생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술

요약

이 논문은 쥐에서 신경절 후 요추 교감신경 신경을 외과적으로 제거하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 원위 조직 표적에서 교감신경 분포의 역할을 조사하기 위한 다양한 연구를 용이하게 할 것입니다.

초록

말초 신경 손상은 흔하며, 손상 후 완전한 기능 회복은 환자의 10%에서만 이루어집니다. 교감신경계는 신체의 항상성을 유지하는 데 많은 중요한 역할을 하지만 말초 신경 손상의 맥락에서 연구된 적은 거의 없습니다. 말초의 원위 표적에서 신경절 후 교감신경 신경 기능의 범위는 현재 불분명합니다. 말초 표적의 교감신경 분포의 역할을 더 잘 탐구하기 위해 외과적 "녹아웃(knock-out)" 모델이 대안적인 접근법을 제공합니다. 이는 화학적으로 달성될 수 있지만, 신경절 후 교감신경 뉴런의 화학적 파괴는 비특이적이고 용량에 따라 달라질 수 있습니다. 한때 작은 동물에서는 "사실상 실행 불가능하다"고 여겨졌던 쥐에서 외과적 요추 교감신경 절제술을 사용하면 뒷다리에 신경을 자극하는 신경절 후 교감신경 신경 세포를 특이적으로 표적으로 삼을 수 있습니다. 이 논문은 생존 수술로 쥐의 L2-L5 요추 교감신경절을 외과적으로 제거하는 방법을 설명하고 있으며, 이를 통해 뒷발의 땀 반응과 좌골 신경의 교감신경 축삭 수를 확실하게 감소시킬 수 있습니다.

서문

말초 신경 손상(PNI)은 기능적으로 거의 완전히 회복되지 않는 원위 조직 표적에서 운동, 감각 및 교감신경 결손을 유발할 수 있습니다¹. PNI 연구는 종종 운동 및 감각 재생에 초점을 맞추었습니다. 그러나 쥐의 좌골 신경의 거의 4분의 1은 수초화되지 않은 교감신경 축삭돌기로 구성되어^{있다 2}. 그럼에도 불구하고 말초 조직에서 교감신경 분포의 역할은 완전히 이해되지 않았습니다³. 교감신경계는 신체의 항상성을 유지하고 면역 조절, 체온 조절, 혈관 긴장도, 미토콘드리아 생물 발생 등에 관여하는 데 중요한 역할을 합니다 4,5,6,7,8,9,10,11 . 신경근 접합부에서 교감신경 분포가 소실되면, 운동 신경 분포의 유지에도 불구하고 지속적인 근육 약화와 시냅스 불안정성이 관찰된다¹². 신경근 접합부에서 시냅스 전달에 대한 이러한 교감신경 조절은 노화에 따라 감소하는 것으로 나타났으며^13,14 이는 근감소증(sarcopenia)에 기여하며, 이는 근육량, 힘 및 힘의 연령에 따른 감소로 정의된다¹⁵. PNI 및 기타 형태의 교감신경 기능 장애가 있는 환자의 기능적 결과를 최적화하는 치료법 개발을 위해서는 말초 조직의 교감신경 분포의 역할에 대한 더 나은 이해가 필요합니다.

교감신경 절제술은 원위 표적 조직에서 교감신경 분포의 역할을 조사할 수 있는 강력한 실험 도구입니다. 특히, L2-L5 수준의 교감신경절을 제거하면 하지로 가는 교감신경 분포의 대부분이 제거되며, 이는 좌골 신경에 관심이 있는 연구자에게 특히 유용합니다.

이 프로토콜은 생존 수술로 마우스에서 L2-L5 수준의 신경절 후 교감신경 신경 세포를 제거하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 시술은 설치류 미세수술 기술과 마우스의 해부학적 구조에 대한 친숙함이 필요하며, 효과적으로 수행될 경우 눈에 띄는 표현형 차이를 일으키지 않습니다. 외과적 요추 교감신경 절제술은 설치류 연구에 사용되었으며, 생쥐보다 생쥐에서 더 많이 사용되었다 16,17,18,19,20,21; 그러나 프로토콜을 설명하는 자세한 프로토콜은 현재 존재하지 않습니다. 요추 교감신경 절제술을 활용한 이전 연구는 주로 통증 반응에서 교감신경 분포의 역할에 초점을 맞추었으며, 이는 일반적으로 다양한 신경 손상 모델에서 교감신경 절제술에 의해 약화됩니다. 생쥐²²에서 이 기술을 사용한 연구는 더 적었는데, 이는 외과적 교감신경 절제술의 사용이 작은 동물에서 "사실상 실행 가능하지 않다"고 여겨졌기 때문에 해부학적 랜드마크의 크기가 더 작기 때문일 수 있습니다^23,24. 미세교감신경 절제술의 형태로 국소화된 교감신경 절제술은 설치류 모델에서도 활용되었으며, 주로 통증 행동의 맥락에서도 활용되었다 25,26,27. 전체 요추 교감신경 절제술과 달리 미세 교감신경 절제술은 특정 척추 신경에 대한 회색 라무스의 일부를 분리하고 제거하는 등쪽 접근법을 사용하여 더 넓은 확산 부작용을 피할 수 있는 매우 표적화된 교감신경 절제술을 가능하게 합니다.

마우스 모델은 유전자 조작이 필요한 많은 연구에서 중요하기 때문에 이 절차는 말초 신경 손상의 범위를 넘어 다양한 응용 분야를 가질 것입니다. 경복부 접근법을 사용하면 요추 교감신경절을 신뢰할 수 있게 시각화하고 명백한 부작용 없이 마우스에서 절제할 수 있습니다. 6-하이드록시도파민(6-OHDA)^23,24의 사용과 같이 신경절 후 교감신경 신경세포의 화학적 파괴를 위한 프로토콜이 사용 가능하지만, 이 수술 절차는 신경절 후 요추 교감신경절의 해부학적으로 특이적인 표적화를 허용합니다. 외과적 교감신경 절제술의 사용은 또한 약리학적 방법과 관련된 비특이적이고 용량에 의존하는 문제를 피할 수 있다 ^28,29.

6-OHDA의 투여를 통한 화학적 교감신경 절제술의 사용은 1967년에 작은 동물에서의 외과적 교감신경 절제술이 선호되지 않았기 때문에 아드레날린성 신경 말단의 선택적 파괴를 달성하는 간단한 방법으로 설명되었습니다^23,24. 6-OHDA는 파킨슨병 환자에서 내인성으로 형성되는 카테콜아민성 신경독이며, 그 독성은 자유 라디칼을 형성하고 미토콘드리아^30,31에서 전자 전달 사슬을 억제하는 능력에서 파생됩니다. 노르에피네프린 흡수-1 수송 기전을 통해, 6-OHDA는 신경절 후 교감신경 뉴런과 같은 노르아드레날린 뉴런 내에 축적될 수 있다²⁸. 결국, 뉴런은 6-OHDA에 의해 파괴됩니다. 그러나 말초 신경계의 말단은 아민 수치가 여전히 감소한 경우에도 기능 활동이 복원되면서 재생됩니다. 6-OHDA에 대한 반응으로 다른 장기에 대해 다른 투여량 임계값도 존재하며, 6-OHDA의 과다 복용은 더 많은 비특이적 효과를 나타내는 것으로 나타났으며, 비카테콜아민 함유 뉴런 및 심지어 비뉴런 세포로 신경독성 결과를 확장했습니다. 노르아드레날린성 뉴런 외에도 도파민 뉴런은 6-OHDA뿐만 아니라²⁹의 영향을 받으며, 이로 인해 화학적 교감신경 절제술은 궁극적으로 외과적 교감신경 절제술보다 신경절 후 교감신경 신경세포에 덜 특이적입니다.

따라서 외과적 요추 교감신경 절제술은 하지에 대한 교감신경 분포의 표적 절제를 가능하게 하며, 이는 다양한 실험 기술 및 마우스의 유전자 조작과 결합하여 교감 신경계가 다양한 손상 및 질병 상태에 어떻게 기여하는지 연구할 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 에모리 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(IACUC 프로토콜 번호 PROTO201700371에 따라). 이 연구에는 14주 된 16-21g 체중의 성체 암컷 야생형 C57BL/6J 마우스 4마리가 사용되었습니다. 여기에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 수술 전 준비

1. 수술 도구를 오토클레이브: 날카로운 가위 1쌍, 끝이 가는 핀셋 2개, 바늘 드라이버 1개.
2. 발열 패드를 37°C로 예열하고 수술용 탁자 아래에 놓습니다.
3. 마취 유도실을 포함한 수술 부위에 소독제를 뿌리고 종이 타월로 철저히 닦아냅니다.
4. 마우스를 다루기 전에 적절한 가운과 손 씻기를 확인하십시오.
5. 체중 5mg/kg의 멜록시캠을 마우스에 먹이고, 유도 중 흡인을 피하기 위해 마우스가 약물을 완전히 삼킬 수 있는 충분한 시간을 허용합니다.
6. 3L/min의 산소에 1% 이소플루란으로 마취 중인 쥐를 유도합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
7. 쥐가 마취되면(발가락 꼬집음에 반응 없음) 쥐를 수술 탁자 위에 놓고 코를 꼭 맞는 코뿔에 넣습니다.
8. 마우스가 콧방울에 제대로 끼워지면 마취 유지를 위해 이소플루란을 2%로 조정합니다.
9. 각결막염(안구 건조증)을 예방하기 위해 쥐의 눈에 아이 젤을 바릅니다.
10. 마우스가 수술용 테이프로 수술용 탁자에 제대로 고정되었는지 확인합니다.
11. 호흡이 용이하고 적절한 호흡 속도를 위해 지속적으로 모니터링하십시오.
12. 생쥐의 복부에서 생식기 높이에서 갈비뼈 아래까지 털을 면도합니다.
13. 털이 제거되면 먼저 수술 부위를 70% 에탄올로 중앙에서 주변으로 원을 그리며 닦습니다. 그런 다음 베타딘으로 수술 부위를 같은 원을 그리며 닦습니다. 에탄올과 베타딘 단계를 모두 총 3회 반복합니다.
14. 수술 필드를 시각화하기 위해 중간에 적절한 크기의 구멍을 뚫은 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 드레이프합니다. 마름모꼴 모양은 드레이프를 반으로 접고 높이가 ~10mm이고 밑면이 ~15mm인 이등변 삼각형을 절단하여 만들 수 있습니다.

2. 절개 부위

1. 한 쌍의 날카로운 가위와 끝이 가는 핀셋을 사용하여 치골 대칭 높이에서 ~1mm 위에서 갈비뼈 아래 ~2mm까지 정중선 절개를 만듭니다.
2. 양측 복직근 사이의 정중선 근막(linea alba)을 식별합니다. 핀셋을 사용하여 밑에 있는 장기에서 복부 근육을 들어 올리고 linea alba를 따라 절단하여 복강으로 들어갑니다.
   참고: linea alba는 양측 복직근을 측면으로 부드럽게 당겨 정중선(³²)을 따라 세로로 놓인 더 얇은 근막 라인을 드러냄으로써 식별할 수 있습니다. linea alba를 통해 절개하면 근육이 더 쉽게 닫힐 수 있습니다.
3. 복부 근육과 피부를 측면으로 5-0 봉합사로 수축시켜 다음 단계를 제대로 시각화합니다.

3. L2-L5 요추 교감신경절의 확인

1. 요추 교감신경절(lumbar sympathetic ganglia)은 복부 대동맥(abdominal aorta)과 하대정맥(inferior vena cava)의 후방에 있습니다. 대동맥을 시각화하려면 복강에서 장을 부분적으로 제거합니다.
   참고 : L2-L5 수준의 교감 신경절은 대동맥 분기점에서 장골 혈관으로 들어가 좌측 신장 동맥^21,33 수준까지 횡단합니다.
   1. 멸균 식염수로 적신 멸균 면 사각형을 드레이프에 놓고 절개 부위의 위쪽과 왼쪽에 놓습니다. 2개의 멸균 솜 팁 어플리케이터를 사용하여 결장과 소장을 식염수에 적신 면 사각형 위로 부분적으로 밀어냅니다.
      알림: 맹장과 맹장이 복강 밖에 있고 하행 결장을 볼 수 있는지 확인하십시오.
   2. 노출된 내장을 식염수가 함유된 또 다른 면 사각형으로 덮습니다.
   3. 수술 전반에 걸쳐 연동 운동을 주기적으로 모니터링하며, 이는 장의 리드미컬한 움직임으로 식별할 수 있습니다.
2. 장에서 직장과 항문 쪽으로 이동하는 부분이며 눈에 보이는 대변 물질을 포함할 수 있는 하행 결장을 식별하고 이 구조를 닫힌 핀셋으로 왼쪽으로 편향시켜 복부 대동맥과 하대정맥을 드러냅니다. 이 두 혈관은 결합 조직으로 묶여 있으며 하나의 단위로 움직여야 합니다.
   1. 핀셋을 사용하여 주변의 결합 조직을 잡고 복부 혈관을 들어 올립니다. 이것을 들어 올리는 동안 결합 조직을 통해 5-0 나일론 봉합사를 조심스럽게 놓습니다.
      주의: 바늘로 복부 혈관을 뚫지 마십시오: 이렇게 하면 쥐가 빠르게 보상 저하되고 사망할 수 있습니다.
   2. 봉합사가 결합 조직을 통해 삽입되면 복부 혈관을 왼쪽으로 편향시킵니다. 이렇게 하면 삼각형 창이 생겨 양측 요근을 직접 시각화할 수 있습니다.
      참고: 신경절이 복부 혈관과 밀접하게 연결되어 있기 때문에 교감신경절은 일반적으로 정중선에 위치하지만 혈관과 함께 왼쪽(쥐의 오른쪽)으로 약간 편향됩니다. 복부 혈관이 편향되면 왼쪽의 두 면은 편향된 복부 혈관으로 구성되고 오른쪽은 쥐의 정중선(양측 요근 사이)으로 정의되는 삼각형을 시각화해야 합니다. 교감신경절(sympathetic ganglia)은 이 삼각형의 중간에 있습니다(그림 1A). 그들은 수직으로 나란히 이동하며 반투명하게 보입니다. 그들은 쥐의 정중선으로 다이빙하고 오른쪽 요근에 평평하게 놓여있는 작은 혈관과 겹칠 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 위에 있는 근막을 뭉툭하게 절개하여 신경절을 드러냅니다(그림 1B).
3. 좌측 신장 동맥과 좌측 고환 동맥 또는 난소 동맥을 식별합니다.
   참고: 이들은 사각형을 형성하는 큰 혈관으로, 측면은 좌측 신장 동맥이 상부, 동물의 정중선 및 복부 대동맥/하정맥 측방, 좌측 고환 또는 난소 동맥이 하부로 구성됩니다. L2 수준 신경절은 크며 이 사각형 안에 있습니다(그림 1A). 조심스럽게 둔하게 절개하여 핀셋으로 이 사각형에 들어가 양측 L2 신경절을 식별합니다(그림 1B).
4. 신경절의 아래쪽과 위쪽 부분이 확인되면 핀셋으로 보이는 양측 신경절의 아래쪽을 잡고 위쪽으로 당깁니다. L4 및 L5와 같이 더 아래쪽에 위치한 신경절의 시각화는 두 번째 핀셋으로 아래쪽으로 시야를 방해하는 장기를 부드럽게 밀어 넣음으로써 높일 수 있습니다.
   알림: 3.2.2단계에서 언급한 정중선 천공 혈관을 시각화하면 보다 완전한 요추 교감신경 절제술을 보장할 수 있습니다. 다른 한 쌍의 핀셋을 잡고 다른 한 쌍의 핀셋을 잡고 복부의 신경절을 잡고 있는 근막과 신경 세포 연결을 당겨 빼내는 동시에 첫 번째 핀셋으로 신경절 자체를 잡아당깁니다. 한 쌍의 핀셋만 신경절을 잡아야 하고 다른 한 쌍은 근막과 신경 연결을 청소해야 합니다. 좌측 고환 또는 난소 동맥 수준에서 L2 신경절이 여전히 손상되지 않은 경우 L2 식별에 도움이 될 수 있습니다. L3-5 신경절은 핀셋으로 사각형에서 L2 신경절을 추출하기 전에 고환 또는 난소 동맥에서 절단할 수 있습니다. 사각형 내에 존재하는 유일한 신경절은 L2 신경절입니다.
5. 이 시술은 출혈이 최소화되어야 합니다. 출혈이 발생하면 봉합 전에 적절한 지혈을 확인하십시오.

4. 피부 폐쇄

1. 적절한 지혈이 이루어지면 복부 혈관을 제자리에 고정하고 있는 봉합사를 제거합니다.
2. 2개의 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 전환된 장을 복강으로 조심스럽게 교체합니다.
3. 5-0 흡수성 봉합사를 사용하여 복부 근육을 근사화하기 위해 러닝 스티치를 수행합니다.
4. 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 간단한 중단 스티치를 사용하여 피부를 닫습니다.
5. 절개 부위에 네오스포린과 같은 항생제 연고를 넉넉하게 바릅니다.
6. 가열 패드의 깨끗한 케이지에 마우스를 놓습니다.
7. 쥐가 깨어서 보행할 수 있을 때까지 15분마다 관찰하십시오. 일반적으로 30분 미만이 소요됩니다.

5. Pilocarpine 땀 분석

참고: 요추 교감신경 절제술 후 교감신경 기능 활성의 고갈을 평가하기 위해 요추 교감신경 절제술 후 7일 후에 필로카르핀 땀 분석을 사용했습니다.

1. 피마자유에 1% 감자 전분 10%의 혼합물과 함께 0.9% NaCl의 1% 필로카르핀 염산염 용액을 준비합니다.
2. 붓을 사용하여 발바닥 표면을 베타딘으로 덮습니다. 이 층을 완전히 건조시키십시오.
3. 베타딘 층이 건조되면 별도의 페인트 브러시를 사용하여 피마자유에 전분 10% 층을 바릅니다.
4. 체중 0.25μL/g의 1% 필로카르핀을 주사기를 사용하여 목 위의 느슨한 피부에 피하로 투여합니다. 필로카르핀 투여 직후 타이머를 시작하십시오.
5. 주사 후 8분이 지나면 발의 발바닥 표면을 촬영합니다.
6. Fiji를 사용하여 6개의 풋패드 모두에 있는 어두운 점의 수를 계산합니다(그림 2A).

6. 면역조직화학(Immunohistochemistry)

참고: 요추 교감신경 절제술 후 말초 신경에서 교감신경 축삭의 퇴행을 평가하기 위해 수술 후 21일째에 양측 좌골 신경을 수확했습니다.

1. 마우스를 마취하고(프로토콜의 1단계에 따라) 양측 좌골 신경을 적출한 다음 동물을 즉시 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따라).
2. 좌골 신경을 0.01M 인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 파라포름알데히드에 20분 동안 직접 넣은 다음 4°C에서 하룻밤 동안 동결 보호를 위해 0.1M PBS의 20% 자당으로 옮깁니다.
3. 20μm에서 저온 유지 장치를 사용하여 좌골 신경을 세로로 절개하고 절편을 하전 슬라이드에 놓습니다.
4. 실온에서 1시간 동안 1% Tween 20(TBST)으로 트리스 완충 식염수에 10% 정상 염소 혈청(NGS)으로 신경 절편을 차단합니다.
5. 차단 완충액을 제거하고 차단 완충액(TBST에서 10% NGS)에 각각 1:750 및 1:1000으로 희석한 1차 항체 rabbit anti-tyrosine hydroxylase 및 chicken anti-neurofilament-heavy로 교체합니다. 1차 항체가 실온의 습도 챔버에서 밤새 배양되도록 합니다.
6. 차단 완충액에서 1:200으로 희석한 2차 항체 goat anti-rabbit 647 및 goat anti-chicken 488을 적용하기 전에 TBST로 슬라이드를 3회, 각 세척 10분씩 세척합니다. 2차 항체가 실온에서 2시간 동안 습도 챔버에서 배양되도록 합니다.
7. TBST로 슬라이드를 4회, 한 번 세탁할 때마다 10분씩 세척하고 장착하기 전에 슬라이드를 빛이 차단된 장소에서 건조시키십시오.
8. 10x 대물렌즈에서 형광 현미경으로 최소 40μm 떨어진 신경 절편을 이미지화합니다.
9. 피지에서는 신경 부분을 곧게 펴고 부분의 너비에 걸쳐 무작위로 배치된 세 개의 수직선을 그립니다. 각 수직선을 가로지르는 축삭의 수를 세고 이를 수직선의 단면 너비로 나눕니다. 섹션당 세 개의 수직선 각각에 대해 반복합니다. 섹션당 얻은 3개 값의 평균을 구하고 신경당 3개 섹션의 값을 추가로 평균합니다.

결과

이 프로토콜은 쥐에서 신경절 후 요추 교감신경 신경 세포를 외과적으로 제거하는 것을 설명합니다. 두 마리의 쥐는 요추 교감신경 절제술을 받았고, 두 마리의 쥐는 대조군으로 사용되었습니다. 성공적인 외과적 요추 교감신경 절제술을 위해서는 그림 1에서 볼 수 있듯이 최소한 L2 및 L3 양측 요추 교감신경절의 적절한 시각화가 이루어져야 합니다. L4 및 L5 신경절을 제거하...

토론

요추 교감신경절(lumbar sympathetic ganglia)은 많은 중요한 복부 장기와 큰 혈관 뒤에 위치한 매우 작은 구조입니다. 따라서 이 절차에는 상당한 정밀도와 정확성이 필요합니다. 대부분의 어려움은 수술 중에 교감신경절을 식별하는 데 있습니다. 학습자는 살아있는 쥐에서 이 절차를 시도하기 전에 먼저 쥐 시체에서 신경절을 식별할 수 있는 것이 좋습니다. 문제 해결은 장이 전환된 후 교감신경절을 식...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914