כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקול להסרה כירורגית של תאי עצב סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. הליך זה יאפשר מספר רב של מחקרים שמטרתם לחקור את התפקיד של עצבוב סימפתטי במטרות רקמות דיסטליות.

Abstract

פגיעות עצביות היקפיות הן נפוצות, והתאוששות תפקודית מלאה לאחר פציעה מושגת רק ב-10% מהמטופלים. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקידים קריטיים רבים בשמירה על הומאוסטזיס גופני, אך רק לעתים רחוקות היא נחקרה בהקשר של פגיעה עצבית היקפית. היקף התפקודים העצביים הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים במטרות דיסטליות בפריפריה אינו ברור כרגע. כדי לחקור טוב יותר את התפקיד של עצבוב סימפתטי של מטרות היקפיות, מודל "נוק-אאוט" כירורגי מספק גישה חלופית. למרות שניתן להשיג זאת מבחינה כימית, הרס כימי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים יכול להיות לא ספציפי ותלוי מינון. השימוש בכריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים, שבעבר נחשבה ל"כמעט בלתי מעשית" בבעלי חיים קטנים, מאפשר מיקוד ספציפי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים המעצבבים את הגפיים האחוריות. כתב יד זה מתאר כיצד להסיר בניתוח את הגרעינים הסימפתטיים המותניים L2-L5 מעכבר כניתוח הישרדות, אשר מפחית באופן אמין את תגובת הזיעה של הכף האחורית ואת מספר האקסונים הסימפתטיים בעצב הסיאטי.

Introduction

פגיעות עצביות היקפיות (PNIs) יכולות להוביל לליקויים מוטוריים, תחושתיים וסימפתטיים במטרות רקמה דיסטלית שרק לעתים רחוקות מתאוששים באופן מלא¹. מחקרי PNI התמקדו לעתים קרובות בהתחדשות המוטורית והחושית; עם זאת, כמעט רבע מהעצב הסיאטי של החולדה מורכב מאקסונים סימפתטיים לא מיאלינטים². התפקיד של עצבוב סימפתטי ברקמות ההיקפיות, עם זאת, אינו מובן במלואו³. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס גופני, משתתפת בוויסות חיסוני, ויסות תרמי, טונוס כלי דם, ביוגנזה מיטוכונדריאלית ועוד 4,5,6,7,8,9,10,11 <....

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אמורי (תחת פרוטוקול IACUC מספר PROTO201700371). במחקר זה נעשה שימוש בארבע נקבות עכברי בר בוגרות מסוג C57BL/6J, בנות 14 שבועות ובמשקל שבין 16-21 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים כאן מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. Autoclave כלי הניתוח: 1 זוג מספריים חדים, 2 פינצטה עדינה, 1 נהג מחט.
2. חממו כרית חימום ל-37°C והניחו אותה מתחת למשטח הניתוח.
3. רססו את אזור הניתוח, כולל תא ההרדמה, בחומר חיטוי ונגבו אותו היטב במגבות נייר.
4. הקפידו על חלוק תקין ושטיפת ידיים לפני הטיפול בעכבר.
<....

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר הסרה כירורגית של נוירונים סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. שני עכברים עברו ניתוח לכריתת מותניים, ושני עכברים שימשו כקבוצת ביקורת. כדי להשיג כריתה מוצלחת של המותניים המותניים, יש לבצע הדמיה נאותה של לפחות הגרעינים הסימפתטיים הדו-צדדיים L2 ו-L3, כפי שניתן לראות

Discussion

הגרעינים הסימפתטיים המותניים הם מבנים קטנים מאוד הממוקמים מאחורי איברי בטן קריטיים רבים וכלי דם גדולים. לכן, הליך זה דורש דיוק ודיוק משמעותיים. חלק גדול מהקושי טמון בזיהוי הגרעינים הסימפתטיים תוך ניתוחית. מוצע כי הלומד יוכל תחילה לזהות את הגרעינים בגופת עכבר לפני שינסה הליך זה בעכבר חי. ל?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914