x 5 מ"מ להשתלה; אגרופים בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ לספירת זקיקים בת קיימא לפני ואחרי ויטריפיקציה), כפי שמצוין באיור 4A.
      הערה: הימנע מפגיעה ברקמה על ידי לחיצה חזקה מדי, וטפל בה בזהירות. דגימות הרקמה עשויות להשתנות בין מטופלים.
2. מניחים מסננת תאים לתוך הבאר הראשונה של צלחת 6 בארות עם VS1. אזנו את רקמת קליפת המוח השחלתית למשך 5 דקות ב-5 מ"ל של VS1 בבאר 1 של צלחת 6 הבארות באמצעות מסננת התא.
   1. לאחר מכן, העבירו את מסננת התא עם רקמת קליפת המוח לבאר 2 המכילה 5 מ"ל של VS2, ושיווי משקל למשך 5 דקות. לבסוף, יש לאזן במשך 6 דקות ב-5 מ"ל של VS3, כפי שמצוין באיור 3 ובטבלה 1.
3. פתח את cryovials מוכן. מלאו את הבקבוקונים בחנקן נוזלי מעוקר והכניסו אותם לכלי הדיואר של הקריו המלא בחנקן נוזלי. טענו את דגימות הרקמה על רשת המתכת של מכשיר הוויטריפיקציה תוך דקה אחת (איור 4B,C).
   1. הכניסו את דגימות הרקמה שהוטענו ברשת המתכת לחנקן הנוזלי בקריובלים מבוססי הרשת המוכנים (איור 4D).
      הערה: הקפאה מהירה של הרקמה העמוסה ברשת המתכת חיונית להצלחת שיטה זו. כל עבודת תרבית הרקמה המתוארת לעיל צריכה להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית Class II. נקה את ספסל הזרימה הלמינרית עם חומר חיטוי משטח תוך לבישת כפפות מעבדה חד פעמיות; מומלץ להשתמש בכפפות ללא אבקה.

5. הכנת אמצעי התחממות מהירה

1. הכינו את הפתרונות כפי שמצוין באיור 5 ובטבלה 2. שוקלים את הסוכרוז לתמיסת ההתחממות המהירה (RWS) ולתמיסת שיווי המשקל (ES) ומעבירים אותו לצינור. מוסיפים את מדיום הטיפול בביציות (בתוספת אלבומין בסרום אנושי על ידי היצרן) באמצעות פיפטה סרולוגית ועזר לפיפטציה. הוסף SSS וסוכרוז כמפורט בטבלה 2.
2. סגרו את הצינורות ותנו להם להתסיס על שייקר מתגלגל עד להמסה מלאה.
   הערה: כל עבודת תרבית הרקמה המתוארת לעיל צריכה להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית Class II. נקה את ספסל הזרימה הלמינרית עם חומר חיטוי משטח תוך לבישת כפפות מעבדה חד פעמיות; מומלץ להשתמש בכפפות ללא אבקה.

6. הכנה להתחממות מהירה

1. יום לפני ההתחממות המהירה, הכינו את החומרים המתכלים וטיהרו אותם באמצעות אור UV בספסל הזרימה הלמינרית: הכינו את הדגימה עבור RWS, את צלחת 6 הקידוחים עבור ES, RS1 ו-RS2, ואת הדגימה להובלת רקמות לאחר התחממות מהירה. הניחו פינצטה סטרילית חד פעמית, ציוד צנרת וחומרים מתכלים אחרים בספסל הזרימה הלמינרית.
2. מחממים צלחת חימום ל 37.2 מעלות צלזיוס. לדגור RWS ב 37 ° C במשך 1 שעה לפחות.
3. הכינו צלחת סטרילית של 6 בארות עם 6 מ"ל של ES, 6 מ"ל של RS עבור "RS1", ועוד 6 מ"ל של RS עבור "RS2" בספסל הזרימה הלמינרית. עיינו באיור 5 להמחשה סכמטית של לוח 6 הקידוחים. תן להם לדגור בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה לפני חימום הרקמה.
4. מעבירים RWS לכוס דגימה סטרילית בתנאים סטריליים ומניחים אותה על פלטת החימום. RWS צריך להישמר ב 37 °C (77 °F).
   הערה: התחממות מהירה דורשת קצב התחממות מהיר. חיוני להחזיק את ה-RWS בטמפרטורה של 37°C כדי להבטיח את הצלחת הצעד הראשון.

7. התחממות מהירה של רקמת השחלות

1. העבירו את הבקבוקונים השמורים בהקפאה המכילים רקמת קליפת המוח השחלתית המזוגגת בחנקן נוזלי לספסל הזרימה הלמינרית. פתח את הבקבוקונים בזמן שהם שקועים חלקית תחת חנקן נוזלי. השקיעו במהירות את הרשת עם הרקמה המזוגגת לתוך RWS ותנו לרקמה לשבת שם במשך דקה אחת ב 37 °C.
   הערה: זהו השלב הקריטי ביותר במהלך התחממות מהירה ויש לבצע אותו ללא כל דיחוי.
2. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את הרקמה ל-ES ודורים עליה במשך 3 דקות תוך כדי ניעור עדין על שייקר נדנדה.
3. שטפו את הרקמה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כל אחת עם RS1 ו-RS2 על שייקר נדנדה, כפי שמצוין באיור 5.
4. מעבירים את הרקמה המחוממת לכוס דגימה סטרילית המכילה 5 מ"ל של תמיסת שימור להשתלת רקמות, אותה יש להחזיק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לצורך הובלה לאתר ההשתלה.
   הערה: כל עבודת תרבית הרקמה המתוארת לעיל צריכה להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית Class II. נקה את ספסל הזרימה הלמינרית עם חומר חיטוי משטח תוך לבישת כפפות מעבדה חד פעמיות; מומלץ להשתמש בכפפות ללא אבקה.

8. קביעת כדאיות זקיקים

1. הביאו דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לקבל מצב נוזלי. פיפטה 100 μL של DMSO לתוך בקבוקון אחד של calcein ו resuspend כדי להמיס את calcein. פיפטה 3 μL של calcein מומס לתוך החלק התחתון של צינור אחד 1.5 מ"ל ולאחסן את הבקבוקונים ב -20 ° C.
2. מניחים 0.007 גרם של collagenase בצינור אחד של 1.5 מ"ל ואחסנו אותו ב -20 °C.
3. הוסף 997 μL של DPBS ל- 3 μL של calcein בצינור אחד של 1.5 מ"ל, והשהה מחדש כדי להמיס את הקלצאין. הוסף 0.007 גרם של collagenase כדי לקבל 1000 μL של פתרון עבודה.
4. השתמש 500 μL של פתרון העבודה כדי לעכל שתי חתיכות של 2 מ"מ קליפת המוח השחלתית במשך 90 דקות ב 37 ° C, מוגן מפני אור, בצלחת 4 באר. לאחר 60 דקות ו-70 דקות, השהה מחדש את הפתרון שוב ושוב. לבסוף, קבעו את הכדאיות הפוליקולרית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כפי שמוצג באיור 6.

תוצאות

פרוטוקול זה מציג את הנהלים להכנת אמצעי ויטריפיקציה, מכשירי טעינה, ויטריפיקציה, הכנת אמצעי התחממות מהירה, התחממות מהירה וקביעת כדאיות זקיקים. השוואה ישירה של כדאיות זקיקים וגורמים אנגיוגניים בין הקפאה איטית לוויטריפיקציה אומתה ופורסמה^31,32.

ההצלחה הכוללת של פרוטוקול הוויטריפיקציה המתואר הוערכה על ידי השוואת ספירת הזקיקים החיוניים לפני ואחרי ויטריפיקציה/התחממות מהירה. מערך הניסוי מוצג באיור 1, והתוצאות מוצגות באיור 6. ב-50 חולים נצפתה ספירה ממוצעת של 77.98 זקיקים חיוניים לפני ויטריפיקציה ו-62.99 לאחר ויטריפיקציה/התחממות מהירה, המשקפת שיעור הישרדות של 80.8%. זה לא היה שונה באופן משמעותי על פי מבחן וילקוקסון³³.

רשתות מתכת מותאמות אישית עם מספריים חדים לגודל של 25 מ"מ x 8 מ"מ, אשר מתאים למכסים של קריובלים של 1.8 מ"ל, כפי שמוצג באיור 2A,C. לאחר עיקור באמצעות אוטוקלאבינג בקיטור, הרשתות והמכסים של בקבוקונים בנפח 1.8 מ"ל מורכבים מתחת לספסל זרימה למינרי, כפי שמצוין באיור 2B. מערך זה מספק אחיזה בטוחה בפקק ללא צורך בפעולות נוספות ומציע שטח מספיק לרקמות בגדלים שונים. בדרך כלל, חתיכות רקמה של 5 מ"מ x 10 מ"מ להשתלה וחתיכות בקוטר 2 מ"מ להערכת ספירת זקיקים חיונית לאחר הפשרה מהירה הן זגוגיות. שני הגדלים מתאימים באופן מושלם לרשתות המתכת.

שיווי משקל עם תמיסות ויטריפיקציה (VS1, VS2 ו-VS3) מתבצע בצלחת בת 6 בארות על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר מתחת לספסל זרימה למינרי, כפי שמוצג באיור 3. מסגרות הזמן בתכנית מבטיחות ספיגה יעילה של אתילן גליקול cryoprotectant. מומלץ להשתמש בצלחת בעלת 6 בארות מעל כלי דם בודדים מכיוון שהיא מאפשרת תנועה מהירה של הרקמה בין תמיסות ומסייעת במניעת ערבובים.

עבור ויטריפיקציה אנכית מהירה בחנקן נוזלי, רקמת קליפת המוח השחלתית נחתכת לחתיכות מתאימות (איור 4A). דגימות מקליפת המוח של השחלות ממוקמות על מכשירי העמסה (איור 4B,C) ושקועות אנכית בחנקן נוזלי (איור 4D) כדי להשיג מצב זכוכית של צבירה באמצעות ויטריפיקציה. רשתות המתכת שנבחרו מאפשרות טיפול אנכי ברקמה, כפי שניתן לראות באיור 4D. בנוסף, רשתות המתכת מוליכות תרמית מאוד, ומבטיחות קצבי קירור מהירים מ -22 ° C ל -196 ° C, המהווה שלב חשוב ביותר בתהליך הוויטריפיקציה.

להתחממות מהירה, RWS מוכן בכוס סטרילית בטמפרטורה של 37°C. ES, RS1 ו-RS2 מוכנים בצלחת של 6 בארות על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר, כפי שמוצג באיור 5. הנפח הגבוה של RWS שחומם מראש מונע מהתמיסה להתקרר יתר על המידה עם הוספת הרקמה המזוגגת ומבטיח סביבה חמה באופן עקבי לרקמה לאורך כל תהליך ההתחממות המהירה.

כדי להעריך ולהבטיח תקני איכות גבוהים, אגרופי ביופסיה בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ מוכתמים בקלצין לפני ויטריפיקציה ולאחר התחממות מהירה כדי לקבוע את כדאיות הזקיקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי^34,35 (איור 6). זקיקים בני קיימא פולטים פלואורסצנטיות ירוקה ב-495 ננומטר לאחר ספיגה תוך-תאית של קלצאין. לחלופין, ניתן להעריך את כדאיות הזקיקים (טבלה 3) באמצעות צבעים אדומים ניטרליים³⁶.

על ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרוטוקול זה, רקמת השחלה הופכת למצב זכוכית של צבירה, המאפשר שיעורי הישרדות גבוהים לאחר התחממות מהירה, כפי שאושר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

איור 1: עיצוב המחקר. דגימות קליפת המוח של השחלות מ-50 מטופלות נבדקו לפני (טרי) ואחרי ויטריפיקציה והתחממות מהירה עבור מספר הזקיקים הקיימים. עבור כל קבוצה, שתי פיסות רקמה בקוטר 2 מ"מ גודלו בתרבית במשך 24 שעות לפני הערכת ספירת הזקיקים. הרקמה עוכלה עם collagenase ומוכתמת בקלצין כדי להעריך את הכדאיות. מספר הזקיקים בני קיימא נקבע באמצעות מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הכנת מכשירי טעינה. רשתות מתכת נחתכו לגודל של 8 מ"מ x 25 מ"מ (A). רשתות המתכת המותאמות אישית עוקרו על ידי אוטוקלאבינג (B). רשתות המתכת המעוקרות הוכנסו למכסים של בקבוקונים בנפח 1.8 מ"ל, מוכנים לשימוש (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הכנת תמיסות ויטריפיקציה. פתרונות ויטריפיקציה (VS) הוכנו והועברו לצלחת 6 בארות. הבארות מציגות את הנפח של כל תמיסה ואת זמני הדגירה האינדיבידואליים המשמשים בפרוטוקול הוויטריפיקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: עיבוד וויטריפיקציה של קליפת המוח השחלתית. רקמת קליפת המוח השחלתית עובדה לשימור בהקפאה על ידי הסרת המדולה וחיתוך הרקמה לחתיכות בגודל 5 מ"מ x 10 מ"מ (A). לאחר הדגירה בתמיסות הוויטריפיקציה המוצגות באיור 3, הרקמה הועמסה על מכשיר טעינת הוויטריפיקציה (B,C). עבור ויטריפיקציה אנכית מהירה של דגימות קליפת השחלות, הכובעים עם הרקמה הטעונה הוכנסו במהירות לחנקן נוזלי מעוקר (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הכנת פתרונות התחממות מהירה. תמיסת התחממות מהירה (RWS), תמיסת שיווי משקל (ES) ותמיסות שטיפה (RS) 1 ו-2 הוכנו והועברו לצלחת בעלת 6 בארות. הכלים והבארות מראים את הנפח של כל פתרון ואת זמני הדגירה המתאימים. שים לב כי RWS נשמר ב 37.2 ° C על צלחת חימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ספירת כדאיות. כדי להעריך את מספר הזקיקים קיימא, חתיכות רקמה בקוטר 2 מ"מ עוכלו עם collagenase ומוכתמות עם calcein. התמונות המייצגות מראות (A) צביעת קלצאין של 3 זקיקים שנמצאו לפני ויטריפיקציה. (B) זקיק בר קיימא שהתאושש לאחר ויטריפיקציה והתחממות מהירה. (C) זקיק בר קיימא שהוחזר לפני הקפאה איטית. (D) זקיקים ברי קיימא שנמצאו לאחר הקפאה והפשרה איטיות. כדאיות זקיקים מסומנת על ידי calcein, צבע פלואורסצנטי ירוק הפולט פלואורסצנטיות ירוקה כאשר מומר אנזימטית על ידי תאים קיימא ב 495 ננומטר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

VS 1 (15 מ"ל)	אתילן גליקול	10%	1.5 מ"ל
	אס.אס.אס	10%	1.5 מ"ל
	G-MOPS+		12 מ"ל
לעומת 2 (15 מ"ל)	אתילן גליקול	20%	3 מ"ל
	אס.אס.אס	10%	1.5 מ"ל
	G-MOPS+		10.5 מ"ל
VS 3 (15 מ"ל)	אתילן גליקול	35%	5.25 מ"ל
	אס.אס.אס	10%	1.5 מ"ל
	סוכרוז	0.5 מול/ל'	2.57 גרם
	PVP	5 % (ללא רב)	0.75 גרם
	G-MOPS+		מודעה 15 מ"ל

טבלה 1: הרכב פתרונות ויטריפיקציה (VS).

RWS (30 מ"ל)	סוכרוז	0.8 מול/ליטר
			8.22 גרם
	אס.אס.אס	10%	3 מ"ל
	G-MOPS+		מודעה 30 מ"ל
ES (15 מ"ל)	סוכרוז	0.4 מול/ל	2.05 גרם
	אס.אס.אס	10%	1.5 מ"ל
	G-MOPS+		מודעה 15 מ"ל
RS 1&2 (15 מ"ל)	אס.אס.אס	10%	1.5 מ"ל
	G-MOPS+		מודעה 15 מ"ל

טבלה 2: הרכב תמיסת התחממות מהירה (RWS), תמיסת שיווי משקל (ES) ותמיסות שטיפה (RS). טבלה זו מספקת את הרכיבים והריכוזים עבור תמיסת ההתחממות המהירה (RWS), תמיסת שיווי משקל (ES) ותמיסות שטיפה (RS) המשמשות בעיבוד שלאחר ויטריפיקציה.

פרמטר	טריים	מרווח זמן	התחממות מהירה לאחר ויטריפיקציה	מרווח זמן	n	*ערך P
		SD		SD
ספירת כדאיות זקיקים [n]	77.98	0-386	62.99	0.5-349	50	0.130
		77.95		80.02
*מבחן Wilcoxon

טבלה 3: תוצאות מייצגות של כדאיות זקיקים. טבלה זו מציגה את התוצאות של הערכות כדאיות זקיקים לפני שימור בהקפאה ולאחר התחממות מהירה. שתי פיסות רקמה בקוטר 2 מ"מ לכל מטופל שימשו לספירת מספר הזקיקים הקיימים לפני ואחרי ויטריפיקציה/התחממות מהירה. דגימות רקמה מזווגים של 50 חולים נותחו באמצעות מבחן Wilcoxon.

Discussion

כאן מוצג פרוטוקול לוויטריפיקציה בתפוקה גבוהה של רקמת קליפת השחלות האנושית, המתאים לשגרה קלינית. בדומה לוויטריפיקציה של ביציות או עוברים, יישום מוצלח של ההליך דורש היצמדות מפורטת לפרוטוקול הנוגע לטמפרטורה של תמיסות הוויטריפיקציה וההתחממות, כמו גם תקופת שיווי המשקל. עמידה בהנחיות הרקמה³⁷ של האיחוד האירופי בנוגע לאיכות האוויר וסטריליות חיונית אף היא.

תהליך הוויטריפיקציה גורם למצב לא גבישי, אמורפי או זכוכיתי. בסך הכל, ויטריפיקציה היא תהליך רב-תכליתי בעל השלכות משמעותיות בתחומים מדעיים וטכנולוגיים שונים. היתרון העיקרי של ויטריפיקציה הוא יכולתו להמיר רקמה למצב זכוכיתי, ובכך למנוע היווצרות גבישי קרח 38,39,40, אשר יכולים להשפיע לרעה על שלמות הרקמה ומרכיביה.

תוספת של חומרים cryoprotective (CPAs) עם polyvinylpyrrolidone (PVP) מאפשר ירידה בריכוז CPA מבלי להתפשר על איכות פתרונות ויטריפיקציה^41,42. יתר על כן, השימוש ברשתות מתכת מספק מוליכות תרמית גבוהה בהשוואה למערכות נשא מבוססות פלסטיק. מבנה הרשת גם מאפשר הידבקות פני השטח, ומבטיח שימור קריוגני בטוח ובטוח של דגימות רקמה ואגרופי קליפת מוח קטנים למדדי איכות. אם משתמשים בכלי קריו-כלים מיצרנים אחרים, חשוב לבדוק מראש את גודל רשתות המתכת כדי להבטיח יציבות ואחיזה נכונה בתוך מכסה כלי ההקפאה, כמו גם התאמה טובה לכלי.

צעדים קריטיים כדי להבטיח ויטריפיקציה מוצלחת כוללים ויטריפיקציה מהירה על ידי טבילת הרקמה בחנקן נוזלי מעוקר וביצוע התחממות מהירה ללא דיחוי כדי למנוע תוצאות שליליות. במונחים של עלות-תועלת, ויטריפיקציה של רקמות היא פחות תובענית בהשוואה להליך ההקפאה האיטי, מה שעשוי להשפיע על תכנון פריסת כוח האדם. בנוסף, ויטריפיקציה מבטלת את הצורך לרכוש ולטפל בציוד הנדרש להקפאה איטית.

מדדים ביולוגיים ומטא-אנליזות הוכיחו את יכולת ההשוואה או אפילו היתרונות של ויטריפיקציה בהשוואה להקפאה איטית⁴³. עם זאת, ניתן לייחס הבדלים בתוצאות לאחר ויטריפיקציה לחוסר סטנדרטיזציה הן במכשיר הוויטריפיקציה והן בפרוטוקול, כולל הפתרונות בהם נעשה שימוש, המשתנים בין מחקרים. מחקר עתידי צריך לחקור את הפוטנציאל של תרבית זקיקים מרקמה מזוגגת/מחוממת במהירות כדי לעקוב אחר צמיחה במבחנה, כפי שהודגם בהצלחה ברקמת שחלה עכברית על ידי מספר קבוצות 44,45,46,47,48,49,50.

לסיכום, ויטריפיקציה של רקמת השחלה היא חלופה משמעותית לפרוטוקול ההקפאה האיטית הנפוץ, הנתמך על ידי חמש לידות מוצלחות שדווחו על ידי סוזוקי⁵¹ (יפן), סילבר⁵² (ארה"ב) וסנגר⁵³ (גרמניה). בניגוד לאמצעי ויטריפיקציה זמינים מסחרית וערכות לתאים, יש מעט מערכות מאושרות FDA / CE עבור רקמת השחלה, אשר עשוי להגביל את היישום שלהם במסגרות קליניות. לכן^{, מומלץ לפתח} ערכות ומדיה מאושרות FDA/CE לוויטריפיקציה והתחממות מהירה של רקמת השחלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL vials	VWR International GmbH	479-6837
10 mL serological pipette	Sarstedt	86.1254.001
4 well plate	Gynemed	GYOOPW-FW04
50 mL Tube	Sarstedt	62.559.001
6 well plates	Sarstedt	83.3920
Bacillol AF	Hartmann	973385
Calcein AM	Merck	17783
Collagenase type 1A	Merck	C2674
Cryosure DMSO	WAK Chemie	WAK-DMSO-10
Custodiol	Dr. Franz Köhler Chemie	00867288
DPBS CTS	Gibco Life technologies	A12856-01
ErgoOne pipette aid	Starlab	S7166-0010
Ethylene glycol	Sigma Aldrich	102466
Euronda sterilization container	euronda	282021
G-MOPS+	Vitrolife	10130
Metal meshes	Sigma Aldrich	S0770
Metzenbaum scissors	world precision instruments	501262102
N-Bath System	Nterilizer	N-Bath 3.0
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	SAGE	ART-4005
Serum substitute supplement (SSS)	Fujifilm Irvine scientific	99193
Sterile cup	Sarstedt	75.562.105
Sterile forceps	Carl Roth	KL05.1
Sucrose	Merck	S0389