Simpatectomía lumbar quirúrgica en ratones

Resumen

Este manuscrito presenta un protocolo para la extirpación quirúrgica de las neuronas simpáticas lumbares postganglionares de un ratón. Este procedimiento facilitará multitud de estudios dirigidos a investigar el papel de la inervación simpática en dianas tisulares distales.

Resumen

Las lesiones de los nervios periféricos son comunes, y la recuperación funcional completa después de la lesión se logra en solo el 10% de los pacientes. El sistema nervioso simpático desempeña muchas funciones críticas en el mantenimiento de la homeostasis corporal, pero rara vez se ha estudiado en el contexto de la lesión de los nervios periféricos. El alcance de las funciones neuronales simpáticas postganglionares en objetivos distales en la periferia no está claro actualmente. Para explorar mejor el papel de la inervación simpática de los objetivos periféricos, un modelo quirúrgico de "knock-out" proporciona un enfoque alternativo. Aunque esto se puede lograr químicamente, la destrucción química de las neuronas simpáticas postganglionares puede ser inespecífica y dependiente de la dosis. El uso de una simpatectomía lumbar quirúrgica en ratones, que alguna vez se pensó que era "prácticamente impracticable" en animales pequeños, permite dirigirse específicamente a las neuronas simpáticas postganglionares que inervan las extremidades traseras. Este manuscrito describe cómo extirpar quirúrgicamente los ganglios simpáticos lumbares L2-L5 de un ratón como cirugía de supervivencia, lo que disminuye de manera confiable la respuesta al sudor de la pata trasera y el número de axones simpáticos en el nervio ciático.

Introducción

Las lesiones de los nervios periféricos (PNI) pueden provocar déficits motores, sensoriales y simpáticos en los objetivos del tejido distal que rara vez se recuperan completamente funcionalmente¹. La investigación del PNI se ha centrado a menudo en la regeneración motora y sensorial; Sin embargo, casi una cuarta parte del nervio ciático de la rata consta de axones simpáticos no mielinizados². El papel de la inervación simpática en los tejidos periféricos, sin embargo, no se comprende completamente³. El sistema nervioso simpático desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis corporal, participando en la regulación inmunitaria, la termorregulación, el tono vascular, la biogénesis mitocondrial, etc^. 4,5,6,7,8,9,10,11 . Cuando se pierde la inervación simpática en la unión neuromuscular, se observa debilidad muscular persistente e inestabilidad sináptica a pesar del mantenimiento de la inervación de las motoneuronas¹². Se ha demostrado que esta regulación simpática de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular disminuye con el envejecimiento^13,14, lo que contribuye a la sarcopenia, definida como la reducción dependiente de la edad en la masa muscular, la fuerza y la potencia¹⁵. Es necesario comprender mejor el papel de la inervación simpática de los tejidos periféricos para el desarrollo de terapias que optimicen los resultados funcionales de los pacientes con IPN y otras formas de disfunción simpática.

La simpatectomía es una poderosa herramienta experimental que permitirá investigar el papel de la inervación simpática en los tejidos diana distales. Específicamente, la extirpación de los ganglios simpáticos a nivel L2-L5 elimina la mayor parte de la inervación simpática a las extremidades inferiores, lo que es especialmente útil para los investigadores interesados en el nervio ciático.

Este protocolo detalla la extirpación de neuronas simpáticas postganglionares de nivel L2-L5 de un ratón como cirugía de supervivencia. Este procedimiento requiere habilidades microquirúrgicas en roedores y familiaridad con la anatomía del ratón, y cuando se realiza de manera efectiva, no causa diferencias fenotípicas visibles. La simpatectomía lumbar quirúrgica se ha utilizado en la investigación con roedores, más en ratas que en ratones 16,17,18,19,20,21; Sin embargo, actualmente no existe un protocolo detallado que describa el protocolo. Los estudios anteriores que utilizan la simpatectomía lumbar se han centrado principalmente en el papel de la inervación simpática en la respuesta al dolor, que generalmente se atenúa con la simpatectomía en varios modelos de lesiones nerviosas. Son pocos los estudios que han utilizado esta técnica en ratones²², probablemente debido al menor tamaño de los puntos de referencia anatómicos, ya que se creía que el uso de la simpatectomía quirúrgica era "prácticamente impracticable" en animales pequeños^23,24. Las simpatectomías localizadas en forma de microsimpatectomías también se han utilizado en modelos de roedores, también principalmente en el contexto de comportamientos de dolor 25,26,27. La microsimpatectomía, a diferencia de la simpatectomía lumbar total, utiliza un abordaje dorsal a través del cual se desconecta y extirpa un segmento de la rama gris a un nervio espinal específico, lo que permite una simpatectomía muy específica que evitará efectos secundarios más amplios.

Debido a que los modelos de ratón son críticos para muchos estudios que requieren manipulación genética, este procedimiento también tendrá aplicaciones versátiles más allá de la amplitud de las lesiones de los nervios periféricos. Utilizando un abordaje transabdominal, los ganglios simpáticos lumbares se pueden visualizar y resecar de forma fiable desde el ratón sin efectos adversos aparentes. A pesar de que existen protocolos para la destrucción química de las neuronas simpáticas postganglionares, como el uso de 6-hidroxidopamina (6-OHDA)^23,24, este procedimiento quirúrgico permite dirigirse anatómicamente específicamente a los ganglios simpáticos lumbares postganglionares. El uso de la simpatectomía quirúrgica también evita las preocupaciones inespecíficas y dependientes de la dosis relacionadas con los métodos farmacológicos^28,29.

El uso de simpatectomías químicas mediante la administración de 6-OHDA fue descrito en 1967 como una forma sencilla de lograr la destrucción selectiva de las terminaciones nerviosas adrentrópicas, ya que las simpatectomías quirúrgicas en animales pequeños no eran favorecidas^23,24. La 6-OHDA es una neurotoxina catecolaminérgica que se forma endógenamente en pacientes con enfermedad de Parkinson, y su toxicidad se deriva de su capacidad para formar radicales libres e inhibir la cadena de transporte de electrones en las mitocondrias^30,31. A través de los mecanismos de transporte de la captación de norepinefrina-1, el 6-OHDA es capaz de acumularse dentro de las neuronas noradrenérgicas, como las neuronas simpáticas postganglionares²⁸. Eventualmente, la neurona es destruida por el 6-OHDA; Sin embargo, las terminales del sistema nervioso periférico se regeneran, con el restablecimiento de la actividad funcional incluso cuando los niveles de aminas siguen reducidos. También están presentes diferentes umbrales de dosis para diferentes órganos en respuesta a 6-OHDA, y se ha demostrado que dosis más altas de 6-OHDA exhiben más efectos inespecíficos, extendiendo sus consecuencias neurotóxicas a las neuronas que no contienen catecolaminas e incluso a las células no neuronales. Aparte de las neuronas noradrenérgicas, las neuronas dopaminérgicas también se ven afectadas por el 6-OHDA²⁹, lo que hace que la simpatectomía química sea menos específica para las neuronas simpáticas postganglionares que la simpatectomía quirúrgica.

Por lo tanto, una simpatectomía lumbar quirúrgica permite la ablación dirigida de la inervación simpática a las extremidades inferiores, que se puede combinar con una variedad de técnicas experimentales y manipulaciones genéticas en el ratón para estudiar cómo el sistema nervioso simpático contribuye a diversos estados de lesiones y enfermedades.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Emory (bajo el número de protocolo PROTO201700371 de la IACUC). En este estudio se utilizaron cuatro ratones hembra adulta de tipo salvaje C57BL/6J, con una edad de 14 semanas y un peso de entre 16 y 21 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados aquí se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación prequirúrgica

1. Autoclave de las herramientas quirúrgicas: 1 par de tijeras afiladas, 2 pinzas de punta fina, 1 destornillador de agujas.
2. Caliente una almohadilla térmica a 37 °C y colóquela debajo de la mesa quirúrgica.
3. Rocíe el área quirúrgica, incluida la cámara de inducción de anestesia, con desinfectante y límpiela a fondo con toallas de papel.
4. Asegúrese de que la bata y el lavado de manos sean adecuados antes de manipular el mouse.
5. Alimente al ratón con meloxicam a dosis de 5 mg/kg de peso corporal y deje suficiente tiempo para que el ratón trague completamente el medicamento para evitar la aspiración durante la inducción.
6. Inducir al ratón bajo anestesia con isoflurano al 3% en 1 L/min de oxígeno (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
7. Una vez que el ratón esté anestesiado (sin reacción al pinzamiento del dedo del pie), colóquelo sobre la mesa quirúrgica, en decúbito supino, con la nariz en un cono nasal ajustado.
8. Una vez que el ratón esté correctamente colocado en el cono de la nariz, ajuste el isoflurano al 2% para el mantenimiento de la anestesia.
9. Coloque gel para los ojos en los ojos del ratón para prevenir la queratoconjuntivitis seca (ojo seco).
10. Asegúrese de que el mouse esté correctamente asegurado con cinta quirúrgica a la mesa quirúrgica.
11. Controle continuamente la facilidad para respirar y la frecuencia respiratoria adecuada.
12. Afeita el pelaje desde el abdomen del ratón desde el nivel de los genitales hasta debajo de las costillas.
13. Una vez retirado el pelo, primero se debe limpiar la zona quirúrgica con movimientos circulares, de central a periférica, con etanol al 70%. Luego, limpie el área quirúrgica con betadine con el mismo movimiento circular. Repita los pasos de etanol y betadine un total de 3 veces.
14. Cubra el ratón con un paño quirúrgico estéril con un orificio del tamaño adecuado cortado en el medio para visualizar el campo quirúrgico. La forma romboidal se puede hacer doblando la cortina por la mitad y cortando un triángulo isósceles con una altura de ~10 mm y una base de ~15 mm.

2. Incisiones

1. Con un par de tijeras afiladas y pinzas de punta fina, haga una incisión en la línea media desde ~1 mm por encima del nivel de la sínfisis púbica hasta ~2 mm por debajo de las costillas.
2. Identificar la fascia de la línea media (línea alba) entre los músculos rectos abdominales bilaterales. Con las pinzas, levante los músculos abdominales lejos de los órganos subyacentes y corte a lo largo de la línea alba para ingresar a la cavidad abdominal.
   NOTA: La línea alba se puede identificar tirando suavemente de los músculos rectos abdominales bilaterales lateralmente para revelar una línea de fascia más delgada que se encuentra longitudinalmente a lo largo de la línea media³². Hacer la incisión a través de la línea alba permite que el músculo se cierre más fácilmente.
3. Retraiga los músculos abdominales y la piel con suturas 5-0 lateralmente para visualizar correctamente los siguientes pasos.

3. Identificación de los ganglios simpáticos lumbares L2-L5

1. Los ganglios simpáticos lumbares se encuentran posteriores a la aorta abdominal y a la vena cava inferior. Para visualizar la aorta, se extraen parcialmente los intestinos de la cavidad abdominal.
   NOTA: Los ganglios simpáticos a nivel L2-L5 atraviesan desde el nivel de la bifurcación aórtica en los vasos ilíacos hasta el nivel de la arteria renal izquierda^21,33.
   1. Coloque un cuadrado de algodón estéril saturado en solución salina estéril sobre el paño, colocado en la parte superior y a la izquierda de la incisión. Con cuidado, con 2 aplicadores estériles con punta de algodón, empuje el colon y el intestino delgado parcialmente hacia afuera sobre el cuadrado de algodón empapado en solución salina.
      NOTA: Asegúrese de que el ciego y el apéndice estén fuera de la cavidad abdominal y que se pueda visualizar el colon descendente.
   2. Cubra los intestinos expuestos con otro cuadrado de algodón saturado con solución salina.
   3. Monitorear periódicamente el peristaltismo durante toda la cirugía, que se puede identificar por el movimiento rítmico de los intestinos.
2. Identifique el colon descendente, que es la porción del intestino que viaja hacia el recto y el ano y puede contener materia fecal visible, y desvíe esta estructura hacia la izquierda con pinzas cerradas para revelar la aorta abdominal y la vena cava inferior. Estos dos vasos están unidos por tejido conectivo y deben moverse como una unidad.
   1. Con un par de pinzas, levante los vasos abdominales por el tejido conectivo circundante. Mientras se levanta, coloque con cuidado una sutura de nailon 5-0 a través del tejido conectivo.
      PRECAUCIÓN: NO perfore los vasos abdominales con la aguja: esto provocará una rápida descompensación del ratón y probablemente la muerte.
   2. Una vez que se haya insertado la sutura a través del tejido conectivo, desvíe los vasos abdominales hacia la izquierda. Esto dará una ventana triangular, lo que permitirá la visualización directa de los músculos psoas bilaterales.
      NOTA: Debido a las conexiones íntimas que los ganglios tienen con los vasos abdominales, los ganglios simpáticos, aunque típicamente se encuentran en la línea media, se desviarán ligeramente hacia la izquierda (a la derecha del ratón) junto con los vasos. Una vez que los vasos abdominales están desviados, se debe visualizar un triángulo, con los dos lados de la izquierda que consisten en los vasos abdominales desviados y el lado derecho definido por la línea media del ratón (entre los músculos psoas bilaterales). Los ganglios simpáticos se encuentran en el centro de este triángulo (Figura 1A). Viajan verticalmente uno al lado del otro y parecen translúcidos. Pueden superponerse a un pequeño vaso que se sumerge en la línea media del ratón y se encuentra plano sobre su músculo psoas derecho. Use pinzas para diseccionar sin rodeos cualquier fascia suprayacente para revelar los ganglios (Figura 1B).
3. Identificar la arteria renal izquierda y la arteria testicular u ovárica izquierda.
   NOTA: Se trata de grandes vasos que formarán un cuadrilátero, cuyos lados consisten en la arteria renal izquierda en la parte superior, la línea media del animal y la aorta abdominal/vena cava inferior en la parte lateral, y la arteria testicular u ovárica izquierda en la parte inferior. Los ganglios del nivel L2 son grandes y se encuentran dentro de este cuadrilátero (Figura 1A). Diseccionar cuidadosamente para entrar en este cuadrilátero con pinzas e identificar los ganglios L2 bilaterales (Figura 1B).
4. Una vez identificadas las partes inferior y superior de los ganglios, agarre la cara inferior de los ganglios bilaterales visibles con un par de pinzas y tire hacia arriba. La visualización de los ganglios más localizados en la parte inferior, como L4 y L5, se puede aumentar empujando suavemente cualquier órgano que obstruya la vista en la parte inferior con el segundo par de pinzas.
   NOTA: La visualización del vaso perforante de la línea media mencionado en el paso 3.2.2 asegurará una simpatectomía lumbar más completa. Sosteniendo un segundo par de pinzas en la otra mano, tire de la fascia y las conexiones neuronales que sostienen los ganglios en el abdomen mientras tira simultáneamente de los ganglios con el primer par de pinzas. Solo un par de pinzas debe sujetar los ganglios, mientras que el otro despeja la fascia y las conexiones neuronales. Una vez a nivel de la arteria testicular u ovárica izquierda, puede ser útil para la identificación de L2 si los ganglios de la cadena inferior aún están intactos, ya que los ganglios L2 se moverán cuando la cadena inferior tire de ellos. Los ganglios L3-5 se pueden romper en la arteria testicular u ovárica antes de extraer los ganglios L2 del cuadrilátero con pinzas. Los únicos ganglios presentes dentro del cuadrilátero son los ganglios L2.
5. Este procedimiento debe tener una pérdida mínima de sangre. Si se produce sangrado, asegúrese de que la hemostasia sea adecuada antes del cierre.

4. Cierre de la piel

1. Después de lograr una hemostasia adecuada, retire la sutura que sostiene los vasos abdominales en su lugar.
2. Con 2 aplicadores estériles con punta de algodón, reemplace con cuidado los intestinos desviados hacia la cavidad abdominal.
3. Con una sutura reabsorbible 5-0, realiza un punto corrido para aproximar los músculos abdominales.
4. Con la sutura de nailon 5-0, use puntos interrumpidos simples para cerrar la piel.
5. Aplique una capa generosa de ungüento antibiótico, como Neosporin, en el sitio de la incisión.
6. Coloque el mouse en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica.
7. Observe al ratón cada 15 minutos hasta que esté despierto y deambulatorio. Esto suele tardar menos de 30 minutos.

5. Ensayo del sudor con pilocarpina

NOTA: Para evaluar el agotamiento de la actividad funcional simpática después de una simpatectomía lumbar, se utilizó un ensayo de sudor con pilocarpina 7 días después de la simpatectomía lumbar.

1. Prepare una solución de clorhidrato de pilocarpina al 1% en NaCl al 0,9% junto con una mezcla de almidón de patata al 10% en aceite de ricino.
2. Con un pincel, cubra la superficie plantar del pie con betadine. Deja que esta capa se seque por completo.
3. Una vez que la capa de betadine esté seca, use un pincel separado para aplicar una capa de 10% de almidón en aceite de ricino.
4. Administrar 0,25 μL/g de peso corporal de pilocarpina al 1% por vía subcutánea con una jeringa en la piel suelta sobre el cuello. Inicie un temporizador inmediatamente después de la administración de pilocarpina.
5. A los 8 min después de la inyección, tome fotos de la superficie plantar del pie.
6. Usando Fiji, cuente el número de manchas oscuras ubicadas en las seis (6) almohadillas de los pies (Figura 2A).

6. Inmunohistoquímica

NOTA: Para evaluar la degeneración de los axones simpáticos en los nervios periféricos después de la simpatectomía lumbar, se extrajeron los nervios ciáticos bilaterales en el día 21 del postoperatorio.

1. Anestesiar a los ratones (siguiendo el paso 1 del protocolo), extraer los nervios ciáticos bilaterales y luego sacrificar al animal de inmediato (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
2. Coloque los nervios ciáticos directamente en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M durante 20 min, luego transfiéralos a sacarosa al 20% en PBS 0,1 M para crioprotección nocturna a 4 °C.
3. Seccione los nervios ciáticos longitudinalmente con un criostato a 20 μm y coloque las secciones en portaobjetos cargados.
4. Bloquee las secciones nerviosas con suero de cabra normal (NGS) al 10% en solución salina tamponada tris con Tween 20 al 1% (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Retire el tampón de bloqueo y reemplácelo con los anticuerpos primarios anti-tirosina hidroxilasa de conejo y anti-neurofilamentos de pollo diluidos en el tampón de bloqueo (10% NGS en TBST) a 1:750 y 1:1000, respectivamente. Deje que los anticuerpos primarios se incuben durante la noche en una cámara de humedad a temperatura ambiente.
6. Lavar con TBST 3 veces, 10 min cada lavado, antes de aplicar los anticuerpos secundarios goatat anti-rabbit 647 y goatat anti-chicken 488, ambos diluidos a 1:200 en el tampón de bloqueo. Deje que los anticuerpos secundarios se incuben en una cámara de humedad durante 2 h a temperatura ambiente.
7. Lave la guía con TBST 4 veces, 10 minutos en cada lavado, y deje que la guía se seque en un área protegida por la luz antes de montarla.
8. Imagen de secciones nerviosas separadas por al menos 40 μm en un microscopio fluorescente con el objetivo 10x.
9. En Fiji, endereza las secciones nerviosas y dibuja tres líneas verticales colocadas al azar que abarquen el ancho de la sección. Cuenta el número de axones que cruzan cada línea vertical y divídelo por el ancho de la sección en la línea vertical. Repita para cada una de las tres líneas verticales por sección. Promedie los tres valores obtenidos por sección y promedie aún más los valores de las tres secciones por nervio.

Resultados

Este protocolo describe la extirpación quirúrgica de las neuronas simpáticas lumbares postganglionares de un ratón. Dos ratones recibieron simpatectomías lumbares y dos ratones sirvieron como controles. Para lograr una simpatectomía lumbar quirúrgica exitosa, se debe lograr una visualización adecuada de al menos los ganglios simpáticos lumbares bilaterales L2 y L3, como se observa en la Figura 1. La extirpación de los ganglios L4 y L5 lograría una denervación simpática completa ...

Discusión

Los ganglios simpáticos lumbares son estructuras muy pequeñas ubicadas detrás de muchos órganos abdominales críticos y vasos grandes. Por lo tanto, este procedimiento requiere una precisión y exactitud significativas. Gran parte de la dificultad radica en la identificación intraoperatoria de los ganglios simpáticos. Se sugiere que el alumno primero sea capaz de identificar los ganglios en un cadáver de ratón antes de intentar este procedimiento en un ratón vivo. A menudo será necesario solucionar problemas al...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914