Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקול להסרה כירורגית של תאי עצב סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. הליך זה יאפשר מספר רב של מחקרים שמטרתם לחקור את התפקיד של עצבוב סימפתטי במטרות רקמות דיסטליות.

Abstract

פגיעות עצביות היקפיות הן נפוצות, והתאוששות תפקודית מלאה לאחר פציעה מושגת רק ב-10% מהמטופלים. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקידים קריטיים רבים בשמירה על הומאוסטזיס גופני, אך רק לעתים רחוקות היא נחקרה בהקשר של פגיעה עצבית היקפית. היקף התפקודים העצביים הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים במטרות דיסטליות בפריפריה אינו ברור כרגע. כדי לחקור טוב יותר את התפקיד של עצבוב סימפתטי של מטרות היקפיות, מודל "נוק-אאוט" כירורגי מספק גישה חלופית. למרות שניתן להשיג זאת מבחינה כימית, הרס כימי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים יכול להיות לא ספציפי ותלוי מינון. השימוש בכריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים, שבעבר נחשבה ל"כמעט בלתי מעשית" בבעלי חיים קטנים, מאפשר מיקוד ספציפי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים המעצבבים את הגפיים האחוריות. כתב יד זה מתאר כיצד להסיר בניתוח את הגרעינים הסימפתטיים המותניים L2-L5 מעכבר כניתוח הישרדות, אשר מפחית באופן אמין את תגובת הזיעה של הכף האחורית ואת מספר האקסונים הסימפתטיים בעצב הסיאטי.

Introduction

פגיעות עצביות היקפיות (PNIs) יכולות להוביל לליקויים מוטוריים, תחושתיים וסימפתטיים במטרות רקמה דיסטלית שרק לעתים רחוקות מתאוששים באופן מלא1. מחקרי PNI התמקדו לעתים קרובות בהתחדשות המוטורית והחושית; עם זאת, כמעט רבע מהעצב הסיאטי של החולדה מורכב מאקסונים סימפתטיים לא מיאלינטים2. התפקיד של עצבוב סימפתטי ברקמות ההיקפיות, עם זאת, אינו מובן במלואו3. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס גופני, משתתפת בוויסות חיסוני, ויסות תרמי, טונוס כלי דם, ביוגנזה מיטוכונדריאלית ועוד 4,5,6,7,8,9,10,11 . כאשר עצבוב סימפתטי בצומת הנוירומוסקולרי הולך לאיבוד, חולשת שרירים מתמשכת וחוסר יציבות סינפטית נצפים למרות שמירה על עצבוב מוטונורון12. ויסות סימפתטי זה של העברה סינפטית בצומת העצבית-שרירית הוכח כיורד עם הזדקנות13,14, מה שתורם לסרקופניה, המוגדרת כירידה תלוית גיל במסת שריר, כוח וכוח15. הבנה טובה יותר של תפקיד העצבוב הסימפתטי של רקמות היקפיות נחוצה לפיתוח טיפולים שימטבו את התוצאות התפקודיות עבור חולים עם PNIs וצורות אחרות של תפקוד לקוי סימפתטי.

כריתת סימפתטיה היא כלי ניסיוני רב עוצמה שיאפשר לחקור את תפקיד העצבוב הסימפתטי ברקמות המטרה הדיסטליות. באופן ספציפי, הסרת הגרעינים הסימפתטיים ברמת L2-L5 מסירה את רוב העצבוב הסימפתטי לגפיים התחתונות, דבר שימושי במיוחד עבור חוקרים המעוניינים בעצב הסיאטי.

פרוטוקול זה מפרט את הסרת תאי העצב הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים ברמת L2-L5 מעכבר כניתוח הישרדות. הליך זה דורש מיומנויות מיקרוכירורגיות של מכרסמים והיכרות עם אנטומיה של עכבר, וכאשר הוא מבוצע ביעילות, אינו גורם להבדלים פנוטיפיים נראים לעין. כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית שימשה במחקר מכרסמים, יותר בחולדות מאשר בעכברים 16,17,18,19,20,21; עם זאת, פרוטוקול מפורט המתאר את הפרוטוקול אינו קיים כיום. מחקרים קודמים שהשתמשו בסימפטקטומיה המותנית התמקדו בעיקר בתפקיד של עצבוב סימפתטי בתגובת הכאב, אשר בדרך כלל מוחלשת על ידי סימפטקטומיה במודלים שונים של פגיעה עצבית. פחות מחקרים השתמשו בטכניקה זו בעכברים22, ככל הנראה בשל גודלם הקטן יותר של ציוני דרך אנטומיים, שכן השימוש בסימפטקטומיה כירורגית נחשב "כמעט לא מעשי" בבעלי חיים קטנים23,24. סימפטקטומיות מקומיות בצורה של microsympathectomies שימשו גם במודלים של מכרסמים, גם בעיקר בהקשר של התנהגויות כאב 25,26,27. המיקרוסימפטקטומיה, בניגוד לכריתת הסימפטקטומיה המותנית הכוללת, משתמשת בגישה גבית שבאמצעותה מנתק ומוסר קטע מהרמוס האפור לעצב עמוד שדרה ספציפי, מה שמאפשר כריתת סימפתקטומיה ממוקדת מאוד שתמנע תופעות לוואי רחבות יותר.

מכיוון שמודלים של עכברים הם קריטיים עבור מחקרים רבים הדורשים מניפולציה גנטית, להליך זה יהיו יישומים מגוונים מעבר לרוחב של פגיעות עצביות היקפיות גם כן. באמצעות גישה טרנס-בטנית, ניתן להמחיש באופן אמין את הגרעינים הסימפתטיים המותניים ולכרות אותם מהעכבר ללא תופעות לוואי נראות לעין. למרות שקיימים פרוטוקולים להשמדה כימית של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים, כגון שימוש ב-6-הידרוקסידופמין (6-OHDA)23,24, הליך כירורגי זה מאפשר מיקוד אנטומי ספציפי של הגרעינים הסימפתטיים המותניים הפוסט-גנגליונים. השימוש בסימפטקטומיה כירורגית גם מונע את החששות הלא ספציפיים ותלויי המינון הקשורים לשיטות פרמקולוגיות28,29.

השימוש בסימפטקטומיות כימיות באמצעות מתן 6-OHDA תואר בשנת 1967 כדרך פשוטה להשיג הרס סלקטיבי של קצות עצבים אדרנרגיים, שכן ניתוחים בבעלי חיים קטנים לא היו מועדפים23,24. 6-OHDA הוא רעלן עצבי קטכולמינרגי שנוצר אנדוגנית בחולי פרקינסון, ורעילותו נגזרת מיכולתו ליצור רדיקלים חופשיים ולעכב את שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה30,31. באמצעות מנגנוני הובלה של ספיגת נוראדרנלין-1, 6-OHDA מסוגל להצטבר בתוך נוירונים נוראדרנרגיים, כגון נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים28. בסופו של דבר, תא העצב נהרס על ידי 6-OHDA; עם זאת, טרמינלים במערכת העצבים ההיקפית אכן מתחדשים, עם שיקום הפעילות התפקודית גם כאשר רמות האמין עדיין מופחתות. ספי מינון שונים קיימים גם עבור איברים שונים בתגובה ל-6-OHDA, ומינונים גבוהים יותר של 6-OHDA הוכחו כבעלי השפעות לא ספציפיות יותר, המרחיבים את השלכותיו הנוירוטוקסיות לנוירונים שאינם מכילים קטכולאמין ואפילו לתאים שאינם נוירונים. מלבד נוירונים נוראדרנרגיים, נוירונים דופמינרגיים מושפעים גם מ-6-OHDA29, מה שהופך את הסימפטקטומיה הכימית בסופו של דבר לפחות ספציפית לנוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מאשר הסימפטקטומיה הכירורגית.

לכן, כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית מאפשרת אבלציה ממוקדת של העצבוב הסימפתטי לגפיים התחתונות, אותה ניתן לשלב עם מגוון טכניקות ניסיוניות ומניפולציות גנטיות בעכבר כדי לחקור כיצד מערכת העצבים הסימפתטית תורמת למצבי פציעה ומחלה שונים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אמורי (תחת פרוטוקול IACUC מספר PROTO201700371). במחקר זה נעשה שימוש בארבע נקבות עכברי בר בוגרות מסוג C57BL/6J, בנות 14 שבועות ובמשקל שבין 16-21 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים כאן מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה טרום ניתוחית

  1. Autoclave כלי הניתוח: 1 זוג מספריים חדים, 2 פינצטה עדינה, 1 נהג מחט.
  2. חממו כרית חימום ל-37°C והניחו אותה מתחת למשטח הניתוח.
  3. רססו את אזור הניתוח, כולל תא ההרדמה, בחומר חיטוי ונגבו אותו היטב במגבות נייר.
  4. הקפידו על חלוק תקין ושטיפת ידיים לפני הטיפול בעכבר.
  5. להאכיל את העכבר עם meloxicam ב 5 מ"ג / ק"ג משקל הגוף, ולאפשר הרבה זמן עבור העכבר לבלוע לחלוטין את התרופה כדי למנוע שאיפה במהלך הזירוז.
  6. יש להשרות את העכבר בהרדמה עם איזופלורן 3% בליטר חמצן אחד לדקה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
  7. לאחר שהעכבר מורדם (אין תגובה לצביטה בבוהן), הניחו את העכבר על שולחן הניתוח, עם עמוד השדרה, עם אפו בחרוט אף מותאם.
  8. לאחר שהעכבר מותאם כראוי לקונוס האף, התאם את האיזופלורן ל -2% לשמירה על הרדמה.
  9. יש להניח ג'ל עיניים על עיני העכבר כדי למנוע keratoconjunctivitis sicca (עין יבשה).
  10. ודא שהעכבר מאובטח כראוי באמצעות סרט כירורגי לשולחן הניתוח.
  11. יש לעקוב ברציפות אחר נוחות הנשימה וקצב נשימה נאות.
  12. לגלח את הפרווה מבטן העכבר מגובה איברי המין אל מתחת לצלעות.
  13. לאחר הסרת הפרווה, יש לנגב תחילה את אזור הניתוח בתנועה מעגלית, ממרכז לפריפריה, עם 70% אתנול. לאחר מכן, נגבו את אזור הניתוח עם בטאדין באותה תנועה מעגלית. חזור על שני השלבים אתנול ובטאדין בסך הכל 3 פעמים.
  14. עטפו את העכבר עם וילון כירורגי סטרילי עם חור בגודל מתאים שנחתך מהאמצע כדי לדמיין את שדה הניתוח. ניתן ליצור את צורת הרומבואיד על ידי קיפול הווילון לשניים וחיתוך משולש איזוצלס בגובה של ~10 מ"מ ובסיס של ~15 מ"מ.

2. חתכים

  1. בעזרת זוג מספריים חדים ופינצטה עדינה, יוצרים חתך בקו האמצע מ~1 מ"מ מעל רמת סימפיזיס הערווה ל~2 מ"מ מתחת לצלעות.
  2. זהה את הפאשיה האמצעית (linea alba) בין שרירי הבטן הדו-צדדיים. בעזרת הפינצטה, הרימו את שרירי הבטן הרחק מהאיברים שמתחתיהם וחתכו לאורך הלינאה אלבה כדי להיכנס לחלל הבטן.
    הערה: ניתן לזהות את linea alba על ידי משיכה עדינה של שרירי הבטן הדו-צדדיים של הרקטוס לרוחב כדי לחשוף קו פאשיה דק יותר שנמצא לאורך קו האמצע32. ביצוע החתך דרך linea alba מאפשר את השריר להיסגר בקלות רבה יותר.
  3. משוך את שרירי הבטן והעור עם 5-0 תפרים לרוחב כדי לדמיין את השלבים הבאים כראוי.

3. זיהוי הגרעינים הסימפתטיים המותניים L2-L5

  1. הגרעינים הסימפתטיים המותניים נמצאים אחוריים לאבי העורקים הבטני ולווריד הנבוב התחתון. כדי לדמיין את אבי העורקים, להסיר חלקית את המעיים מחלל הבטן.
    הערה: הגרעינים הסימפתטיים ברמת L2-L5 חוצים מרמת הביפורקציה של אבי העורקים לכלי הדם האיליאק לרמה של עורק הכליה השמאלי21,33.
    1. הניחו ריבוע כותנה סטרילי רווי במי מלח סטריליים על החתך, מונח עליון ומשמאל לחתך. בזהירות, עם 2 אפליקטורים סטריליים עם קצוות כותנה, דוחפים את המעי הגס והמעי הדק באופן חלקי החוצה אל ריבוע הכותנה הספוג במי מלח.
      הערה: ודא כי הצקום והתוספתן נמצאים מחוץ לחלל הבטן וכי ניתן לדמיין את המעי הגס היורד.
    2. מכסים את המעיים החשופים בריבוע כותנה רווי מלח נוסף.
    3. מעת לעת לפקח פריסטלטיקה לאורך כל הניתוח, אשר ניתן לזהות על ידי תנועה קצבית של המעיים.
  2. זהה את המעי הגס היורד, שהוא החלק של המעי שנע לכיוון פי הטבעת ופי הטבעת ועשוי להכיל חומר צואתי גלוי, ולהסיט מבנה זה שמאלה עם פינצטה סגורה כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני ואת נבוב הווריד הנחות. שני כלי דם אלה קשורים ברקמת חיבור וצריכים לנוע כיחידה אחת.
    1. בעזרת זוג פינצטה, הרימו את כלי הדם הבטניים על ידי רקמת החיבור הסובבת אותם. בזמן שזה מורם, מניחים בזהירות תפר ניילון 5-0 דרך רקמת החיבור.
      אזהרה: אין לנקב את כלי הבטן עם המחט: זה יוביל לפירוק מהיר של העכבר ולמוות סביר.
    2. לאחר החדרת התפר דרך רקמת החיבור, הסיטו את כלי הדם הבטניים שמאלה. זה ייתן חלון משולש, המאפשר הדמיה ישירה של שרירי הפסואס הדו-צדדיים.
      הערה: בשל הקשרים האינטימיים שיש לגרעינים עם כלי הבטן, הגרעינים הסימפתטיים, למרות שהם ממוקמים בדרך כלל בקו האמצע, יוסטו מעט שמאלה (ימין העכבר) יחד עם כלי הדם. לאחר הסטת כלי הבטן, יש לדמיין משולש, כאשר שני הצדדים משמאל מורכבים מכלי הבטן המוסטים והצד הימני מוגדר על ידי קו האמצע של העכבר (בין שרירי הפסואס הדו-צדדיים). הגרעינים הסימפתטיים נמצאים במרכז המשולש הזה (איור 1A). הם נעים אנכית זה לצד זה ונראים שקופים. הם עשויים לחפוף כלי קטן שצולל לתוך קו האמצע של העכבר ושוכב שטוח על שריר הפסואס הימני שלו. השתמשו בפינצטה כדי לנתח בבוטות כל פאשיה שמעל כדי לחשוף את הגרעינים (איור 1B).
  3. זהה את עורק הכליה השמאלי ואת עורק האשכים או השחלות השמאלי.
    הערה: מדובר בכלי דם גדולים שייצרו ריבוע, שדפנותיו מורכבות מעורק הכליה השמאלי בצורה עליונה, קו האמצע ואבי העורקים הבטני/הווריד הנבוב התחתון של החיה לרוחב, ועורק האשך השמאלי או השחלות נחות. הגרעינים ברמת L2 גדולים ונמצאים בתוך המרובע הזה (איור 1A). נתחו בזהירות כדי להיכנס למרובע הזה עם פינצטה ולזהות את גרעיני L2 הדו-צדדיים (איור 1B).
  4. לאחר זיהוי החלקים התחתונים והעליונים של הגרעינים, תפסו את ההיבט התחתון של הגרעינים הדו-צדדיים הנראים לעין עם זוג פינצטות ומשכו כלפי מעלה. הדמיה של גרעינים במיקום נחות יותר, כגון L4 ו- L5, ניתן להגדיל על ידי דחיפה עדינה של כל האיברים החוסמים את הנוף בנחיתות עם זוג הפינצטה השני.
    הערה: הדמיה של כלי הניקוב בקו האמצע המוזכרת בשלב 3.2.2 תבטיח כריתת סימפתטומיה מותנית מלאה יותר. החזקת זוג פינצטה שני ביד השנייה, משכו את הפאשיה ואת הקשרים העצביים המחזיקים את הגרעינים בבטן ובמקביל משכו למעלה את הגרעינים עצמם עם זוג הפינצטה הראשון. רק זוג פינצטה אחד צריך להחזיק את הגרעינים, בעוד השני מנקה את הפאשיה ואת הקשרים העצביים. ברגע שזה מגיע לרמה של עורק האשך השמאלי או השחלות, זה עשוי להיות מועיל לזיהוי L2 אם גרעיני השרשרת התחתונה עדיין שלמים, מכיוון שגרעיני L2 ינועו כאשר יימשכו על ידי השרשרת התחתונה. ניתן לשבור את גרעיני L3-5 בעורק האשכים או השחלה לפני חילוץ גרעיני L2 מהמרובע באמצעות פינצטה. הגרעינים היחידים הנמצאים בתוך המרובע הם גרעיני L2.
  5. הליך זה צריך להיות איבוד דם מינימלי. אם מתרחש דימום, יש לוודא המוסטזיס נאות לפני הסגירה.

4. סגירת העור

  1. לאחר hemostasis נאות מושגת, להסיר את התפר מחזיק את כלי הבטן במקום.
  2. בעזרת 2 אפליקטורים סטריליים עם קצוות כותנה, יש להחליף בזהירות את המעיים המוטים לחלל הבטן.
  3. עם תפר נספג 5-0, בצע תפר ריצה כדי לקרב את שרירי הבטן.
  4. עם תפר ניילון 5-0, השתמש בתפרים פשוטים קטועים כדי לסגור את העור.
  5. החל שכבה נדיבה של משחה אנטיביוטית, כגון Neosporin, על אתר החתך.
  6. הניחו את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום.
  7. התבונן בעכבר כל 15 דקות עד שהוא ער ואמבולטורי. זה בדרך כלל לוקח פחות מ -30 דקות.

5. בדיקת זיעה פילוקרפין

הערה: כדי להעריך דלדול בפעילות התפקודית הסימפתטית לאחר כריתת סימפתטומיה מותנית, נעשה שימוש בבדיקת זיעה פילוקרפין 7 ימים לאחר כריתת סימפטקטומיה מותנית.

  1. הכינו תמיסת פילוקרפין הידרוכלוריד 1% ב-0.9% NaCl לצד תערובת של 10% עמילן תפוחי אדמה בשמן קיק.
  2. באמצעות מברשת צבע, לכסות את פני השטח plantar של כף הרגל עם betadine. הניחו לשכבה זו להתייבש לחלוטין.
  3. לאחר ששכבת הבטאדין יבשה, השתמשו במברשת צבע נפרדת כדי למרוח שכבה של 10% עמילן בשמן קיק.
  4. יש לתת 0.25 μL/g משקל גוף של 1% פילוקרפין תת עורית באמצעות מזרק לתוך העור הרפוי מעל הצוואר. הפעל טיימר מיד לאחר ניהול pilocarpine.
  5. ב 8 דקות לאחר ההזרקה, לצלם תמונות של המשטח הפלנטרי של כף הרגל.
  6. באמצעות פיג'י, ספרו את מספר הכתמים הכהים שנמצאים על כל ששת (6) משטחי כף הרגל (איור 2A).

6. אימונוהיסטוכימיה

הערה: כדי להעריך את הניוון של אקסונים סימפתטיים בעצבים ההיקפיים לאחר כריתת הסימפטקטומיה המותנית, העצבים הסיאטיים הדו-צדדיים נקצרו ביום ה-21 שלאחר הניתוח.

  1. מרדימים את העכברים (לאחר שלב 1 של הפרוטוקול), קוצרים את העצבים הסיאטיים הדו-צדדיים, ולאחר מכן ממיתים מיד את בעל החיים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
  2. הניחו את העצבים הסיאטיים ישירות לתוך 4% paraformaldehyde ב-0.01 M מלוחים חוצצי פוספט (PBS) למשך 20 דקות, ולאחר מכן העבירו אותם ל-20% סוכרוז ב-0.1 M PBS להגנה קריואקטיבית למשך הלילה ב-4°C.
  3. חתכו את העצבים הסיאטיים לאורכם באמצעות קריוסטט ב-20 מיקרומטר, והניחו את המקטעים על שקופיות טעונות.
  4. חסום את חלקי העצבים עם 10% סרום עיזים רגיל (NGS) במי מלח חוצצים עם 1% Tween 20 (TBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את המאגר החוסם והחלף אותו בנוגדנים העיקריים ארנב אנטי טירוזין הידרוקסילאז ועוף אנטי נוירופילמנט כבד מדולל במאגר החוסם (10% NGS ב TBST) ב 1:750 ו 1:1000, בהתאמה. אפשרו לנוגדנים הראשוניים לדגור במשך הלילה בתא לחות בטמפרטורת החדר.
  6. יש לשטוף את המגלשה עם TBST 3 פעמים, 10 דקות כל כביסה, לפני מריחת הנוגדנים המשניים עז נגד ארנב 647 ועז נגד עוף 488, שניהם מדוללים בשעה 1:200 במאגר החסימה. אפשר לנוגדנים המשניים לדגור בתא לחות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  7. שטפו את המגלשה עם TBST 4 פעמים, 10 דקות כל כביסה, ואפשרו למגלשה להתייבש באזור מוגן אור לפני ההרכבה.
  8. תמונה של חתכי עצב במרחק של לפחות 40 מיקרומטר זה מזה במיקרוסקופ פלואורסצנטי על המטרה 10x.
  9. בפיג'י, יישרו את חלקי העצבים וציירו שלושה קווים אנכיים הממוקמים באופן אקראי לרוחב הקטע. ספרו את מספר האקסונים החוצים כל קו אנכי וחלקו אותו ברוחב הקטע בקו האנכי. חזור על הפעולה עבור כל אחד משלושת הקווים האנכיים בכל מקטע. ממוצע שלושת הערכים המתקבלים לכל קטע, ועוד יותר ממוצע את הערכים של שלושת החלקים לכל עצב.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר הסרה כירורגית של נוירונים סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. שני עכברים עברו ניתוח לכריתת מותניים, ושני עכברים שימשו כקבוצת ביקורת. כדי להשיג כריתה מוצלחת של המותניים המותניים, יש לבצע הדמיה נאותה של לפחות הגרעינים הסימפתטיים הדו-צדדיים L2 ו-L3, כפי שניתן לראות

Discussion

הגרעינים הסימפתטיים המותניים הם מבנים קטנים מאוד הממוקמים מאחורי איברי בטן קריטיים רבים וכלי דם גדולים. לכן, הליך זה דורש דיוק ודיוק משמעותיים. חלק גדול מהקושי טמון בזיהוי הגרעינים הסימפתטיים תוך ניתוחית. מוצע כי הלומד יוכל תחילה לזהות את הגרעינים בגופת עכבר לפני שינסה הליך זה בעכבר חי. ל?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי של NIH תחת פרס מספר K01NS124912 ובחלקה על ידי מענק התפתחותי ממרכז אמורי המתמחה למצוינות במחקר בהבדלים בין המינים U54AG062334 במימון NIH ותוכנית הכשרת המדענים הרפואיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. תודה לדיוויד קים, לאחר הבגרות, על חיתוך עצבים סיאטיים ול- HaoMin SiMa, מומחה מחקר, על הדפסת תלת מימד תושבת טלפון למיקרוסקופ הסטריאו שלנו שאפשרה את צילום הסרטון.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-0 absorable sutureCP Medical421A
5-0 nylon sutureMed-Vet InternationalMV-661
70% ethanolSigma-AldrichE7023-4L
Anesthesia Induction ChamberKent Scientific VetFloVetFlo-0530XS
Anesthesia VaporizerKent Scientific VetFlo13-005-202
BetadineHealthyPetsBET16OZ
C57BL/6J miceJackson Laboratory#000664
Chicken anti-neurofilament-heavyAbcamab72996
CryostatLeicaCM1850
Data Analysis SoftwarePrism
Fine-tipped tweezersWorld Precision Instruments500233
Fluorescent microscopeNikonTi-E
Goat anti-chicken 488InvitrogenA32931
Goat anti-rabbit 647InvitrogenA21245
Heating padBraintree Scientific39DP
Image Analysis SoftwareFiji
Imaging SoftwareNikonNIS-Elements
IsofluraneMed-Vet InternationalRXISO-250
MeloxicamMed-Vet InternationalRXMELOXIDYL32
Needle driverRoboz Surgical StoreRS-7894
Normal Goat SerumAbcamab7481
Ophthalmic ointmentRefreshRefresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant miceJackson Laboratory #016223, #007914
Pilocarpine hydrochlorideSigma-AldrichP6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylaseAbcamab112
Small straight scissors Fine Science Tools14084-09
Sterile cotton swabs 2x2Dynarex3252
Sterile cotton tipped applicatorsDynarex4301
Sterile drapeMed-Vet InternationalDR4042
Sterile saline solutionMed-Vet International1070988-BX
ThCre:mTmG mutant miceMutant Mouse Resource and Research Centersstrain #017262-UCDJackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant miceEuropean Mouse Mutant Archivestrain #00254Jackson Laboratory, strain #007914

References

  1. Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
  2. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  3. Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
  4. Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
  5. Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
  6. Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
  7. Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
  8. Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
  9. Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935 (2018).
  10. Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
  11. Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
  12. Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
  13. Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305 (2021).
  14. Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
  15. Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
  16. Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
  17. Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
  18. Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
  19. Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
  20. Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
  21. Zheng, Z. -. F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177 (2017).
  22. Holmberg, K., Shi, T. -. J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
  23. Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
  24. Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. . Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
  25. Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
  26. Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -. M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
  27. Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
  28. Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
  29. Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
  30. Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
  31. Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
  32. Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. . Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , 119 (2017).
  33. Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
  34. Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
  35. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
  36. Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
  37. Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314 (2016).
  38. Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
  39. Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , 2023 (2023).
  40. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  41. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -. F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  42. François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved