マウスの外科的腰椎交感神経切除術

要約

この原稿は、マウスから節後腰椎交感神経ニューロンを外科的に除去するためのプロトコルを示しています。この手順は、遠位組織標的における交感神経支配の役割を調査することを目的とした多数の研究を促進します。

要約

末梢神経損傷は一般的であり、損傷後の完全な機能回復は患者のわずか10%で達成されます。交感神経系は、身体の恒常性を維持する上で多くの重要な役割を果たしていますが、末梢神経損傷の文脈で研究されることはほとんどありませんでした。末梢の遠位標的における節後交感神経神経機能の程度は、現在のところ不明です。末梢標的の交感神経支配の役割をよりよく探求するために、外科的「ノックアウト」モデルは代替アプローチを提供します。これは化学的に達成できますが、節後交感神経ニューロンの化学的破壊は非特異的で用量依存的である可能性があります。マウスでの外科的腰椎交感神経切除術の使用は、かつては小動物では「事実上実行不可能」と考えられていましたが、後肢を神経支配する節後交感神経ニューロンの特異的な標的化を可能にします。この原稿では、生存手術としてマウスからL2-L5腰椎交感神経節を外科的に切除する方法について説明しており、これにより後足の汗反応と坐骨神経の交感神経軸索の数が確実に減少します。

概要

末梢神経損傷 (PNI) は、遠位組織ターゲットの運動障害、感覚障害、および交感神経障害を引き起こす可能性があり、完全に機能を回復することはめったにありません¹。PNIの研究は、多くの場合、運動および感覚の再生に焦点を当ててきました。しかし、ラットの坐骨神経のほぼ4分の1は、無髄交感神経軸索で構成されています²。それにもかかわらず、末梢組織における交感神経支配の役割は完全には理解されていません³。交感神経系は、免疫調節、体温調節、血管緊張、ミトコンドリア生合成などに関与し、身体の恒常性を維持する上で主要な役割を果たしています4,5,6,7,8,9,10,11 .神経筋接合部での交感神経支配が失われると、運動ニューロン神経支配が維持されているにもかかわらず、持続的な筋力低下とシナプス不安定性が観察される¹²。神経筋接合部におけるシナプス伝達のこの交感神経制御は、加齢とともに減少することが示されており^13,14、これは、筋肉量、力、およびパワーの加齢依存的な減少として定義されるサルコペニアに寄与する¹⁵。末梢組織の交感神経支配の役割をよりよく理解することは、PNIやその他の形態の交感神経機能障害患者の機能転帰を最適化する治療法の開発に必要です。

交感神経切除術は、遠位標的組織における交感神経支配の役割の調査を可能にする強力な実験ツールです。具体的には、L2-L5レベルの交感神経節を切除すると、下肢への交感神経支配の大部分が除去され、坐骨神経に関心のある研究者にとって特に有用です。

このプロトコルは、生存手術としてマウスからのL2-L5レベルの節後交感神経ニューロンの除去を詳述しています。この手順には、げっ歯類の顕微手術のスキルとマウスの解剖学への精通が必要であり、効果的に実施された場合、目に見える表現型の違いは引き起こされません。外科的腰椎交感神経切除術はげっ歯類の研究で使用されており、マウスよりもラットで使用されています16,17,18,19,20,21;しかし、そのプロトコルを記述した詳細なプロトコルは、現在存在しません。腰椎交感神経切除術を利用した以前の研究では、主に交感神経支配の役割に焦点を当てていました 痛みの反応、これは一般に、さまざまな神経損傷モデルで交感神経切除術によって弱められます。マウスでこの技術を使用した研究は少ない^{が、これは}おそらく解剖学的ランドマークのサイズが小さいためであり、外科的交感神経切除術の使用は小動物では「事実上実行不可能」であると考えられていた^23,24。微小交感神経切除術の形での限局性交感神経切除術は、げっ歯類モデルでも利用されており、これも主に疼痛行動の文脈で行われています25,26,27。微小交感神経切除術は、腰部交感神経全摘出術とは対照的に、特定の脊髄神経への灰色の枝の一部を切断して除去する背側アプローチを利用し、より広範な副作用を回避する非常に的を絞った交感神経切除術を可能にします。

マウスモデルは遺伝子操作を必要とする多くの研究にとって重要であるため、この手順は末梢神経損傷の範囲を超えて多用途に応用できます。経腹部アプローチを使用すると、腰椎交感神経節を確実に視覚化し、明らかな悪影響なしにマウスから切除できます。6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)^23,24の使用など、節後交感神経ニューロンの化学的破壊のためのプロトコルが利用可能ですが、この外科的処置は、節後腰椎交感神経節の解剖学的特異的な標的化を可能にします。外科的交感神経切除術の使用は、薬理学的方法に関連する非特異的で用量依存的な懸念も回避します^28,29。

6-OHDAの投与による化学的交感神経の使用は、小動物の外科的交感神経が好まれなかったため、アドレナリン作動性神経終末の選択的破壊を達成する簡単な方法として1967年に説明されました^23,24。6-OHDAは、パーキンソン病患者に内因的に形成されるカテコールアミン作動性神経毒であり、その毒性は、フリーラジカルを形成し、ミトコンドリアの電子伝達鎖を阻害する能力に由来する^30,31。ノルエピネフリンの取り込み-1輸送メカニズムを通じて、6-OHDAは節後交感神経細胞²⁸などのノルアドレナリン作動性ニューロン内に蓄積することができる。最終的に、ニューロンは6-OHDAによって破壊されます。しかし、末梢神経系の終末は再生し、アミンレベルがまだ低下している場合でも機能的活動が回復します。6-OHDAに応答するさまざまな臓器に対して異なる投与量の閾値も存在し、高用量の6-OHDAはより非特異的な効果を示すことが示されており、その神経毒性の影響を非カテコールアミン含有ニューロン、さらには非ニューロン細胞にまで拡大します。ノルアドレナリン作動性ニューロンは別として、ドーパミン作動性ニューロンも6-OHDAの影響を受けます²⁹、化学的交感神経切除術は最終的に外科的交感神経切除術よりも節後交感神経ニューロンへの特異的性が低くなります。

したがって、外科的腰椎交感神経切除術は、交感神経支配を下肢に的を絞ったアブレーションを可能にし、マウスのさまざまな実験技術や遺伝子操作と組み合わせて、交感神経系がさまざまな損傷や病状にどのように寄与しているかを研究することができます。

プロトコル

すべての実験は、エモリー大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました（IACUCプロトコル番号PROTO201700371の下で)。この研究では、14週齢、体重16〜21 gの4匹の成体雌野生型C57BL / 6Jマウスを使用しました。ここで使用する試薬や機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. 術前準備

1. 手術器具をオートクレーブします:鋭利なハサミ1組、先端の細いピンセット2本、ニードルドライバー1本。
2. 加熱パッドを37°Cに温め、手術用テーブルトップの下に置きます。
3. 麻酔導入室を含む手術部位に消毒液をスプレーし、ペーパータオルで十分に拭き取ります。
4. マウスを取り扱う前に、適切なガウンと手洗いを確認してください。
5. マウスにメロキシカムを5 mg / kg体重で供給し、マウスが薬を完全に飲み込むのに十分な時間を置いて、誘導中の誤嚥を避けます。.
6. 1 L / minの酸素中に3%イソフルランを使用してマウスを麻酔下で誘導します(施設で承認されたプロトコルに従います)。
7. マウスに麻酔をかけたら(つま先をつまんでも反応しない)、マウスを手術台、仰臥位に置き、鼻を取り付けた鼻円錐形に置きます。
8. マウスがノーズコーンに適切に装着されたら、麻酔を維持するためにイソフルランを2%に調整します。
9. マウスの目にアイジェルを貼り、乾性角結膜炎(ドライアイ)を予防します。
10. マウスがサージカルテープでサージカルテーブルトップに適切に固定されていることを確認してください。
11. 呼吸が楽になり、適切な呼吸数が得られるように、継続的に監視します。
12. マウスの腹部から性器の高さから肋骨の下まで毛皮を剃ります。
13. 毛皮を取り除いたら、まず70%エタノールで手術部位を中央から末梢に円を描くように拭きます。次に、同じ円を描くようにベタジンで手術部位を拭きます。エタノールとベタジンの両方のステップを合計3回繰り返します。
14. マウスを滅菌外科用ドレープで覆い、中央から適切なサイズの穴を開けて手術野を視覚化します。菱形の形状は、ドレープを半分に折り、高さ~10mm、底面~15mmの二等辺三角形をカットすることで作ることができます。

2. 切開

1. 鋭利なハサミと先端の細いピンセットを使用して、恥骨結合のレベルから~1mm上から肋骨の下~2mmまで正中線を切開します。
2. 両側腹直筋の間の正中筋膜(linea alba)を特定します。ピンセットを使用して、腹筋を下にある臓器から持ち上げ、alba線に沿って切断して腹腔に入ります。
   注:白筋線は、両側腹直筋を横方向に静かに引っ張って、正中線³²に沿って縦方向にある細い筋膜線を明らかにすることによって識別できます。リネアアルバを通して切開を行うことで、筋肉をより簡単に閉じることができます。
3. 腹筋と皮膚を横方向に5-0縫合糸で引っ込めて、次のステップを適切に視覚化します。

3. L2-L5腰部交感神経節の同定

1. 腰部交感神経節は、腹部大動脈と下大静脈の後方にあります。大動脈を視覚化するには、腹腔から腸を部分的に切除します。
   注:L2-L5レベルの交感神経節は、腸骨血管への大動脈分岐部のレベルから左腎動脈^21,33のレベルまで横断します。
   1. 滅菌生理食塩水で飽和した滅菌綿の正方形をドレープの上に置き、切開部の左側に上に置きます。慎重に、2つの滅菌綿先端アプリケーターを使用して、結腸と小腸を部分的に生理食塩水に浸した綿の正方形に押し出します。
      注:盲腸と虫垂が腹腔から出ていること、および下行結腸を視覚化できることを確認してください。
   2. 露出した腸を別の生理食塩水で飽和させた綿の正方形で覆います。
   3. 手術中は定期的に蠕動運動をモニターし、腸のリズミカルな動きで確認することができます。
2. 直腸と肛門に向かって移動し、目に見える糞便が含まれている可能性のある腸の部分である下行結腸を特定し、閉じたピンセットでこの構造を左にそらして、腹部大動脈と下大静脈を明らかにします。これらの2つの血管は結合組織によって結合されており、1つのユニットとして動くはずです。
   1. ピンセットで、腹部の血管を周囲の結合組織で持ち上げます。これを持ち上げながら、結合組織に5-0ナイロン縫合糸を慎重に配置します。
      注意:針で腹部血管に穴を開けないでください:これはマウスの急速な代償不全を引き起こし、おそらく死に至ります。
   2. 縫合糸が結合組織を通して挿入されたら、腹部血管を左に偏向させます。これにより、三角形の窓が得られ、両側の腰筋を直接視覚化できます。
      注:神経節が腹部血管と密接な関係にあるため、交感神経節は、通常は正中線に位置しますが、血管とともにわずかに左(マウスの右)に偏向します。腹部血管が偏向したら、三角形を視覚化し、左側の2つの辺が偏向した腹部血管で構成され、右側がマウスの正中線(両側腰筋の間)によって定義されます。交感神経節は、この三角形の中央にあります(図1A)。それらは縦に並んで移動し、半透明に見えます。それらは、マウスの正中線に潜り込み、その右腰筋に平らに横たわる小さな血管と重なることがあります。ピンセットを使用して、上にある筋膜を鈍く解剖し、神経節を明らかにします(図1B)。
3. 左腎動脈と左精巣動脈または卵巣動脈を特定します。
   注:これらは四角形を形成する大きな血管であり、その側面は左腎動脈が上、動物の正中線と腹部大動脈/下大静脈が横方向、左精巣または卵巣動脈が下で構成されています。L2レベルの神経節は大きく、この四角形内にあります(図1A)。ピンセットでこの四角形に入り、両側のL2神経節を特定するために、慎重に鈍い解剖を行います(図1B)。
4. 神経節の下部と上部が特定されたら、見える両側神経節の下面をピンセットでつかみ、上に引っ張ります。L4やL5など、より劣った位置にある神経節の視覚化は、視界を遮る器官を2組目のピンセットで下方に優しく押すことで向上させることができます。
   注: ステップ 3.2.2 で説明した正中線穿孔血管を視覚化すると、より完全な腰椎交感神経切除術が保証されます。もう一方の手で2組目のピンセットを持ち、腹部の神経節を保持している筋膜とニューロンの接続を引き離すと同時に、最初のピンセットで神経節自体を引き上げます。片方のピンセットだけが神経節をつかみ、もう片方のピンセットは筋膜とニューロンの接続をクリアします。左精巣または卵巣動脈のレベルに達すると、L2神経節は下部鎖に引っ張られると動くため、下部鎖神経節がまだ無傷である場合、L2の識別に役立つ場合があります。L3-5神経節は、ピンセットで四角形からL2神経節を抽出する前に、精巣動脈または卵巣動脈で骨折することができます。四角形内に存在する唯一の神経節はL2神経節です。
5. この手順では、失血を最小限に抑える必要があります。出血が発生した場合は、閉鎖前に十分な止血を確認してください。.

4.スキンクロージャー

1. 適切な止血が達成されたら、腹部血管を所定の位置に保持している縫合糸を抜去します。
2. 2つの滅菌綿先端アプリケーターを使用して、迂回した腸を慎重に腹腔に入れます。
3. 5-0吸収性縫合糸を使用して、腹筋に近似するようにランニングステッチを行います。
4. 5-0ナイロン縫合糸では、単純な断続縫合を使用して皮膚を閉じます。
5. 切開部位にネオスポリンなどの抗生物質軟膏をたっぷりと塗ります。
6. マウスを加熱パッドの上の清潔なケージに入れます。
7. マウスが目を覚まし、歩行できるようになるまで、15分ごとにマウスを観察します。通常、これには 30 分もかかりません。

5. ピロカルピン汗アッセイ

注: 腰椎交感神経切除術後の交感神経機能活動の枯渇を評価するために、腰椎交感神経切除術の 7 日後にピロカルピン汗アッセイを利用しました。

1. 0.9% NaCl に 1% ピロカルピン塩酸塩溶液を調製し、ヒマシ油に 10% 馬鈴薯デンプンを混合します。
2. 絵筆を使用して、足の足底表面をベタジンで覆います。この層を完全に乾かします。
3. ベタジン層が乾いたら、別の絵筆を使用して、ひまし油に10%でんぷんの層を塗ります。
4. 0.25 μL/g体重の1%ピロカルピンを注射器を使用して皮下投与し、首の上の緩い皮膚に投与します。ピロカルピン投与の直後にタイマーを開始します。.
5. 注入後8分で、足の足底表面の写真を撮ります。
6. フィジーを使用して、6つのフットパッドすべてにあるダークスポットの数を数えます(図2A)。

6. 免疫組織化学

注: 腰椎交感神経切除術後の末梢神経の交感神経軸索の変性を評価するために、両側坐骨神経を術後 21 日目に採取しました。

1. マウスに麻酔をかけ (プロトコルのステップ 1 に従った)、両側の坐骨神経を採取し、次に動物を速やかに安楽死させます (施設に承認されたプロトコルに従います)。
2. 坐骨神経を0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒドに直接20分間入れ、次に0.1 M PBSの20%スクロースに移して、4°Cで一晩凍結保護します。
3. 20 μmのクライオスタットを使用して坐骨神経を縦方向に切片化し、荷電したスライド上に切片を配置します。
4. 室温で1時間、1%Tween 20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水中の10%正常ヤギ血清(NGS)で神経切片をブロックします。
5. ブロッキングバッファーを取り外し、ブロッキングバッファー(TBST中の10%NGS)でそれぞれ1:750および1:1000に希釈した一次抗体ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼおよび抗ニューロフィラメントヘビーニワトリと交換します。一次抗体を室温の湿度チャンバーで一晩インキュベートします。
6. スライドをTBSTで3回、各洗浄10分で洗浄した後、ブロッキングバッファーで1:200に希釈した二次抗体ヤギ抗ウサギ647およびヤギ抗ニワトリ488を塗布する。二次抗体を湿度チャンバー内で室温で2時間インキュベートします。
7. スライドをTBSTで4回、各洗浄で10分間洗浄し、取り付ける前に明るい場所でスライドを乾かします。
8. 10倍対物レンズの蛍光顕微鏡で、少なくとも40μm離れた神経切片を画像化します。
9. フィジーでは、神経セクションをまっすぐにし、セクションの幅にランダムに配置された3本の垂直線を引きます。各垂直線を横切る軸索の数を数え、それを垂直線のセクションの幅で割ります。セクションごとに 3 本の垂直線のそれぞれについて繰り返します。セクションごとに得られた3つの値を平均し、さらに神経ごとに3つのセクションの値を平均します。

結果

このプロトコルは、マウスからの節後腰椎交感神経ニューロンの外科的除去を説明しています。2匹のマウスが腰椎交感神経切除術を受け、2匹のマウスが対照群として機能しました。外科的腰椎交感神経切除術を成功させるには、 図 1 に示すように、少なくとも L2 および L3 両側腰椎交感神経節の適切な視覚化を達成する必要があります。L4神経節とL5神経節の除去は、?...

ディスカッション

腰椎交感神経節は、多くの重要な腹部臓器や大きな血管の後ろにある非常に小さな構造です。したがって、この手順にはかなりの精度と精度が必要です。困難の多くは、術中に交感神経節を特定することにあります。学習者は、生きたマウスでこの手順を試みる前に、まずマウスの死体で神経節を特定できることをお勧めします。トラブルシューティングは、腸の迂回後に交感神経節を特定?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914