Хирургическая поясничная симпатэктомия у мышей

Резюме

В данной рукописи представлен протокол хирургического удаления постганглионарных поясничных симпатических нейронов у мыши. Эта процедура будет способствовать проведению множества исследований, направленных на изучение роли симпатической иннервации в дистальных тканевых мишенях.

Аннотация

Повреждения периферических нервов встречаются часто, а полное функциональное восстановление после травмы достигается только у 10% пациентов. Симпатическая нервная система играет много важных ролей в поддержании гомеостаза организма, но она редко изучается в контексте повреждения периферических нервов. Степень постганглионарных симпатических нейронных функций в дистальных мишенях на периферии в настоящее время неясна. Чтобы лучше изучить роль симпатической иннервации периферических мишеней, хирургическая модель «нокаута» предлагает альтернативный подход. Хотя это может быть достигнуто химическим путем, химическая деструкция постганглионарных симпатических нейронов может быть неспецифической и дозозависимой. Использование хирургической поясничной симпатэктомии у мышей, которое когда-то считалось «практически непрактичным» у мелких животных, позволяет целенаправленно воздействовать на постганглионарные симпатические нейроны, которые иннервируют задние конечности. В данной рукописи описывается, как хирургическое удаление поясничных симпатических ганглиев L2-L5 у мыши в качестве операции по выживанию, которая надежно снижает потовую реакцию задней лапы и количество симпатических аксонов в седалищном нерве.

Введение

Повреждения периферических нервов (ПНИ) могут приводить к двигательному, сенсорному и симпатическому дефициту в дистальных тканевых мишенях, которые редко полностью функционально восстанавливаются¹. Исследования PNI часто сосредоточены на моторной и сенсорной регенерации; Тем не менее, почти четверть седалищного нерва крысы состоит из немиелинизированных симпатических^{аксонов2}. Роль симпатической иннервации в периферических тканях, тем не менее, до конца не изучена³. Симпатическая нервная система играет важную роль в поддержании гомеостаза организма, участвуя в иммунной регуляции, терморегуляции, тонусе сосудов, митохондриальном биогенезе и т.д^{. 4,5,6,7,8,9,10,11}. При утрате симпатической иннервации в нервно-мышечном соединении наблюдается стойкая мышечная слабость и синаптическая нестабильность, несмотря на поддержание иннервации мотонейрона¹². Было показано, что эта симпатическая регуляция синаптической передачи в нервно-мышечном соединении снижается с возрастом^13,14, что способствует саркопении, определяемой как возрастное снижение мышечной массы, силы и мощности¹⁵. Лучшее понимание роли симпатической иннервации периферических тканей необходимо для разработки методов лечения, которые оптимизируют функциональные результаты у пациентов с ПНИ и другими формами симпатической дисфункции.

Симпатэктомия является мощным экспериментальным инструментом, который позволит исследовать роль симпатической иннервации в дистальных тканях-мишенях. В частности, удаление симпатических ганглиев уровня L2-L5 удаляет большую часть симпатической иннервации нижних конечностей, что особенно полезно для исследователей, интересующихся седалищным нервом.

В этом протоколе подробно описывается удаление постганглионарных симпатических нейронов уровня L2-L5 у мыши в качестве операции по выживанию. Эта процедура требует от грызунов микрохирургических навыков и знакомства с анатомией мыши, и при эффективном выполнении не вызывает каких-либо видимых фенотипических различий. Хирургическая поясничная симпатэктомия использовалась в исследованиях на грызунах, в большей степени на крысах, чем на мышах 16,17,18,19,20,21; Однако подробного протокола, описывающего этот протокол, в настоящее время не существует. Предыдущие исследования с использованием поясничной симпатэктомии в первую очередь были сосредоточены на роли симпатической иннервации в болевой реакции, которая, как правило, ослабляется симпатэктомией в различных моделях повреждения нервов. В меньшем количестве исследований этот метод использовался на мышах²², вероятно, из-за меньшего размера анатомических ориентиров, поскольку использование хирургической симпатэктомии считалось «практически непрактичным» у мелких животных^23,24. Локализованная симпатэктомия в форме микросимпатэктомии также использовалась в моделях грызунов, также в основном в контексте болевого поведения 25,26,27. Микросимпатэктомия, в отличие от тотальной поясничной симпатэктомии, использует дорсальный доступ, посредством которого сегмент серой ветви к определенному спинномозговому нерву отсоединяется и удаляется, что позволяет проводить очень целенаправленную симпатэктомию, которая позволит избежать более широких побочных эффектов.

Поскольку мышиные модели имеют решающее значение для многих исследований, требующих генетических манипуляций, эта процедура будет иметь универсальное применение и за пределами широты повреждений периферических нервов. Используя трансабдоминальный доступ, поясничные симпатические ганглии могут быть надежно визуализированы и удалены от мыши без видимых побочных эффектов. Несмотря на то, что существуют протоколы химического разрушения постганглионарных симпатических нейронов, такие как использование 6-гидроксидопамина (6-OHDA)^23,24, эта хирургическая процедура позволяет анатомически специфично нацеливаться на постганглионарные поясничные симпатические ганглии. Использование хирургической симпатэктомии также позволяет избежать неспецифических и дозозависимых проблем, связанных с фармакологическими методами^28,29.

Использование химических симпатэктомий путем введения 6-OHDA было описано в 1967 году как простой способ достижения избирательного разрушения адренергических нервных окончаний, поскольку хирургическая симпатэктомия у мелких животных не была ^{предпочтительной.} 6-OHDA представляет собой катехоламинергический нейротоксин, который эндогенно образуется у пациентов с болезнью Паркинсона, а его токсичность обусловлена его способностью образовывать свободные радикалы и ингибировать цепь переноса электронов в митохондриях^30,31. Благодаря механизмам транспортировки норадреналина Uptake-1, 6-OHDA способен накапливаться в норадренергических нейронах, таких как постганглионарные симпатические нейроны²⁸. В конце концов, нейрон разрушается 6-OHDA; Тем не менее, терминали в периферической нервной системе регенерируют с восстановлением функциональной активности даже тогда, когда уровень аминов все еще снижен. Различные пороговые дозы также присутствуют для разных органов в ответ на 6-OHDA, и было показано, что более высокие дозы 6-OHDA проявляют более неспецифические эффекты, распространяя его нейротоксические последствия на нейроны, не содержащие катехоламин, и даже на ненейрональные клетки. Помимо норадренергических нейронов, дофаминергические нейроны также поражаются 6-OHDA²⁹, что делает химическую симпатэктомию в конечном итоге менее специфичной для постганглионарных симпатических нейронов, чем хирургическая симпатэктомия.

Таким образом, хирургическая поясничная симпатэктомия позволяет целенаправленно абляционировать симпатическую иннервацию нижних конечностей, что может быть сочетано с различными экспериментальными методами и генетическими манипуляциями на мышах для изучения того, как симпатическая нервная система способствует различным травмам и болезненным состояниям.

протокол

Все эксперименты были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори (в соответствии с протоколом IACUC No PROTO201700371). В этом исследовании были использованы четыре взрослые самки мышей дикого типа C57BL/6J в возрасте 14 недель и весом от 16 до 21 г. Подробная информация об используемых здесь реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Предоперационная подготовка

1. В автоклаве хирургические инструменты: 1 пара острых ножниц, 2 пинцета с тонким наконечником, 1 игольчатый инструмент.
2. Нагрейте грелку до 37 °C и положите ее под операционную столешницу.
3. Опрыскайте операционную зону, в том числе индукционную камеру анестезии, дезинфицирующим средством и тщательно протрите ее бумажными полотенцами.
4. Убедитесь в надлежащем халате и мытье рук перед тем, как брать мышь в руки.
5. Кормите мышь мелоксикамом в концентрации 5 мг/кг массы тела и дайте мышке достаточно времени, чтобы полностью проглотить лекарство, чтобы избежать аспирации во время индукции.
6. Индуцируйте мышь под анестезией 3% изофлураном в 1 л/мин кислорода (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
7. После того, как мышь будет обезболена (не будет реакции на защемление пальца ноги), поместите мышь на хирургическую столешницу, лежа на спине, так, чтобы нос находился в подогнанном носовом конусе.
8. После того, как мышь будет правильно установлена в носовом конусе, отрегулируйте дозу изофлурана до 2% для поддержания анестезии.
9. Нанесите гель для глаз мыши на глаза, чтобы предотвратить сухой кератоконъюнктивит (сухой глаз).
10. Убедитесь, что мышь надежно закреплена хирургической лентой на хирургической столешнице.
11. Непрерывный мониторинг для облегчения дыхания и адекватной частоты дыхания.
12. Сбрейте шерсть с брюшка мыши от уровня гениталий до ниже ребер.
13. После того, как мех будет удален, сначала протрите операционную область круговыми движениями, от центральной к периферической, 70% этанолом. Затем протрите операционную область бетадином теми же круговыми движениями. Повторите шаги с этанолом и бетадином в общей сложности 3 раза.
14. Накиньте на мышь стерильную хирургическую простыню с отверстием соответствующего размера, вырезанным посередине, чтобы визуализировать операционное поле. Ромбовидную форму можно приобрести, сложив драпировку пополам и вырезав равнобедренный треугольник высотой ~10 мм и основанием ~15 мм.

2. Разрезы

1. С помощью острых ножниц и пинцета с тонким концом сделайте разрез по средней линии от ~1 мм над уровнем лобкового симфиза до ~2 мм ниже ребер.
2. Определите срединную фасцию (linea alba) между двусторонними прямыми мышцами живота. С помощью пинцета поднимите мышцы живота в сторону от подлежащих органов и разрежьте по белой линии для входа в брюшную полость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белая линия может быть идентифицирована путем осторожного вытягивания двусторонних прямых мышц живота в сторону, чтобы обнажить более тонкую линию фасции, которая проходит в продольном направлении вдоль средней линии³². Выполнение разреза через белую линию позволяет легче закрыть мышцу.
3. Втяните мышцы живота и кожу с помощью швов 5-0 сбоку, чтобы правильно визуализировать следующие шаги.

3. Идентификация поясничных симпатических ганглиев L2-L5

1. Поясничные симпатические ганглии лежат позади брюшной аорты и нижней полой вены. Чтобы визуализировать аорту, частично удаляют кишечник из брюшной полости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Симпатические ганглии уровня L2-L5 проходят от уровня бифуркации аорты в подвздошные сосуды до уровня левой почечной артерии^21,33.
   1. Положите стерильный ватный квадрат, пропитанный стерильным физиологическим раствором, на простыню, лежа сверху и слева от разреза. Осторожно, с помощью 2 стерильных аппликаторов с ватным наконечником, частично вытолкните толстую кишку и тонкую кишку на пропитанный солевым раствором ватный квадрат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что слепая кишка и аппендикс находятся вне брюшной полости и что можно визуализировать нисходящую ободочную кишку.
   2. Накройте оголенные кишки другим ватным квадратом, пропитанным солевым раствором.
   3. Периодически контролируйте перистальтику на протяжении всей операции, которую можно определить по ритмичному движению кишечника.
2. Определите нисходящую ободочную кишку, которая представляет собой часть кишечника, которая движется к прямой кишке и анусу и может содержать видимые фекальные массы, и отклоните эту структуру влево с помощью закрытого пинцета, чтобы открыть брюшную аорту и нижнюю полую вену. Эти два сосуда связаны соединительной тканью и должны двигаться как единое целое.
   1. С помощью пинцета поднимите сосуды брюшной полости за окружающую их соединительную ткань. Пока он приподнимается, осторожно наложите нейлоновый шов 5-0 через соединительную ткань.
      ВНИМАНИЕ: НЕ прокалывайте иглой сосуды брюшной полости: это приведет к быстрой декомпенсации мыши и вероятной смерти.
   2. После того, как шов был введен через соединительную ткань, отклоните сосуды брюшной полости влево. Это даст треугольное окно, позволяющее напрямую визуализировать двусторонние поясничные мышцы.
      Примечание: Из-за тесной связи ганглиев с сосудами брюшной полости, симпатические ганглии, хотя обычно расположены по средней линии, будут немного отклоняться влево (справа от мыши) вместе с сосудами. После того, как сосуды брюшной полости отклоняются, следует визуализировать треугольник, две стороны которого слева состоят из отклоненных сосудов брюшной полости, а правая сторона определяется средней линией мыши (между двусторонними поясничными мышцами). Симпатические ганглии лежат в центре этого треугольника (рис. 1А). Они движутся вертикально бок о бок и кажутся полупрозрачными. Они могут перекрывать небольшой сосуд, который погружается в среднюю линию мыши и ложится на правую поясничную мышцу. Используйте пинцет, чтобы тупо рассечь любую вышележащую фасцию, чтобы выявить ганглии (Рисунок 1B).
3. Определите левую почечную артерию и левую тестикулярную или яичниковую артерию.
   Примечание: Это крупные сосуды, которые образуют четырехугольник, стороны которого состоят из левой почечной артерии сверху, средней линии животного и брюшной аорты/нижней полой вены латерально, и левой тестикулярной или яичниковой артерии внизу. Ганглии уровня L2 большие и лежат в пределах этого четырехугольника (рис. 1А). Тщательно затупите рассечение, чтобы войти в этот четырехугольник пинцетом и определить двусторонние ганглии L2 (рисунок 1B).
4. После того, как нижняя и верхняя части ганглиев будут определены, возьмите пинцетом нижнюю часть видимых двусторонних ганглиев и потяните вверх. Визуализацию более низко расположенных ганглиев типа L4 и L5 можно увеличить, мягко надавливая второй парой пинцета на любые органы, закрывающие обзор снизу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация перфорирующего сосуда по срединной линии, упомянутого в шаге 3.2.2, обеспечит более полную поясничную симпатэктомию. Держа вторую пару пинцетов в другой руке, оттяните фасцию и нейронные связи, удерживающие ганглии в брюшной полости, в сторону, одновременно подтягивая сами ганглии первой парой пинцетов. Только одна пара пинцетов должна удерживать ганглии, в то время как другая очищает фасцию и нейронные связи. Оказавшись на уровне левого яичка или яичниковой артерии, может быть полезно для идентификации L2, если ганглии нижней цепи все еще не повреждены, так как ганглии L2 будут двигаться при втягивании нижней цепью. Ганглии L3-5 могут быть разорваны в тестикулярной или яичниковой артерии перед извлечением ганглиев L2 из четырехугольника с помощью пинцета. Единственными ганглиями, присутствующими в четырехугольнике, являются ганглии L2.
5. Эта процедура должна иметь минимальную кровопотерю. При возникновении кровотечения обеспечьте адекватный гемостаз перед закрытием.

4. Застежка на коже

1. После того как будет достигнут адекватный гемостаз, снимают шов, удерживающий сосуды брюшной полости на месте.
2. С помощью 2 стерильных аппликаторов с ватным наконечником аккуратно замените отведенный кишечник в брюшную полость.
3. С помощью рассасывающегося шва 5-0 выполните бегущий шов, чтобы приблизить мышцы живота.
4. С помощью нейлонового шва 5-0 используйте простые прерывистые стежки, чтобы закрыть кожу.
5. Нанесите обильный слой мази с антибиотиком, например, Неоспорином, на место разреза.
6. Поместите мышь в чистую клетку на грелку.
7. Наблюдайте за мышью каждые 15 минут, пока она не придет в себя и не начнет передвигаться. Обычно это занимает менее 30 минут.

5. Пилокарпиновый анализ на пот

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки истощения симпатической функциональной активности после поясничной симпатэктомии через 7 дней после поясничной симпатэктомии был проведен анализ пилокарпинового пота.

1. Приготовьте 1% раствор пилокарпина гидрохлорида в 0,9% NaCl вместе со смесью 10% картофельного крахмала в касторовом масле.
2. С помощью кисти покройте подошвенную поверхность стопы бетадином. Дайте этому слою полностью высохнуть.
3. Как только слой бетадина высохнет, с помощью отдельной кисти нанесите слой 10% крахмала в касторовом масле.
4. Введите 0,25 мкл/г массы тела 1% пилокарпина подкожно с помощью шприца в дряблую кожу над шеей. Запустите таймер сразу после введения пилокарпина.
5. Через 8 минут после инъекции сделайте фотографии подошвенной поверхности стопы.
6. Используя Фиджи, подсчитайте количество темных пятен, расположенных на всех шести (6) подушечках ног (Рисунок 2A).

6. Иммуногистохимия

Примечание: Для оценки дегенерации симпатических аксонов в периферических нервах после поясничной симпатэктомии двусторонние седалищные нервы были собраны на 21-е сутки после операции.

1. Обезболите мышей (следуя шагу 1 протокола), извлеките двусторонние седалищные нервы, а затем немедленно усыпьте животное (в соответствии с институционально утвержденными протоколами).
2. Поместите седалищные нервы непосредственно в 4% параформальдегид в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS) на 20 минут, затем перенесите их в 20% сахарозу в 0,1 М PBS для ночной криозащиты при 4 °C.
3. Рассекайте седалищные нервы в продольном направлении с помощью криостата с температурой 20 мкм и размещайте срезы на заряженных предметных стеклах.
4. Блокируйте нервные отделы 10% нормальной козьей сывороткой (NGS) в трис-буферном физрастворе с 1% Tween 20 (TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Удалите блокирующий буфер и замените его первичными антителами кроличьей антитирозингидроксилазой и куриными антинейрофиламентами, разведенными в блокирующем буфере (10% NGS в TBST) в соотношении 1:750 и 1:1000 соответственно. Дайте первичным антителам инкубироваться в течение ночи в камере влажности при комнатной температуре.
6. Промойте предметное стекло TBST 3 раза, по 10 мин каждое мытье, прежде чем применять вторичные антитела козий анти-кролик 647 и козий анти-куриный 488, разведенные в соотношении 1:200 в блокирующем буфере. Дайте вторичным антителам инкубироваться в камере влажности в течение 2 ч при комнатной температуре.
7. Вымойте предметное стекло TBST 4 раза, по 10 минут каждое мытье, и дайте предметному стеклу высохнуть в защищенном от света месте перед установкой.
8. Получите изображение срезов нервов на расстоянии не менее 40 мкм друг от друга на флуоресцентном микроскопе с 10-кратным объективом.
9. На Фиджи выпрямите нервные участки и нарисуйте три случайно расположенные вертикальные линии, охватывающие ширину участка. Посчитайте количество аксонов, пересекающих каждую вертикальную линию, и разделите его на ширину участка по вертикальной линии. Повторите для каждой из трех вертикальных линий на секции. Усредните три значения, полученные для каждого отдела, и далее усредните значения трех участков для каждого нерва.

Результаты

Этот протокол описывает хирургическое удаление постганглионарных поясничных симпатических нейронов у мыши. Две мыши получили поясничную симпатэктомию, а две мыши служили контрольной группой. Для достижения успешной хирургической поясничной симпатэктомии должна быть достигнута аде...

Обсуждение

Поясничные симпатические ганглии – это очень мелкие структуры, расположенные позади многих критически важных органов брюшной полости и крупных сосудов. Поэтому данная процедура требует значительной точности и аккуратности. Большая часть трудностей заключается в интраоперационной ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914