Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi

Özet

Bu el yazması, postganglionik lomber sempatik nöronların bir fareden cerrahi olarak çıkarılması için bir protokol sunmaktadır. Bu prosedür, distal doku hedeflerinde sempatik innervasyonun rolünü araştırmayı amaçlayan çok sayıda çalışmayı kolaylaştıracaktır.

Özet

Periferik sinir yaralanmaları sık görülür ve hastaların sadece %10'unda yaralanma sonrası tam fonksiyonel iyileşme sağlanır. Sempatik sinir sistemi, bedensel homeostazın korunmasında birçok kritik rol oynar, ancak nadiren periferik sinir hasarı bağlamında incelenmiştir. Periferdeki distal hedeflerde postganglionik sempatik nöronal fonksiyonların kapsamı şu anda belirsizdir. Periferik hedeflerin sempatik innervasyonunun rolünü daha iyi araştırmak için, cerrahi bir "nakavt" modeli alternatif bir yaklaşım sağlar. Bu kimyasal olarak elde edilebilse de, postganglionik sempatik nöronların kimyasal yıkımı spesifik olmayabilir ve doza bağımlı olabilir. Bir zamanlar küçük hayvanlarda "neredeyse uygulanamaz" olduğu düşünülen farelerde cerrahi lomber sempatektominin kullanılması, arka bacakları innerve eden postganglionik sempatik nöronların spesifik olarak hedeflenmesine izin verir. Bu el yazması, L2-L5 lomber sempatik gangliyonların, arka pençe ter tepkisini ve siyatik sinirdeki sempatik akson sayısını güvenilir bir şekilde azaltan bir sağkalım ameliyatı olarak bir fareden cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır.

Giriş

Periferik sinir yaralanmaları (PNI'ler) distal doku hedeflerinde nadiren fonksiyonel olarak tam olarak iyileşen motor, duyusal ve sempatik defisitlere yol açabilir¹. PNI araştırması genellikle motor ve duyusal yenilenme üzerine odaklanmıştır; Bununla birlikte, sıçan siyatik sinirinin yaklaşık dörtte biri miyelinsiz sempatik aksonlardan oluşur². Bununla birlikte, periferik dokularda sempatik innervasyonun rolü tam olarak anlaşılamamıştır³. Sempatik sinir sistemi, bedensel homeostazın korunmasında, bağışıklık regülasyonuna, termoregülasyona, vasküler tonusa, mitokondriyal biyogeneze ve daha fazlasına katılmada önemli bir rol oynar 4,5,6,7,8,9,10,11 . Nöromüsküler kavşakta sempatik innervasyon kaybolduğunda, motonöron innervasyonunun korunmasına rağmen kalıcı kas güçsüzlüğü ve sinaptik instabilite gözlenir¹². Nöromüsküler kavşaktaki sinaptik iletimin bu sempatik regülasyonunun yaşlanma ile azaldığı gösterilmiştir ^13,14, bu da kas kütlesi, kuvveti ve gücünde yaşa bağlı azalma olarak tanımlanan sarkopeniye katkıda bulunur¹⁵. Periferik dokuların sempatik innervasyonunun rolünün daha iyi anlaşılması, PNI'ler ve diğer sempatik disfonksiyon formları olan hastalar için fonksiyonel sonuçları optimize edecek tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir.

Sempatektomi, distal hedef dokularda sempatik innervasyonun rolünün araştırılmasına izin verecek güçlü bir deneysel araçtır. Spesifik olarak, L2-L5 seviyesindeki sempatik gangliyonların çıkarılması, alt ekstremitelere sempatik innervasyonun çoğunu ortadan kaldırır, bu da özellikle siyatik sinirle ilgilenen araştırmacılar için yararlıdır.

Bu protokol, hayatta kalma ameliyatı olarak bir fareden L2-L5 seviyesi postganglionik sempatik nöronların çıkarılmasını detaylandırır. Bu prosedür, kemirgen mikrocerrahi becerileri ve fare anatomisine aşinalık gerektirir ve etkili bir şekilde uygulandığında, herhangi bir görünür fenotipik farklılığa neden olmaz. Kemirgen araştırmalarında cerrahi lomber sempatektomi kullanılmıştır, sıçanlarda farelere göre daha fazla 16,17,18,19,20,21; Ancak, protokolü açıklayan ayrıntılı bir protokol şu anda mevcut değildir. Lomber sempatektomiyi kullanan önceki çalışmalar, öncelikle çeşitli sinir yaralanması modellerinde genellikle sempatektomi ile zayıflatılan ağrı yanıtında sempatik innervasyonun rolüne odaklanmıştır. Farelerde^{bu tekniği 22} kullanmıştır, muhtemelen anatomik işaretlerin daha küçük boyutu nedeniyle, cerrahi sempatektomi kullanımının küçük hayvanlarda "neredeyse uygulanabilir olmadığına" inanılmaktadır^23,24. Mikrosempatiektomiler şeklindeki lokalize sempatikektomiler, kemirgen modellerinde, çoğunlukla ağrı davranışları bağlamında da kullanılmıştır 25,26,27. Mikrosempatektomi, total lomber sempatektominin aksine, gri ramusun belirli bir spinal sinire giden bir segmentinin bağlantısının kesildiği ve çıkarıldığı bir dorsal yaklaşım kullanır ve bu da daha geniş yayılımlı yan etkilerden kaçınacak çok hedefli bir sempatektomiye izin verir.

Fare modelleri, genetik manipülasyon gerektiren birçok çalışma için kritik öneme sahip olduğundan, bu prosedür periferik sinir yaralanmalarının genişliğinin ötesinde de çok yönlü uygulamalara sahip olacaktır. Transabdominal bir yaklaşım kullanılarak, lomber sempatik gangliyonlar, belirgin bir yan etki olmaksızın fareden güvenilir bir şekilde görüntülenebilir ve rezeke edilebilir. Postganglionik sempatik nöronların kimyasal yıkımı için 6-hidroksidopamin (6-OHDA) kullanımı gibi protokoller mevcut olmasına rağmen23,24, bu cerrahi prosedür postganglionik lomber sempatik ganglionların anatomik olarak spesifik hedeflenmesine izin verir. Cerrahi sempatektomi kullanımı, farmakolojik yöntemlerle ilgili spesifik olmayan ve doza bağlı endişeleri de ortadan kaldırır^28,29.

6-OHDA uygulaması yoluyla kimyasal sempatiektomilerin kullanımı, 1967'de küçük hayvanlarda cerrahi sempatiektomiler tercih edilmediğinden, adrenerjik sinir uçlarının seçici yıkımını sağlamanın basit bir yolu olarak tanımlanmıştır^23,24. 6-OHDA, Parkinson hastalığı olan hastalarda endojen olarak oluşan katekolaminerjik bir nörotoksindir ve toksisitesi, mitokondride serbest radikaller oluşturma ve elektron taşıma zincirini inhibe etme yeteneğinden kaynaklanır^30,31. Norepinefrin alımı-1 taşıma mekanizmaları sayesinde, 6-OHDA, postganglionik sempatik nöronlar²⁸ gibi noradrenerjik nöronlar içinde birikebilir. Sonunda, nöron 6-OHDA tarafından yok edilir; Bununla birlikte, periferik sinir sistemindeki terminaller, amin seviyeleri hala azaldığında bile fonksiyonel aktivitenin restorasyonu ile yenilenir. 6-OHDA'ya yanıt olarak farklı organlar için farklı dozaj eşikleri de mevcuttur ve daha yüksek dozlarda 6-OHDA'nın daha spesifik olmayan etkiler sergilediği, nörotoksik sonuçlarını katekolamin içermeyen nöronlara ve hatta nöronal olmayan hücrelere genişlettiği gösterilmiştir. Noradrenerjik nöronların yanı sıra, dopaminerjik nöronlar da 6-OHDA'dan^{etkilenir 29}, bu da kimyasal sempatektomiyi postganglionik sempatik nöronlara cerrahi sempatektomiden daha az spesifik hale getirir.

Bu nedenle, cerrahi bir lomber sempatektomi, sempatik sinir sisteminin çeşitli yaralanma ve hastalık durumlarına nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için farede çeşitli deneysel teknikler ve genetik manipülasyonlarla birleştirilebilen, sempatik innervasyonun alt ekstremitelere hedefli ablasyonunu sağlar.

Protokol

Tüm deneyler, Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı (IACUC protokol numarası PROTO201700371 altında). Bu çalışmada 14 haftalık ve 16-21 g ağırlığında dört yetişkin dişi vahşi tip C57BL / 6J faresi kullanıldı. Burada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Cerrahi aletleri otoklavlayın: 1 çift keskin makas, 2 ince uçlu cımbız, 1 iğne ucu.
2. Bir ısıtma yastığını 37 °C'ye ısıtın ve ameliyat masasının altına yerleştirin.
3. Anestezi indüksiyon odası da dahil olmak üzere cerrahi alana dezenfektan püskürtün ve kağıt havluyla iyice silin.
4. Fareyi tutmadan önce uygun önlük giydiğinizden ve el yıkadığınızdan emin olun.
5. Fareyi 5 mg / kg vücut ağırlığında meloksikam ile besleyin ve indüksiyon sırasında aspirasyonu önlemek için farenin ilacı tamamen yutması için bolca zaman tanıyın.
6. Fareyi anestezi altında 1 L / dak oksijende% 3 izofluran ile indükleyin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
7. Fare uyuşturulduktan sonra (ayak parmağını sıkıştırmaya tepki vermeden), fareyi burnu takılı bir burun konisi içinde olacak şekilde sırtüstü cerrahi masanın üzerine yerleştirin.
8. Fare burun konisine düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, anestezinin sürdürülmesi için izofluranı %2'ye ayarlayın.
9. Keratokonjonktivit sicca'yı (kuru göz) önlemek için farenin gözlerine göz jeli yerleştirin.
10. Farenin cerrahi bantla cerrahi masanın üstüne düzgün şekilde sabitlendiğinden emin olun.
11. Nefes alma kolaylığı ve yeterli solunum hızı için sürekli izleyin.
12. Kürkü farenin karnından cinsel organların hizasından kaburgaların altına kadar tıraş edin.
13. Kürk çıkarıldıktan sonra, önce cerrahi alanı %70 etanol ile merkezden çevreye dairesel hareketlerle silin. Ardından, cerrahi bölgeyi aynı dairesel hareketlerle betadin ile silin. Hem etanol hem de betadin adımlarını toplam 3 kez tekrarlayın.
14. Fareyi, cerrahi alanı görselleştirmek için ortasından uygun boyutta bir delik açılmış steril bir cerrahi örtü ile örtün. Eşkenar dörtgen şekil, perdeyi ikiye katlayarak ve ~10 mm yüksekliğinde ve ~15 mm tabana sahip bir ikizkenar üçgen keserek yapılabilir.

2. Kesiler

1. Bir çift keskin makas ve ince uçlu cımbız kullanarak, kasık simfiz seviyesinin ~ 1 mm üstünden kaburgaların ~ 2 mm altına kadar orta hat kesisi oluşturun.
2. Bilateral rektus abdominis kasları arasındaki orta hat fasyasını (linea alba) tanımlayın. Cımbız kullanarak, karın kaslarını alttaki organlardan uzaklaştırın ve karın boşluğuna girmek için linea alba boyunca kesin.
   NOT: Linea alba, orta hat³² boyunca uzunlamasına uzanan daha ince bir fasya çizgisini ortaya çıkarmak için bilateral rektus abdominus kaslarını yanal olarak hafifçe çekerek tanımlanabilir. Kesi işleminin linea alba içinden yapılması kasın daha kolay kapanmasını sağlar.
3. Sonraki adımları düzgün bir şekilde görselleştirmek için karın kaslarını ve cildi yanal olarak 5-0 dikişle geri çekin.

3. L2-L5 lomber sempatik ganglionların tanımlanması

1. Lomber sempatik ganglionlar abdominal aortun posterior ve inferior vena kava ile uzanır. Aortu görselleştirmek için, bağırsakları karın boşluğundan kısmen çıkarın.
   NOT: L2-L5 seviyesindeki sempatik ganglionlar, aort bifurkasyon seviyesinden iliak damarlara geçiş yaparak sol renal arter^{seviyesine kadar uzanır 21,33}.
   1. Örtünün üzerine steril tuzlu suya doyurulmuş steril bir pamuklu kare yerleştirin, üstte ve insizyonun soluna uzanın. Dikkatlice, 2 steril pamuk uçlu aplikatör ile kolonu ve ince bağırsağı kısmen tuzlu suya batırılmış pamuk karenin üzerine itin.
      NOT: Çekum ve apendiksin karın boşluğunun dışında olduğundan ve inen kolonun görüntülenebildiğinden emin olun.
   2. Açıkta kalan bağırsakları başka bir tuzlu doymuş pamuklu kare ile örtün.
   3. Bağırsakların ritmik hareketi ile tanımlanabilen ameliyat boyunca peristalsis'i periyodik olarak izleyin.
2. Bağırsağın rektum ve anüse doğru hareket eden ve görünür dışkı maddesi içerebilen kısmı olan inen kolonu tanımlayın ve abdominal aort ve inferior vena kava'yı ortaya çıkarmak için bu yapıyı kapalı cımbızla sola doğru saptırın. Bu iki damar bağ dokusu ile bağlıdır ve tek bir birim olarak hareket etmelidir.
   1. Bir cımbızla, karın damarlarını çevredeki bağ dokusundan kaldırın. Bu kaldırılırken, bağ dokusundan dikkatlice 5-0 naylon bir dikiş yerleştirin.
      DİKKAT: Karın damarlarını iğne ile delmeyin: Bu, farenin hızlı bir şekilde dekompansasyonuna ve muhtemelen ölüme yol açacaktır.
   2. Sütür bağ dokusundan yerleştirildikten sonra, karın damarlarını sola doğru kaydırın. Bu, bilateral psoas kaslarının doğrudan görüntülenmesine izin veren üçgen bir pencere verecektir.
      NOT: Ganglionların abdominal damarlarla olan yakın bağlantıları nedeniyle, sempatik gangliyonlar, tipik olarak orta hatta yer almasına rağmen, damarlarla birlikte hafifçe sola (farenin sağına) saptırılacaktır. Abdominal damarlar saptırıldıktan sonra, soldaki iki tarafı saptırılmış karın damarlarından oluşan ve sağ tarafı farenin orta hattı tarafından tanımlanan (bilateral psoas kasları arasında) bir üçgen görselleştirilmelidir. Sempatik ganglionlar bu üçgenin ortasında yer alır (Şekil 1A). Dikey olarak yan yana hareket ederler ve yarı saydam görünürler. Farenin orta hattına dalan ve sağ psoas kası üzerinde düz duran küçük bir damarla örtüşebilirler. Gangliyonları ortaya çıkarmak için üstteki herhangi bir fasyayı kör bir şekilde incelemek için cımbız kullanın (Şekil 1B).
3. Sol renal arteri ve sol testis veya yumurtalık arterini tanımlayın.
   NOT: Yanları üstte sol renal arter, lateralde hayvanın orta hattı ve abdominal aort/inferior vena kava, altta ise sol testis veya over atardamarından oluşan dörtgen oluşturacak büyük damarlardır. L2 seviyesindeki gangliyonlar büyüktür ve bu dörtgen içinde yer alır (Şekil 1A). Bu dörtgene cımbızla girmek ve bilateral L2 gangliyonlarını tanımlamak için dikkatlice künt diseksiyon yapın (Şekil 1B).
4. Ganglionların alt ve üst kısımları tanımlandıktan sonra, görünür bilateral ganglionların alt yönünü bir cımbızla tutun ve yukarı doğru çekin. L4 ve L5 gibi daha alt yerleşimli ganglionların görselleştirilmesi, ikinci cımbız çifti ile görüşü engelleyen herhangi bir organı hafifçe iterek arttırılabilir.
   NOT: Adım 3.2.2'de bahsedilen orta hat perforan damarın görüntülenmesi daha eksiksiz bir lomber sempatektomi sağlayacaktır. Diğer elinizde ikinci bir cımbız tutarak, ilk cımbız çifti ile gangliyonları aynı anda yukarı çekerken karın içindeki gangliyonları tutan fasya ve nöronal bağlantıları çekin. Sadece bir cımbız gangliyonlara tutunmalı, diğeri ise fasya ve nöronal bağlantıları temizlemelidir. Sol testis veya yumurtalık arteri seviyesine geldikten sonra, alt zincir gangliyonları hala sağlamsa, L2 gangliyonları alt zincir tarafından çekildiğinde hareket edeceğinden, L2 tanımlaması için yardımcı olabilir. L3-5 gangliyonları, L2 gangliyonlarını cımbızla dörtgenden çıkarmadan önce testis veya yumurtalık arterinde kırılabilir. Kuadrik içinde bulunan tek ganglionlar L2 gangliyonlarıdır.
5. Bu prosedür minimum kan kaybına sahip olmalıdır. Kanama meydana gelirse, kapatmadan önce yeterli hemostaz olduğundan emin olun.

4. Cilt kapanması

1. Yeterli hemostaz elde edildikten sonra, karın damarlarını yerinde tutan dikişi çıkarın.
2. 2 steril pamuk uçlu aplikatör kullanarak, yönlendirilmiş bağırsakları dikkatlice karın boşluğuna yerleştirin.
3. 5-0 emilebilir bir sütürle, karın kaslarına yaklaşmak için çalışan bir dikiş yapın.
4. 5-0 naylon sütür ile cildi kapatmak için basit kesikli dikişler kullanın.
5. Kesi bölgesine Neosporin gibi cömert bir antibiyotik merhem tabakası sürün.
6. Fareyi bir ısıtma yastığı üzerindeki temiz bir kafese yerleştirin.
7. Fareyi uyanık ve gezici olana kadar her 15 dakikada bir gözlemleyin. Bu genellikle 30 dakikadan az sürer.

5. Pilokarpin ter deneyi

NOT: Lomber sempatektomi sonrası sempatik fonksiyonel aktivitenin tükenmesini değerlendirmek için lomber sempatektomiden 7 gün sonra pilokarpin ter testi kullanıldı.

1. Hint yağında %10 patates nişastası karışımının yanı sıra %0.9 NaCl içinde %1'lik bir pilokarpin hidroklorür çözeltisi hazırlayın.
2. Bir boya fırçası kullanarak ayağın plantar yüzeyini betadin ile kaplayın. Bu tabakanın tamamen kurumasını bekleyin.
3. Betadin tabakası kuruduktan sonra, hint yağında %10'luk bir nişasta tabakası uygulamak için ayrı bir boya fırçası kullanın.
4. 0.25 μL / g vücut ağırlığında% 1 pilokarpin subkutan olarak bir şırınga kullanarak boynun üzerindeki gevşek cilde uygulayın. Pilokarpin uygulamasından hemen sonra bir zamanlayıcı başlatın.
5. Enjeksiyondan 8 dakika sonra, ayağın plantar yüzeyinin fotoğraflarını çekin.
6. Fiji'yi kullanarak, altı (6) ayak tabanının tümünde bulunan koyu lekelerin sayısını sayın (Şekil 2A).

6. İmmünohistokimya

NOT: Lomber sempatektomi sonrası periferik sinirlerdeki sempatik aksonların dejenerasyonunu değerlendirmek için bilateral siyatik sinirler postoperatif 21. günde çıkarıldı.

1. Fareleri uyuşturun (protokolün 1. adımını izleyerek), iki taraflı siyatik sinirleri toplayın ve ardından hayvanı derhal ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
2. Siyatik sinirleri 20 dakika boyunca 0,01 M fosfat tamponlu salin (PBS) içinde doğrudan% 4 paraformaldehite yerleştirin, ardından 4 ° C'de gece boyunca kriyoproteksiyon için 0,1 M PBS'de% 20 sükroza aktarın.
3. Siyatik sinirleri 20 μm'de bir kriyostat kullanarak uzunlamasına bölümlere ayırın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin.
4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 Tween 20 (TBST) ile tris tamponlu salin içinde% 10 normal keçi serumu (NGS) ile sinir bölümlerini bloke edin.
5. Bloke edici tamponu çıkarın ve sırasıyla 1:750 ve 1:1000'de bloke edici tamponda (TBST'de %10 NGS) seyreltilmiş birincil antikorlar tavşan anti-tirozin hidroksilaz ve tavuk anti-nörofilament ağırlıklı ile değiştirin. Birincil antikorların gece boyunca oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe etmesine izin verin.
6. Her ikisi de bloke edici tamponda 1:200'de seyreltilmiş ikincil antikorlar keçi anti-tavşan 647 ve keçi anti-tavuk 488'i uygulamadan önce, her yıkamada 10 dakika olmak üzere TBST ile slaytı yıkayın. İkincil antikorların oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir nem odasında inkübe etmesine izin verin.
7. Sürgünü TBST ile her yıkamada 10 dakika olmak üzere 4 kez yıkayın ve montajdan önce sürgünün ışık korumalı bir alanda kurumasını bekleyin.
8. 10x objektif üzerinde bir floresan mikroskobunda en az 40 μm aralıklı sinir kesitlerini görüntüleyin.
9. Fiji'de, sinir bölümlerini düzeltin ve bölümün genişliğini kapsayan rastgele yerleştirilmiş üç dikey çizgi çizin. Her dikey çizgiyi geçen aksonların sayısını sayın ve bunu dikey çizgideki bölümün genişliğine bölün. Bölüm başına üç dikey çizginin her biri için tekrarlayın. Bölüm başına elde edilen üç değerin ortalamasını alın ve ayrıca sinir başına üç bölümün değerlerinin ortalamasını alın.

Sonuçlar

Bu protokol, postganglionik lomber sempatik nöronların bir fareden cerrahi olarak çıkarılmasını tanımlar. İki fareye lomber sempatiektomi yapıldı ve iki fare kontrol olarak görev yaptı. Başarılı bir cerrahi lomber sempatektomi elde etmek için, Şekil 1'de görüldüğü gibi en azından L2 ve L3 bilateral lomber sempatik gangliyonların yeterli görüntülenmesi sağlanmalıdır. L4 ve L5 gangliyonlarının çıkarılması, alt gövdenin tamamen sempatik denervasyonunu sağl...

Tartışmalar

Lomber sempatik gangliyonlar, birçok kritik karın organının ve büyük damarların arkasında yer alan çok küçük yapılardır. Bu nedenle, bu prosedür önemli bir hassasiyet ve doğruluk gerektirir. Zorluğun çoğu, intraoperatif olarak sempatik gangliyonların tanımlanmasında yatmaktadır. Öğrencinin, bu prosedürü canlı bir farede denemeden önce bir fare kadavrasındaki gangliyonu tanımlayabilmesi önerilir. Bağırsakların saptırılmasından sonra sempatik gangliyonları tanımlarken sorun gidermen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914