Simpatectomia Lombar Cirúrgica em Camundongos

Resumo

Este manuscrito apresenta um protocolo para remoção cirúrgica dos neurônios simpáticos lombares pós-ganglionares de um camundongo. Este procedimento facilitará uma infinidade de estudos destinados a investigar o papel da inervação simpática em alvos de tecido distais.

Resumo

Lesões de nervos periféricos são comuns, e a recuperação funcional completa após a lesão é alcançada em apenas 10% dos pacientes. O sistema nervoso simpático desempenha muitos papéis críticos na manutenção da homeostase corporal, mas raramente foi estudado no contexto de lesão de nervos periféricos. A extensão das funções neuronais simpáticas pós-ganglionares em alvos distais na periferia não está clara atualmente. Para explorar melhor o papel da inervação simpática de alvos periféricos, um modelo cirúrgico de "nocaute" fornece uma abordagem alternativa. Embora isso possa ser alcançado quimicamente, a destruição química dos neurônios simpáticos pós-ganglionares pode ser inespecífica e dependente da dose. O uso de uma simpatectomia lombar cirúrgica em camundongos, antes considerada "virtualmente impraticável" em pequenos animais, permite o direcionamento específico de neurônios simpáticos pós-ganglionares que inervam os membros posteriores. Este manuscrito descreve como remover cirurgicamente os gânglios simpáticos lombares L2-L5 de um camundongo como uma cirurgia de sobrevivência, o que diminui de forma confiável a resposta ao suor da pata traseira e o número de axônios simpáticos no nervo ciático.

Introdução

Lesões de nervos periféricos (PNIs) podem levar a déficits motores, sensoriais e simpáticos em alvos de tecido distal que raramente se recuperam totalmente funcionalmente¹. A pesquisa do PNI muitas vezes se concentrou na regeneração motora e sensorial; no entanto, quase um quarto do nervo ciático de rato consiste em^axônios simpáticos 2 não mielinizados. O papel da inervação simpática nos tecidos periféricos, no entanto, não é totalmente compreendido³. O sistema nervoso simpático desempenha um papel importante na manutenção da homeostase corporal, participando da regulação imunológica, termorregulação, tônus vascular, biogênese mitocondrial e muito mais 4,5,6,7,8,9,10,11 . Quando a inervação simpática na junção neuromuscular é perdida, observa-se fraqueza muscular persistente e instabilidade sináptica, apesar da manutenção da inervação do motoneurônio¹². Essa regulação simpática da transmissão sináptica na junção neuromuscular demonstrou diminuir com o envelhecimento^13,14, o que contribui para a sarcopenia, definida como a redução dependente da idade na massa muscular, força e potência¹⁵. Uma melhor compreensão do papel da inervação simpática dos tecidos periféricos é necessária para o desenvolvimento de terapias que otimizem os resultados funcionais para pacientes com PNIs e outras formas de disfunção simpática.

A simpatectomia é uma poderosa ferramenta experimental que permitirá investigações do papel da inervação simpática nos tecidos-alvo distais. Especificamente, a remoção dos gânglios simpáticos de nível L2-L5 remove a maior parte da inervação simpática para os membros inferiores, o que é especialmente útil para investigadores interessados no nervo ciático.

Este protocolo detalha a remoção de neurônios simpáticos pós-ganglionares de nível L2-L5 de um camundongo como uma cirurgia de sobrevivência. Este procedimento requer habilidades microcirúrgicas de roedores e familiaridade com a anatomia do camundongo e, quando realizado de forma eficaz, não causa diferenças fenotípicas visíveis. A simpatectomia lombar cirúrgica tem sido usada em pesquisas com roedores, mais em ratos do que em camundongos 16,17,18,19,20,21; no entanto, um protocolo detalhado descrevendo o protocolo não existe atualmente. Estudos anteriores utilizando a simpatectomia lombar se concentraram principalmente no papel da inervação simpática na resposta à dor, que geralmente é atenuada pela simpatectomia em vários modelos de lesão nervosa. Poucos estudos usaram essa técnica em camundongos²², provavelmente devido ao menor tamanho dos pontos anatômicos, pois o uso de simpatectomia cirúrgica foi considerado "virtualmente impraticável" em pequenos animais^23,24. Simpatectomias localizadas na forma de microssimpatectomias também têm sido utilizadas em modelos de roedores, também principalmente no contexto de comportamentos de dor 25,26,27. A microssimpatectomia, em contraste com a simpatectomia lombar total, utiliza uma abordagem dorsal através da qual um segmento do ramo cinzento para um nervo espinhal específico é desconectado e removido, permitindo uma simpatectomia muito direcionada que evitará efeitos colaterais mais amplos.

Como os modelos de camundongos são críticos para muitos estudos que requerem manipulação genética, esse procedimento também terá aplicações versáteis além da amplitude das lesões de nervos periféricos. Usando uma abordagem transabdominal, os gânglios simpáticos lombares podem ser visualizados e ressecados de forma confiável do camundongo sem efeitos adversos aparentes. Embora existam protocolos para a destruição química dos neurônios simpáticos pós-ganglionares, como o uso de 6-hidroxidopamina (6-OHDA)^23,24, esse procedimento cirúrgico permite o direcionamento anatomicamente específico dos gânglios simpáticos lombares pós-ganglionares. O uso de uma simpatectomia cirúrgica também evita as preocupações inespecíficas e dose-dependentes relacionadas aos métodos farmacológicos^28,29.

O uso de simpatectomias químicas via administração de 6-OHDA foi descrito em 1967 como uma forma simples de alcançar a destruição seletiva das terminações nervosas adrenérgicas, uma vez que as simpatectomias cirúrgicas em pequenos animais não eram favorecidas^23,24. A 6-OHDA é uma neurotoxina catecolaminérgica formada endogenamente em pacientes com doença de Parkinson, e sua toxicidade é derivada de sua capacidade de formar radicais livres e inibir a cadeia de transporte de elétrons nas mitocôndrias^30,31. Por meio de mecanismos de transporte de captação de norepinefrina-1, o 6-OHDA é capaz de se acumular dentro dos neurônios noradrenérgicos, como os neurônios simpáticos pós-ganglionares²⁸. Eventualmente, o neurônio é destruído pelo 6-OHDA; no entanto, os terminais do sistema nervoso periférico se regeneram, com a restauração da atividade funcional mesmo quando os níveis de amina ainda estão reduzidos. Diferentes limiares de dosagem também estão presentes para diferentes órgãos em resposta ao 6-OHDA, e doses mais altas de 6-OHDA demonstraram exibir efeitos mais inespecíficos, estendendo suas consequências neurotóxicas a neurônios não contendo catecolaminas e até mesmo células não neuronais. Além dos neurônios noradrenérgicos, os neurônios dopaminérgicos também são afetados pelo 6-OHDA²⁹, tornando a simpatectomia química menos específica para os neurônios simpáticos pós-ganglionares do que a simpatectomia cirúrgica.

Portanto, uma simpatectomia lombar cirúrgica permite a ablação direcionada da inervação simpática para os membros inferiores, que pode ser combinada com uma variedade de técnicas experimentais e manipulações genéticas no camundongo para estudar como o sistema nervoso simpático contribui para vários estados de lesão e doença.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Emory (sob o número de protocolo IACUC PROTO201700371). Quatro camundongos C57BL/6J fêmeas adultas do tipo selvagem, com 14 semanas de idade e pesando entre 16-21 g, foram utilizados neste estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados aqui estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação pré-cirúrgica

1. Autoclave as ferramentas cirúrgicas: 1 tesoura afiada, 2 pinças de ponta fina, 1 chave de agulha.
2. Aqueça uma almofada de aquecimento a 37 °C e coloque-a sob a mesa cirúrgica.
3. Pulverize a área cirúrgica, incluindo a câmara de indução anestésica, com desinfetante e limpe-a bem com toalhas de papel.
4. Garanta a vestimenta adequada e a lavagem das mãos antes de manusear o mouse.
5. Alimente o ratinho com meloxicam a 5 mg/kg de peso corporal e dê tempo suficiente ao ratinho para engolir completamente o medicamento para evitar aspiração durante a indução.
6. Induza o camundongo sob anestesia com isoflurano a 3% em 1 L/min de oxigênio (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
7. Uma vez que o mouse esteja anestesiado (sem reação ao beliscão do dedo do pé), coloque-o na mesa cirúrgica, em decúbito dorsal, com o nariz em um cone de nariz ajustado.
8. Uma vez que o mouse esteja devidamente encaixado no cone do nariz, ajuste o isoflurano a 2% para manutenção da anestesia.
9. Coloque gel para os olhos nos olhos do camundongo para evitar ceratoconjuntivite seca (olho seco).
10. Certifique-se de que o mouse esteja devidamente preso com fita cirúrgica à mesa cirúrgica.
11. Monitore continuamente a facilidade de respiração e a frequência respiratória adequada.
12. Raspe o pelo do abdômen do rato do nível dos órgãos genitais até abaixo das costelas.
13. Uma vez removido o pelo, limpe primeiro a área cirúrgica em movimentos circulares, do centro para o periférico, com etanol a 70%. Em seguida, limpe a área cirúrgica com betadina nos mesmos movimentos circulares. Repita as etapas de etanol e betadina um total de 3 vezes.
14. Cubra o mouse com uma cortina cirúrgica estéril com um orifício de tamanho apropriado cortado no meio para visualizar o campo cirúrgico. A forma romboide pode ser feita dobrando a cortina ao meio e cortando um triângulo isósceles com uma altura de ~10 mm e uma base de ~15 mm.

2. Incisões

1. Usando uma tesoura afiada e uma pinça de ponta fina, crie uma incisão na linha média de ~ 1 mm acima do nível da sínfise púbica a ~ 2 mm abaixo das costelas.
2. Identifique a fáscia da linha média (linha alba) entre os músculos retos abdominais bilaterais. Usando a pinça, levante os músculos abdominais dos órgãos subjacentes e corte ao longo da linha alba para entrar na cavidade abdominal.
   NOTA: A linha alba pode ser identificada puxando suavemente os músculos retos abdominais bilaterais lateralmente para revelar uma linha de fáscia mais fina que se encontra longitudinalmente ao longo da linha média³². Fazer a incisão através da linha alba permite que o músculo seja fechado com mais facilidade.
3. Retraia os músculos abdominais e a pele com suturas 5-0 lateralmente para visualizar os próximos passos corretamente.

3. Identificação dos gânglios simpáticos lombares L2-L5

1. Os gânglios simpáticos lombares ficam posteriores à aorta abdominal e à veia cava inferior. Para visualizar a aorta, remova parcialmente os intestinos da cavidade abdominal.
   NOTA: Os gânglios simpáticos de nível L2-L5 atravessam do nível da bifurcação aórtica para os vasos ilíacos até o nível da artéria renal esquerda ^21,33.
   1. Coloque um quadrado de algodão estéril saturado em solução salina estéril sobre o campo, deitado superiormente e à esquerda da incisão. Cuidadosamente, com 2 aplicadores estéreis com ponta de algodão, empurre o cólon e o intestino delgado parcialmente para fora no quadrado de algodão embebido em solução salina.
      NOTA: Certifique-se de que o ceco e o apêndice estejam fora da cavidade abdominal e que o cólon descendente possa ser visualizado.
   2. Cubra os intestinos expostos com outro quadrado de algodão saturado de solução salina.
   3. Monitore periodicamente o peristaltismo durante toda a cirurgia, que pode ser identificado pelo movimento rítmico dos intestinos.
2. Identifique o cólon descendente, que é a porção do intestino que está viajando em direção ao reto e ao ânus e pode conter matéria fecal visível, e desvie essa estrutura para a esquerda com uma pinça fechada para revelar a aorta abdominal e a veia cava inferior. Esses dois vasos estão ligados por tecido conjuntivo e devem se mover como uma unidade.
   1. Com uma pinça, levante os vasos abdominais pelo tecido conjuntivo circundante. Enquanto isso é levantado, coloque cuidadosamente uma sutura de náilon 5-0 através do tecido conjuntivo.
      CUIDADO: NÃO perfure os vasos abdominais com a agulha: Isso levará à rápida descompensação do camundongo e à provável morte.
   2. Uma vez que a sutura tenha sido inserida através do tecido conjuntivo, desvie os vasos abdominais para a esquerda. Isso dará uma janela triangular, permitindo a visualização direta dos músculos psoas bilaterais.
      NOTA: Devido às conexões íntimas que os gânglios têm com os vasos abdominais, os gânglios simpáticos, embora normalmente localizados na linha média, serão desviados ligeiramente para a esquerda (direita do mouse) junto com os vasos. Uma vez que os vasos abdominais são desviados, deve-se visualizar um triângulo, com os dois lados à esquerda consistindo nos vasos abdominais desviados e o lado direito definido pela linha média do camundongo (entre os músculos psoas bilaterais). Os gânglios simpáticos estão no meio desse triângulo (Figura 1A). Eles viajam verticalmente lado a lado e parecem translúcidos. Eles podem se sobrepor a um pequeno vaso que mergulha na linha média do camundongo e fica plano no músculo psoas direito. Use uma pinça para dissecar sem rodeios qualquer fáscia sobreposta para revelar os gânglios (Figura 1B).
3. Identifique a artéria renal esquerda e a artéria testicular ou ovariana esquerda.
   NOTA: Estes são grandes vasos que formarão um quadrilátero, cujos lados consistem na artéria renal esquerda superiormente, a linha média do animal e a aorta abdominal / veia cava inferior lateralmente e a artéria testicular ou ovariana esquerda inferiormente. Os gânglios de nível L2 são grandes e estão dentro deste quadrilátero (Figura 1A). Disseque cuidadosamente sem corte para entrar neste quadrilátero com uma pinça e identificar os gânglios L2 bilaterais (Figura 1B).
4. Uma vez identificadas as partes inferior e superior dos gânglios, agarre o aspecto inferior dos gânglios bilaterais visíveis com uma pinça e puxe para cima. A visualização de gânglios localizados mais inferiormente, como L4 e L5, pode ser aumentada empurrando suavemente quaisquer órgãos que obstruam a visão inferiormente com o segundo par de pinças.
   NOTA: A visualização do vaso perfurante da linha média mencionada na etapa 3.2.2 garantirá uma simpatectomia lombar mais completa. Segurando um segundo par de pinças na outra mão, puxe a fáscia e as conexões neuronais que seguram os gânglios do abdômen e, ao mesmo tempo, puxe os próprios gânglios com o primeiro par de pinças. Apenas um par de pinças deve segurar os gânglios, enquanto o outro limpa a fáscia e as conexões neuronais. Uma vez no nível da artéria testicular ou ovariana esquerda, pode ser útil para a identificação de L2 se os gânglios da cadeia inferior ainda estiverem intactos, pois os gânglios de L2 se moverão quando puxados pela cadeia inferior. Os gânglios L3-5 podem ser quebrados na artéria testicular ou ovariana antes de extrair os gânglios L2 do quadrilátero com uma pinça. Os únicos gânglios presentes no quadrilátero são os gânglios L2.
5. Este procedimento deve ter perda mínima de sangue. Se ocorrer sangramento, certifique-se de hemostasia adequada antes do fechamento.

4. Fechamento da pele

1. Depois que a hemostasia adequada for alcançada, remova a sutura que mantém os vasos abdominais no lugar.
2. Usando 2 aplicadores estéreis com ponta de algodão, substitua cuidadosamente os intestinos desviados para a cavidade abdominal.
3. Com uma sutura absorvível 5-0, faça um ponto corrido para aproximar os músculos abdominais.
4. Com sutura de nylon 5-0, use pontos simples interrompidos para fechar a pele.
5. Aplique uma camada generosa de pomada antibiótica, como Neosporin, no local da incisão.
6. Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento.
7. Observe o mouse a cada 15 minutos até que ele esteja acordado e deambulando. Isso geralmente leva menos de 30 minutos.

5. Ensaio de suor de pilocarpina

NOTA: Para avaliar a depleção da atividade funcional simpática após uma simpatectomia lombar, um ensaio de suor de pilocarpina foi utilizado 7 dias após a simpatectomia lombar.

1. Prepare uma solução de cloridrato de pilocarpina a 1% em NaCl a 0,9% junto com uma mistura de amido de batata a 10% em óleo de rícino.
2. Usando um pincel, cubra a superfície plantar do pé com betadine. Deixe esta camada secar completamente.
3. Quando a camada de betadine estiver seca, use um pincel separado para aplicar uma camada de amido a 10% no óleo de rícino.
4. Administre 0,25 μL / g de peso corporal de pilocarpina a 1% por via subcutânea usando uma seringa na pele solta sobre o pescoço. Inicie um cronômetro imediatamente após a administração de pilocarpina.
5. Aos 8 minutos após a injeção, tire fotos da superfície plantar do pé.
6. Usando Fiji, conte o número de manchas escuras localizadas em todas as seis (6) almofadas dos pés (Figura 2A).

6. Imuno-histoquímica

NOTA: Para avaliar a degeneração dos axônios simpáticos nos nervos periféricos pós-simpatectomia lombar, os nervos ciáticos bilaterais foram retirados no 21º dia de pós-operatório.

1. Anestesiar os camundongos (seguindo a etapa 1 do protocolo), colher os nervos ciáticos bilaterais e, em seguida, sacrificar imediatamente o animal (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente).
2. Coloque os nervos ciáticos diretamente em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,01 M por 20 min e, em seguida, transfira-os para sacarose a 20% em PBS 0,1 M para crioproteção noturna a 4 ° C.
3. Corte os nervos ciáticos longitudinalmente usando um criostato a 20 μm e coloque as seções em lâminas carregadas.
4. Bloqueie as seções nervosas com 10% de soro de cabra normal (NGS) em solução salina tamponada com tris com 1% de Tween 20 (TBST) por 1 h em temperatura ambiente.
5. Remova o tampão de bloqueio e substitua-o pelos anticorpos primários antitirosina hidroxilase de coelho e antineurofilamento pesado de frango diluídos no tampão de bloqueio (10% NGS em TBST) a 1:750 e 1:1000, respectivamente. Deixe os anticorpos primários incubarem durante a noite em uma câmara de umidade à temperatura ambiente.
6. Lavar a lâmina com TBST 3 vezes, 10 min cada lavagem, antes de aplicar os anticorpos secundários anti-coelho 647 e anti-frango 488 caprino, ambos diluídos a 1:200 no tampão de bloqueio. Deixar incubar os anticorpos secundários numa câmara de humidade durante 2 h à temperatura ambiente.
7. Lave a lâmina com TBST 4 vezes, 10 min a cada lavagem, e deixe a lâmina secar em uma área protegida da luz antes da montagem.
8. Seções nervosas de imagem com pelo menos 40 μm de distância em um microscópio fluorescente na objetiva de 10x.
9. Em Fiji, endireite as seções nervosas e desenhe três linhas verticais colocadas aleatoriamente abrangendo a largura da seção. Conte o número de axônios que cruzam cada linha vertical e divida-o pela largura da seção na linha vertical. Repita para cada uma das três linhas verticais por seção. Calcule a média dos três valores obtidos por seção e calcule a média dos valores das três seções por nervo.

Resultados

Este protocolo descreve a remoção cirúrgica de neurônios simpáticos lombares pós-ganglionares de um camundongo. Dois camundongos receberam simpatectomias lombares e dois camundongos serviram como controles. Para obter uma simpatectomia lombar cirúrgica bem-sucedida, deve-se obter a visualização adequada de pelo menos os gânglios simpáticos lombares bilaterais L2 e L3, como visto na Figura 1. A remoção dos gânglios L4 e L5 alcançaria a desnervação simpática completa da parte...

Discussão

Os gânglios simpáticos lombares são estruturas muito pequenas localizadas atrás de muitos órgãos abdominais críticos e grandes vasos. Portanto, este procedimento requer precisão e exatidão significativas. Grande parte da dificuldade está em identificar os gânglios simpáticos no intraoperatório. Sugere-se que o aluno primeiro seja capaz de identificar os gânglios em um cadáver de camundongo antes de tentar este procedimento em um camundongo vivo. A solução de problemas geralmente precisará ocorrer ao ide...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914