Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا لإزالة الخلايا العصبية القطنية الودية بعد العقدة جراحيا من الفأر. سيسهل هذا الإجراء العديد من الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في دور التعصيب الودي في أهداف الأنسجة البعيدة.

Abstract

إصابات الأعصاب الطرفية شائعة ، ويتم تحقيق الشفاء الوظيفي الكامل بعد الإصابة في 10 ٪ فقط من المرضى. يلعب الجهاز العصبي السمبثاوي العديد من الأدوار المهمة في الحفاظ على الاتزان الداخلي الجسدي، ولكن نادرا ما تمت دراسته في سياق إصابة العصب الطرفي. مدى الوظائف العصبية الودية بعد العقدة في الأهداف البعيدة في المحيط غير واضح حاليا. لاستكشاف دور التعصيب الودي للأهداف المحيطية بشكل أفضل ، يوفر نموذج "الضربة القاضية" الجراحي نهجا بديلا. على الرغم من أنه يمكن تحقيق ذلك كيميائيا ، إلا أن التدمير الكيميائي للخلايا العصبية الودية بعد العقد يمكن أن يكون غير محدد ويعتمد على الجرعة. يسمح استخدام استئصال الودي القطني الجراحي في الفئران ، الذي كان يعتقد أنه "غير عملي عمليا" في الصغيرة ، باستهداف محدد للخلايا العصبية الودية بعد العقدة التي تعصب الأطراف الخلفية. تصف هذه المخطوطة كيفية إزالة العقد القطنية الودية L2-L5 جراحيا من الفأر كجراحة للبقاء على قيد الحياة ، مما يقلل بشكل موثوق من استجابة عرق المخلب الخلفي وعدد المحاور العصبية الودية في العصب الوركي.

Introduction

يمكن أن تؤدي إصابات الأعصاب المحيطية (PNIs) إلى عجز حركي وحسي وودي في أهداف الأنسجة البعيدة التي نادرا ما تتعافى وظيفيا بالكامل1. غالبا ما ركزت أبحاث PNI على التجديد الحركي والحسي. ومع ذلك ، فإن ما يقرب من ربع العصب الوركي للفئران يتكون من محاور عصبية متعاطفة غير ميالينية2. ومع ذلك ، فإن دور التعصيب الودي في الأنسجة المحيطية غير مفهوم تماما3. يلعب الجهاز العصبي السمبثاوي دورا رئيسيا في الحفاظ على التوازن الجسدي ، والمشاركة في التنظيم المناعي ، والتنظيم الحراري ، ونغمة الأوعية الدموية ، والتكوين الحيوي للميتوكوندريا ، والمزيد4،5،6،7،8،9،10،11. عندما يتم فقدان التعصيب الودي عند التقاطع العصبي العضلي ، يلاحظ ضعف العضلات المستمر وعدم الاستقرار المشبكي على الرغم من الحفاظ على التعصيب الحركي12. وقد تبين أن هذا التنظيم الودي للانتقال المشبكي عند التقاطع العصبي العضلي ينخفض مع تقدم العمر 13,14 ، مما يساهم في ساركوبينيا ، والذي يعرف بأنه انخفاض يعتمد على العمر في كتلة العضلات والقوةوالقوة 15. من الضروري فهم أفضل لدور التعصيب الودي للأنسجة المحيطية لتطوير العلاجات التي من شأنها تحسين النتائج الوظيفية للمرضى الذين يعانون من PNIs وأشكال أخرى من الخلل الوظيفي الودي.

استئصال الودي هو أداة تجريبية قوية تسمح بالتحقيق في دور التعصيب الودي في الأنسجة المستهدفة البعيدة. على وجه التحديد ، إزالة العقد الودية على مستوى L2-L5 يزيل غالبية التعصيب الودي للأطراف السفلية ، وهو أمر مفيد بشكل خاص للمحققين المهتمين بالعصب الوركي.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إزالة الخلايا العصبية الودية بعد العقدة على مستوى L2-L5 من الفأر كجراحة للبقاء على قيد الحياة. يتطلب هذا الإجراء مهارات جراحية مجهرية للقوارض والإلمام بتشريح الفأر ، وعندما يتم إجراؤه بفعالية ، لا يسبب أي اختلافات ظاهرية مرئية. تم استخدام استئصال الودي القطني الجراحي في أبحاث القوارض ، أكثر من الفئرانفي الفئران 16،17،18،19،20،21. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول مفصل يصف البروتوكول. ركزت الدراسات السابقة التي تستخدم استئصال الودي القطني بشكل أساسي على دور التعصيب الودي في استجابة الألم ، والتي يتم تخفيفها بشكل عام عن طريق استئصال الودي في نماذج إصابة الأعصاب المختلفة. استخدمت دراسات أقل هذه التقنية في الفئران22 ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى صغر حجم المعالم التشريحية ، حيث كان يعتقد أن استخدام استئصال الودي الجراحي "غير عملي تقريبا" في الصغيرة23,24. كما تم استخدام استئصال الودي الموضعي في شكل استئصال الودي الدقيق في نماذج القوارض ، وأيضا في الغالب في سياق سلوكيات الألم25،26،27. يستخدم استئصال الودي الدقيق ، على عكس استئصال الودي القطني الكلي ، نهجا ظهريا يتم من خلاله فصل جزء من الراموس الرمادي إلى عصب نخاعي معين وإزالته ، مما يسمح باستئصال الودي المستهدف للغاية الذي سيتجنب الآثار الجانبية المنتشرة على نطاق أوسع.

نظرا لأن نماذج الفئران ضرورية للعديد من الدراسات التي تتطلب التلاعب الجيني ، فإن هذا الإجراء سيكون له تطبيقات متعددة الاستخدامات تتجاوز نطاق إصابات الأعصاب الطرفية أيضا. باستخدام نهج عبر البطن ، يمكن تصور العقد القطنية المتعاطفة بشكل موثوق واستئصالها من الماوس دون أي آثار ضارة واضحة. على الرغم من توفر بروتوكولات للتدمير الكيميائي للخلايا العصبية الودية بعد العقدة ، مثل استخدام 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) 23،24 ، فإن هذا الإجراء الجراحي يسمح باستهداف محدد تشريحيا للعقد القطنية المتعاطفة بعد العقدة. يتجنب استخدام استئصال الودي الجراحي أيضا المخاوف غير المحددة والمعتمدة على الجرعة المتعلقة بالطرق الدوائية28,29.

تم وصف استخدام استئصال الودي الكيميائي عن طريق إدارة 6-OHDA في عام 1967 كطريقة بسيطة لتحقيق تدمير انتقائي للنهايات العصبية الأدرينالية لأن عمليات استئصال الودي الجراحي في الصغيرة لم تكن مفضلة23,24. 6-OHDA هو سم عصبي كاتيكولاميني يتكون داخليا في مرضى باركنسون ، وتستمد سميته من قدرته على تكوين الجذور الحرة وتثبيط سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا30,31. من خلال آليات نقل امتصاص النورإبينفرين -1 ، فإن 6-OHDA قادر على التراكم داخل الخلايا العصبية النورادرينالية ، مثل الخلايا العصبية الودية بعدالعقدة 28. في النهاية ، يتم تدمير الخلايا العصبية بواسطة 6-OHDA ؛ ومع ذلك ، فإن المحطات الطرفية في الجهاز العصبي المحيطي تتجدد ، مع استعادة النشاط الوظيفي حتى عندما لا تزال مستويات الأمين منخفضة. توجد أيضا عتبات جرعات مختلفة للأعضاء المختلفة استجابة ل 6-OHDA ، وقد ثبت أن الجرعات العالية من 6-OHDA تظهر تأثيرات غير محددة أكثر ، مما يوسع عواقبها السمية العصبية إلى الخلايا العصبية غير المحتوية على الكاتيكولامين وحتى الخلايا غير العصبية. بصرف النظر عن الخلايا العصبية النورادرينالية ، تتأثر الخلايا العصبية الدوبامينية ب 6-OHDA أيضا29 ، مما يجعل استئصال الودي الكيميائي في النهاية أقل تحديدا للخلايا العصبية الودية بعد العقد من استئصال الودي الجراحي.

لذلك ، يتيح استئصال الودي القطني الجراحي الاستئصال المستهدف للتعصيب الودي للأطراف السفلية ، والذي يمكن دمجه مع مجموعة متنوعة من التقنيات التجريبية والتلاعب الجيني في الفأر لدراسة كيفية مساهمة الجهاز العصبي الودي في حالات الإصابة والمرض المختلفة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة إيموري (بموجب رقم بروتوكول IACUC PROTO201700371). تم استخدام أربع إناث بالغة من الفئران البرية C57BL / 6J ، تتراوح أعمارها بين 14 أسبوعا وتزن ما بين 16-21 جم ، في هذه الدراسة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة هنا مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير قبل الجراحة

  1. الأوتوكلاف الأدوات الجراحية: 1 زوج من مقص حاد ، 2 ملاقط ذات رؤوس دقيقة ، 1 سائق إبرة.
  2. سخني وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية وضعيها تحت سطح الطاولة الجراحية.
  3. رش المنطقة الجراحية ، بما في ذلك غرفة تحريض التخدير ، بمطهر وامسحها جيدا باستخدام مناشف ورقية.
  4. تأكد من ارتداء الملابس المناسبة وغسل اليدين قبل التعامل مع الماوس.
  5. قم بإطعام الفأر بالميلوكسيكام بمعدل 5 مجم / كجم من وزن الجسم ، واترك متسعا من الوقت للفأر لابتلاع الدواء تماما لتجنب الشفط أثناء الحث.
  6. حث الفأر تحت التخدير مع 3٪ إيزوفلوران في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  7. بمجرد تخدير الفأر (لا يوجد رد فعل على قرصة إصبع القدم) ، ضع الفأر على سطح الطاولة الجراحية ، مستلقا ، مع وضع أنفه في مخروط أنف مناسب.
  8. بمجرد تركيب الماوس بشكل صحيح في مخروط الأنف ، اضبط الأيزوفلوران على 2٪ للحفاظ على التخدير.
  9. ضع جل العين على عيني الفأر للوقاية من التهاب القرنية والملتحمة الجاف (جفاف العين).
  10. تأكد من تثبيت الماوس بشكل صحيح بشريط جراحي على سطح الطاولة الجراحية.
  11. راقب باستمرار لسهولة التنفس ومعدل التنفس الكافي.
  12. حلق الفراء من بطن الفأر من مستوى الأعضاء التناسلية إلى أسفل الأضلاع.
  13. بمجرد إزالة الفراء ، امسح أولا المنطقة الجراحية بحركة دائرية ، من المركزية إلى الطرفية ، باستخدام 70٪ من الإيثانول. ثم امسح المنطقة الجراحية باستخدام البيتادين بنفس الحركة الدائرية. كرر كل من خطوات الإيثانول والبيتادين ما مجموعه 3 مرات.
  14. قم بثني الفأر بستارة جراحية معقمة مع فتحة بحجم مناسب مقطوعة من المنتصف لتصور المجال الجراحي. يمكن عمل الشكل المعيني عن طريق طي الستارة إلى النصف وقطع مثلث متساوي الساقين بارتفاع ~ 10 مم وقاعدة ~ 15 مم.

2. الشقوق

  1. باستخدام مقص حاد وملاقط ذات رؤوس دقيقة ، قم بإنشاء شق خط الوسط من ~ 1 مم فوق مستوى ارتفاق العانة إلى ~ 2 مم أسفل الأضلاع.
  2. تحديد لفافة خط الوسط (linea alba) بين عضلات البطن المستقيمة الثنائية. باستخدام الملقط ، ارفع عضلات البطن بعيدا عن الأعضاء الكامنة واقطعها على طول خط ألبا لدخول تجويف البطن.
    ملاحظة: يمكن التعرف على خط ألبا عن طريق سحب عضلات البطن المستقيمة الثنائية برفق بشكل جانبي للكشف عن خط لفافة أرق يقع طوليا على طول خط الوسط32. يسمح إجراء الشق عبر خط ألبا بإغلاق العضلات بسهولة أكبر.
  3. سحب عضلات البطن والجلد مع 5-0 الغرز بشكل جانبي لتصور الخطوات التالية بشكل صحيح.

3. تحديد العقد القطنية المتعاطفة L2-L5

  1. تقع العقد القطنية الودية خلف الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي. لتصور الشريان الأورطي ، قم بإزالة الأمعاء جزئيا من تجويف البطن.
    ملاحظة: تنتقل العقد الودية على مستوى L2-L5 من مستوى تشعب الأبهر إلى الأوعية الحرقفية إلى مستوى الشريان الكلوي الأيسر21,33.
    1. ضع مربعا قطنيا معقما مشبعا بمحلول ملحي معقم على الستارة ، مستلقيا بشكل متفوق وعلى يسار الشق. بعناية ، مع 2 قضيب معقم برأس قطني ، ادفع القولون والأمعاء الدقيقة جزئيا إلى مربع القطن المنقوع بالمحلول الملحي.
      ملاحظة: تأكد من أن الأعور والزائدة الدودية خارج تجويف البطن وأنه يمكن تصور القولون النازل.
    2. قم بتغطية الأمعاء المكشوفة بمربع قطن آخر مشبع بالمحلول الملحي.
    3. مراقبة التمعج بشكل دوري طوال الجراحة ، والتي يمكن تحديدها عن طريق الحركة الإيقاعية للأمعاء.
  2. تحديد القولون النازل ، وهو جزء من الأمعاء يتحرك نحو المستقيم والشرج وقد يحتوي على مادة برازية مرئية ، وحرف هذا الهيكل إلى اليسار بملاقط مغلقة للكشف عن الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي. يرتبط هذان الوعاءان بالنسيج الضام ويجب أن يتحركا كوحدة واحدة.
    1. باستخدام زوج من الملقط ، ارفع الأوعية البطنية بواسطة النسيج الضام المحيط بها. أثناء رفع هذا ، ضع بعناية خياطة نايلون 5-0 من خلال النسيج الضام.
      تنبيه: لا تثقب الأوعية البطنية بالإبرة: سيؤدي ذلك إلى تعويض سريع للفأر والموت المحتمل.
    2. بمجرد إدخال الخيط من خلال النسيج الضام ، قم بتحويل الأوعية البطنية إلى اليسار. سيعطي هذا نافذة مثلثة ، مما يسمح بالتصور المباشر لعضلات القطنية الثنائية.
      ملاحظة: نظرا للروابط الحميمة التي تربط العقد بالأوعية البطنية ، فإن العقد الودية ، على الرغم من أنها تقع عادة في خط الوسط ، ستنحرف قليلا إلى اليسار (يمين الفأر) مع الأوعية. بمجرد انحراف الأوعية البطنية ، يجب على المرء أن يتخيل مثلثا ، حيث يتكون الجانبان على اليسار من الأوعية البطنية المنحرفة والجانب الأيمن المحدد بواسطة خط وسط الفأر (بين العضلات القطنية الثنائية). تقع العقد المتعاطفة في منتصف هذا المثلث (الشكل 1 أ). تنتقل عموديا جنبا إلى جنب وتبدو شفافة. قد تتداخل مع وعاء صغير يغوص في خط وسط الفأر ويستلقي بشكل مسطح على عضلته القطنية اليمنى. استخدم الملقط لتشريح أي لفافة علوية بصراحة للكشف عن العقد (الشكل 1 ب).
  3. تحديد الشريان الكلوي الأيسر والشريان الأيسر من الخصية أو المبيض.
    ملاحظة: هذه أوعية كبيرة ستشكل رباعي الزوايا ، تتكون جوانبها من الشريان الكلوي الأيسر بشكل أعلى ، وخط الوسط للحيوان والشريان الأورطي البطني / الوريد الأجوف السفلي بشكل جانبي ، وشريان الخصية أو المبيض الأيسر بشكل سفلي. العقد المستوية L2 كبيرة وتقع داخل هذا المربع (الشكل 1 أ). تشريح حاد بعناية لإدخال هذا رباعي الزوايا مع ملاقط وتحديد العقد L2 الثنائية (الشكل 1B).
  4. بمجرد تحديد الأجزاء السفلية والعلوية من العقد ، أمسك الجانب السفلي من العقد الثنائية المرئية بزوج من الملقط واسحب لأعلى. يمكن زيادة تصور العقد ذات الموقع السفلي ، مثل L4 و L5 ، عن طريق دفع أي أعضاء تعيق الرؤية برفق باستخدام الزوج الثاني من الملقط.
    ملاحظة: سيضمن تصور وعاء ثقب خط الوسط المذكور في الخطوة 3.2.2 استئصال الودي القطني بشكل أكثر اكتمالا. من ناحية أخرى ، قم بإمساك زوج ثان من الملقط ، اسحب اللفافة والوصلات العصبية التي تمسك العقد في البطن بعيدا بينما تسحب العقد نفسها في نفس الوقت مع أول زوج من الملقط. يجب أن يتمسك زوج واحد فقط من الملقط بالعقد ، بينما يزيل الآخر اللفافة والوصلات العصبية. مرة واحدة على مستوى الخصية اليسرى أو شريان المبيض ، قد يكون من المفيد تحديد L2 إذا كانت العقد ذات السلسلة السفلية لا تزال سليمة ، حيث ستتحرك العقد L2 عند سحبها بواسطة السلسلة السفلية. يمكن كسر العقد L3-5 في شريان الخصية أو المبيض قبل استخراج العقد L2 من رباعي الزوايا بالملاقط. العقد الوحيدة الموجودة داخل رباعي الزوايا هي العقد L2.
  5. يجب أن يكون لهذا الإجراء الحد الأدنى من فقدان الدم. في حالة حدوث نزيف ، تأكد من الإرقاء الكافي قبل الإغلاق.

4. إغلاق الجلد

  1. بعد تحقيق الإرقاء الكافي ، قم بإزالة الخيط الذي يثبت الأوعية البطنية في مكانها.
  2. باستخدام 2 قضيب معقم ذو رأس قطني ، استبدل الأمعاء المحولة بعناية في تجويف البطن.
  3. مع خياطة قابلة للامتصاص 5-0 ، قم بإجراء غرزة جري لتقريب عضلات البطن.
  4. مع خياطة 5-0 نايلون ، استخدم غرز بسيطة متقطعة لإغلاق الجلد.
  5. ضع طبقة سخية من مرهم المضادات الحيوية ، مثل نيوسبورين ، على موقع الشق.
  6. ضع الماوس في قفص نظيف على وسادة التدفئة.
  7. راقب الماوس كل 15 دقيقة حتى يستيقظ ويتنقل. يستغرق هذا عادة أقل من 30 دقيقة.

5. فحص عرق بيلوكاربين

ملاحظة: لتقييم استنفاد النشاط الوظيفي الودي بعد استئصال الودي القطني ، تم استخدام مقايسة عرق بيلوكاربين بعد 7 أيام من استئصال الودي القطني.

  1. تحضير محلول هيدروكلوريد بيلوكاربين 1٪ في 0.9٪ كلوريد الصوديوم جنبا إلى جنب مع خليط من نشا البطاطس 10٪ في زيت الخروع.
  2. باستخدام فرشاة الرسم ، قم بتغطية السطح الأخمصي للقدم بالبيتادين. اترك هذه الطبقة تجف تماما.
  3. بمجرد أن تجف طبقة البيتادين ، استخدم فرشاة رسم منفصلة لتطبيق طبقة من النشا بنسبة 10٪ في زيت الخروع.
  4. يتم تطبيق 0.25 ميكرولتر/ غ من وزن الجسم بنسبة 1٪ بيلوكاربين تحت الجلد باستخدام حقنة في الجلد المترهل على الرقبة. ابدأ المؤقت مباشرة بعد إعطاء بيلوكاربين.
  5. في 8 دقائق بعد الحقن ، التقط صورا لسطح القدم الأخمصي.
  6. باستخدام فيجي ، احسب عدد البقع الداكنة الموجودة على جميع وسادات القدم الستة (6) (الشكل 2 أ).

6. الكيمياء الهيستولوجية المناعية

ملاحظة: لتقييم تنكس المحاور الودية في الأعصاب الطرفية بعد استئصال الودي القطني ، تم حصاد الأعصاب الوركية الثنائية في اليوم 21 بعد الجراحة.

  1. تخدير الفئران (باتباع الخطوة 1 من البروتوكول) ، وحصاد الأعصاب الوركية الثنائية ، ثم القتل الرحيم للحيوان على الفور (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  2. ضع الأعصاب الوركية مباشرة في 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.01 M (PBS) لمدة 20 دقيقة ، ثم انقلها إلى 20٪ سكروز في 0.1 M PBS للحماية من التبريد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. قسم الأعصاب الوركية طوليا باستخدام cryostat عند 20 ميكرومتر ، وضع الأقسام على شرائح مشحونة.
  4. سد المقاطع العصبية بنسبة 10٪ مصل الماعز الطبيعي (NGS) في محلول ملحي مخزن بنسبة 1٪ Tween 20 (TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع واستبدله بالأجسام المضادة الأولية أرنب هيدروكسيلاز مضاد للتيروزين ودجاج مضاد للخيوط العصبية الثقيلة المخففة في المخزن المؤقت المانع (10٪ NGS في TBST) في 1: 750 و 1: 1000 ، على التوالي. اسمح للأجسام المضادة الأولية بالاحتضان طوال الليل في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الشريحة باستخدام TBST 3 مرات ، 10 دقائق لكل غسلة ، قبل تطبيق الأجسام المضادة الثانوية الماعز المضادة للأرانب 647 والماعز المضادة للدجاج 488 ، وكلاهما مخفف في الساعة 1: 200 في المخزن المؤقت للحظر. اسمح للأجسام المضادة الثانوية بالاحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. اغسل الشريحة باستخدام TBST 4 مرات ، 10 دقائق لكل غسلة ، واترك الشريحة تجف في منطقة محمية من الضوء قبل التركيب.
  8. صورة المقاطع العصبية على بعد 40 ميكرومتر على الأقل على مجهر الفلورسنت على هدف 10x.
  9. في فيجي ، قم بتصويب الأقسام العصبية وارسم ثلاثة خطوط عمودية موضوعة بشكل عشوائي تمتد على عرض القسم. احسب عدد المحاور العصبية التي تعبر كل خط رأسي واقسمه على عرض المقطع عند الخط الرأسي. كرر لكل خط من الخطوط الرأسية الثلاثة لكل قسم. متوسط القيم الثلاث التي تم الحصول عليها لكل قسم ، وكذلك متوسط قيم الأقسام الثلاثة لكل عصب.

النتائج

يصف هذا البروتوكول الاستئصال الجراحي للخلايا العصبية القطنية الودية بعد العقد من الفأر. تلقى فئران استئصال الودي القطني ، وعمل فئران كعناصر تحكم. لتحقيق استئصال جراحي ناجح للودي القطني ، يجب تحقيق تصور كاف على الأقل للعقد القطنية الودية الثنائية L2 و L3 ، كما هو موضح في الشكل 1

Discussion

العقد القطنية الودية هي هياكل صغيرة جدا تقع خلف العديد من أعضاء البطن الحرجة والأوعية الكبيرة. لذلك ، يتطلب هذا الإجراء دقة ودقة كبيرة. يكمن جزء كبير من الصعوبة في تحديد العقد المتعاطفة أثناء الجراحة. يقترح أن يكون المتعلم قادرا أولا على التعرف على العقد في جثة فأر قبل محاولة هذا الإجراء ف?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم K01NS124912 وجزئيا من خلال منحة تنموية من مركز إيموري المتخصص للتميز البحثي في الاختلافات بين الجنسين الممول من المعاهد الوطنية للصحة U54AG062334 وبرنامج تدريب العلماء الطبيين في كلية الطب بجامعة إيموري. شكرا لديفيد كيم ، ما بعد البكالوريا ، لتقسيم الأعصاب الوركية وإلى HaoMin SiMa ، أخصائي الأبحاث ، لطباعة 3D حامل هاتف لمجهرنا الاستريو الذي سمح بتصوير الفيديو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-0 absorable sutureCP Medical421A
5-0 nylon sutureMed-Vet InternationalMV-661
70% ethanolSigma-AldrichE7023-4L
Anesthesia Induction ChamberKent Scientific VetFloVetFlo-0530XS
Anesthesia VaporizerKent Scientific VetFlo13-005-202
BetadineHealthyPetsBET16OZ
C57BL/6J miceJackson Laboratory#000664
Chicken anti-neurofilament-heavyAbcamab72996
CryostatLeicaCM1850
Data Analysis SoftwarePrism
Fine-tipped tweezersWorld Precision Instruments500233
Fluorescent microscopeNikonTi-E
Goat anti-chicken 488InvitrogenA32931
Goat anti-rabbit 647InvitrogenA21245
Heating padBraintree Scientific39DP
Image Analysis SoftwareFiji
Imaging SoftwareNikonNIS-Elements
IsofluraneMed-Vet InternationalRXISO-250
MeloxicamMed-Vet InternationalRXMELOXIDYL32
Needle driverRoboz Surgical StoreRS-7894
Normal Goat SerumAbcamab7481
Ophthalmic ointmentRefreshRefresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant miceJackson Laboratory #016223, #007914
Pilocarpine hydrochlorideSigma-AldrichP6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylaseAbcamab112
Small straight scissors Fine Science Tools14084-09
Sterile cotton swabs 2x2Dynarex3252
Sterile cotton tipped applicatorsDynarex4301
Sterile drapeMed-Vet InternationalDR4042
Sterile saline solutionMed-Vet International1070988-BX
ThCre:mTmG mutant miceMutant Mouse Resource and Research Centersstrain #017262-UCDJackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant miceEuropean Mouse Mutant Archivestrain #00254Jackson Laboratory, strain #007914

References

  1. Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
  2. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  3. Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
  4. Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
  5. Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
  6. Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
  7. Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
  8. Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
  9. Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935 (2018).
  10. Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
  11. Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
  12. Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
  13. Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305 (2021).
  14. Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
  15. Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
  16. Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
  17. Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
  18. Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
  19. Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
  20. Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
  21. Zheng, Z. -. F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177 (2017).
  22. Holmberg, K., Shi, T. -. J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
  23. Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
  24. Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. . Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
  25. Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
  26. Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -. M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
  27. Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
  28. Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
  29. Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
  30. Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
  31. Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
  32. Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. . Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , 119 (2017).
  33. Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
  34. Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
  35. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
  36. Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
  37. Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314 (2016).
  38. Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
  39. Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , 2023 (2023).
  40. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  41. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -. F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  42. François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved