Simpatectomia lombare chirurgica nei topi

Riepilogo

Questo manoscritto presenta un protocollo per la rimozione chirurgica dei neuroni simpatici lombari postgangliari da un topo. Questa procedura faciliterà una moltitudine di studi volti a indagare il ruolo dell'innervazione simpatica nei bersagli tissutali distali.

Abstract

Le lesioni dei nervi periferici sono comuni e il pieno recupero funzionale dopo la lesione si ottiene solo nel 10% dei pazienti. Il sistema nervoso simpatico svolge molti ruoli critici nel mantenimento dell'omeostasi corporea, ma è stato raramente studiato nel contesto della lesione dei nervi periferici. L'estensione delle funzioni neuronali simpatiche postgangliari nei bersagli distali nella periferia non è attualmente chiara. Per esplorare meglio il ruolo dell'innervazione simpatica di bersagli periferici, un modello chirurgico "knock-out" fornisce un approccio alternativo. Sebbene ciò possa essere ottenuto chimicamente, la distruzione chimica dei neuroni simpatici postgangliari può essere aspecifica e dose-dipendente. L'uso di una simpatectomia lombare chirurgica nei topi, una volta ritenuta "praticamente non praticabile" nei piccoli animali, consente di mirare in modo specifico ai neuroni simpatici postgangliari che innervano gli arti posteriori. Questo manoscritto descrive come rimuovere chirurgicamente i gangli simpatici lombari L2-L5 da un topo come intervento chirurgico di sopravvivenza, che riduce in modo affidabile la risposta al sudore della zampa posteriore e il numero di assoni simpatici nel nervo sciatico.

Introduzione

Le lesioni dei nervi periferici (PNI) possono portare a deficit motori, sensoriali e simpatici in bersagli tissutali distali che raramente recuperano completamente funzionalmente¹. La ricerca sul PNI si è spesso concentrata sulla rigenerazione motoria e sensoriale; Tuttavia, quasi un quarto del nervo sciatico di ratto è costituito da assoni simpatici non mielinizzati². Il ruolo dell'innervazione simpatica nei tessuti periferici, tuttavia, non è completamente compreso³. Il sistema nervoso simpatico svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi corporea, partecipando alla regolazione immunitaria, alla termoregolazione, al tono vascolare, alla biogenesi mitocondriale e altro ancora 4,5,6,7,8,9,10,11 . Quando l'innervazione simpatica alla giunzione neuromuscolare viene persa, si osserva una persistente debolezza muscolare e instabilità sinaptica nonostante il mantenimento dell'innervazione dei motoneuroni¹². È stato dimostrato che questa regolazione simpatica della trasmissione sinaptica alla giunzione neuromuscolare diminuisce con l'invecchiamento^13,14, il che contribuisce alla sarcopenia, definita come la riduzione età-dipendente della massa, della forza e della potenza muscolare¹⁵. Una migliore comprensione del ruolo dell'innervazione simpatica dei tessuti periferici è necessaria per lo sviluppo di terapie che ottimizzino i risultati funzionali per i pazienti con PNI e altre forme di disfunzione simpatica.

La simpatectomia è un potente strumento sperimentale che consente di studiare il ruolo dell'innervazione simpatica nei tessuti bersaglio distali. In particolare, la rimozione dei gangli simpatici di livello L2-L5 rimuove la maggior parte dell'innervazione simpatica agli arti inferiori, il che è particolarmente utile per gli investigatori interessati al nervo sciatico.

Questo protocollo descrive in dettaglio la rimozione dei neuroni simpatici postgangliari di livello L2-L5 da un topo come intervento chirurgico di sopravvivenza. Questa procedura richiede abilità microchirurgiche nei roditori e familiarità con l'anatomia del topo e, se eseguita in modo efficace, non causa differenze fenotipiche visibili. Una simpatectomia lombare chirurgica è stata utilizzata nella ricerca sui roditori, più nei ratti che nei topi 16,17,18,19,20,21; Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo dettagliato che descriva il protocollo. Precedenti studi che utilizzavano la simpatectomia lombare si sono concentrati principalmente sul ruolo dell'innervazione simpatica nella risposta al dolore, che è generalmente attenuata dalla simpatectomia in vari modelli di lesione nervosa. Meno studi hanno utilizzato questa tecnica nei topi²², probabilmente a causa delle dimensioni ridotte dei punti di riferimento anatomici, poiché si riteneva che l'uso della simpatectomia chirurgica fosse "praticamente non praticabile" nei piccoli animali^23,24. Le simpatectomie localizzate sotto forma di microsimpatectomia sono state utilizzate anche in modelli di roditori, anche per lo più nel contesto dei comportamenti dolorosivi 25,26,27. La microsimpatectomia, a differenza della simpatectomia lombare totale, utilizza un approccio dorsale attraverso il quale un segmento del ramo grigio di uno specifico nervo spinale viene scollegato e rimosso, consentendo una simpatectomia molto mirata che eviterà effetti collaterali più diffusi.

Poiché i modelli murini sono fondamentali per molti studi che richiedono la manipolazione genetica, questa procedura avrà applicazioni versatili anche al di là dell'ampiezza delle lesioni dei nervi periferici. Utilizzando un approccio transaddominale, i gangli simpatici lombari possono essere visualizzati in modo affidabile e resecati dal topo senza effetti avversi apparenti. Sebbene siano disponibili protocolli per la distruzione chimica dei neuroni simpatici postgangliari, come l'uso di 6-idrossidopamina (6-OHDA)^23,24, questa procedura chirurgica consente un targeting anatomicamente specifico dei gangli simpatici lombari postgangliari. L'uso di una simpatectomia chirurgica evita anche i problemi aspecifici e dose-dipendenti legati ai metodi farmacologici^28,29.

L'uso di simpatectomie chimiche attraverso la somministrazione di 6-OHDA è stato descritto nel 1967 come un modo semplice per ottenere la distruzione selettiva delle terminazioni nervose adrenergiche poiché le simpaticectomie chirurgiche nei piccoli animali non erano favorite^23,24. Il 6-OHDA è una neurotossina catecolaminergica che si forma endogenamente nei pazienti con malattia di Parkinson e la sua tossicità deriva dalla sua capacità di formare radicali liberi e inibire la catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri ^30,31. Attraverso i meccanismi di trasporto dell'uptake-1 della noradrenalina, il 6-OHDA è in grado di accumularsi all'interno dei neuroni noradrenergici, come i neuroni simpatici postgangliari²⁸. Alla fine, il neurone viene distrutto dal 6-OHDA; Tuttavia, i terminali del sistema nervoso periferico si rigenerano, con il ripristino dell'attività funzionale anche quando i livelli di ammina sono ancora ridotti. Soglie di dosaggio diverse sono presenti anche per diversi organi in risposta al 6-OHDA, e dosi più elevate di 6-OHDA hanno dimostrato di mostrare effetti più aspecifici, estendendo le sue conseguenze neurotossiche ai neuroni non contenenti catecolamine e persino alle cellule non neuronali. A parte i neuroni noradrenergici, i neuroni dopaminergici sono influenzati anche dal 6-OHDA²⁹, rendendo la simpatectomia chimica in definitiva meno specifica per i neuroni simpatici postgangliari rispetto alla simpatectomia chirurgica.

Pertanto, una simpatectomia lombare chirurgica consente l'ablazione mirata dell'innervazione simpatica agli arti inferiori, che può essere combinata con una varietà di tecniche sperimentali e manipolazioni genetiche nel topo per studiare come il sistema nervoso simpatico contribuisce a vari stati di lesione e malattia.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Emory University (con il numero di protocollo IACUC PROTO201700371). In questo studio sono stati utilizzati quattro topi femmina adulta di tipo selvatico C57BL/6J, di età pari o superiore a 14 settimane e di peso compreso tra 16 e 21 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate qui sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione prechirurgica

1. Autoclavare gli strumenti chirurgici: 1 paio di forbici affilate, 2 pinzette a punta fine, 1 cacciatore per aghi.
2. Riscaldare un termoforo a 37 °C e posizionarlo sotto il piano operatorio.
3. Spruzzare l'area chirurgica, compresa la camera di induzione dell'anestesia, con disinfettante e pulirla accuratamente con carta assorbente.
4. Assicurarsi che l'abito e il lavaggio delle mani siano adeguati prima di maneggiare il mouse.
5. Somministrare al topo meloxicam alla dose di 5 mg/kg di peso corporeo e lasciare che il topo deglutisca completamente il medicinale per evitare l'aspirazione durante l'induzione.
6. Indurre il topo in anestesia con isoflurano al 3% in 1 L/min di ossigeno (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
7. Una volta che il topo è anestetizzato (nessuna reazione al pizzicamento delle dita dei piedi), posizionare il topo sul piano operatorio, supino, con il naso in un cono aderente.
8. Una volta che il mouse è stato inserito correttamente nel cono del naso, regolare l'isoflurano al 2% per il mantenimento dell'anestesia.
9. Posizionare il gel per gli occhi sugli occhi del topo per prevenire la cheratocongiuntivite secca (occhio secco).
10. Assicurarsi che il mouse sia fissato correttamente con del nastro chirurgico al piano del tavolo chirurgico.
11. Monitorare continuamente la facilità di respirazione e la frequenza respiratoria adeguata.
12. Radere il pelo dall'addome del topo dal livello dei genitali fino a sotto le costole.
13. Una volta rimosso il pelo, passare prima la zona chirurgica con un movimento circolare, da centrale a periferica, con etanolo al 70%. Quindi, pulire l'area chirurgica con betadine con lo stesso movimento circolare. Ripetere entrambi i passaggi con etanolo e betadina per un totale di 3 volte.
14. Avvolgere il topo con un telo chirurgico sterile con un foro di dimensioni adeguate ritagliato al centro per visualizzare il campo chirurgico. La forma romboidale può essere realizzata piegando il drappo a metà e tagliando un triangolo isoscele con un'altezza di ~10 mm e una base di ~15 mm.

2. Incisioni

1. Usando un paio di forbici affilate e una pinzetta a punta fine, crea un'incisione sulla linea mediana da ~1 mm sopra il livello della sinfisi pubica a ~2 mm sotto le costole.
2. Identificare la fascia mediana (linea alba) tra i muscoli retti bilaterali dell'addome. Usando le pinzette, solleva i muscoli addominali lontano dagli organi sottostanti e taglia lungo la linea alba per entrare nella cavità addominale.
   NOTA: La linea alba può essere identificata tirando delicatamente lateralmente i muscoli retti bilaterali dell'addome per rivelare una linea della fascia più sottile che si trova longitudinalmente lungo la linea mediana³². Praticare l'incisione attraverso la linea alba permette di chiudere più facilmente il muscolo.
3. Ritrarre lateralmente i muscoli addominali e la pelle con punti di sutura 5-0 per visualizzare correttamente i passaggi successivi.

3. Identificazione dei gangli simpatici lombari L2-L5

1. I gangli simpatici lombari si trovano posteriormente all'aorta addominale e alla vena cava inferiore. Per visualizzare l'aorta, rimuovere parzialmente l'intestino dalla cavità addominale.
   NOTA: I gangli simpatici di livello L2-L5 attraversano dal livello della biforcazione aortica nei vasi iliaci fino al livello dell'arteria renale sinistra^21,33.
   1. Stendere un quadrato di cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica sterile sul drappo, adagiato superiormente e a sinistra dell'incisione. Con cautela, con 2 applicatori sterili con punta di cotone, spingere parzialmente il colon e l'intestino tenue sul quadrato di cotone imbevuto di soluzione salina.
      NOTA: Assicurarsi che il cieco e l'appendice siano fuori dalla cavità addominale e che il colon discendente possa essere visualizzato.
   2. Copri l'intestino esposto con un altro fazzoletto di cotone saturo di soluzione salina.
   3. Monitorare periodicamente la peristalsi durante l'intervento chirurgico, che può essere identificata dal movimento ritmico dell'intestino.
2. Identificare il colon discendente, che è la parte dell'intestino che viaggia verso il retto e l'ano e può contenere materia fecale visibile, e deviare questa struttura a sinistra con una pinzetta chiusa per rivelare l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Questi due vasi sono legati dal tessuto connettivo e dovrebbero muoversi come un'unica unità.
   1. Con un paio di pinzette, sollevare i vasi addominali dal tessuto connettivo circostante. Mentre questo viene sollevato, posizionare con cura una sutura di nylon 5-0 attraverso il tessuto connettivo.
      ATTENZIONE: NON perforare i vasi addominali con l'ago: ciò porterà a un rapido scompensazione del topo e alla probabile morte.
   2. Una volta che la sutura è stata inserita attraverso il tessuto connettivo, deviare i vasi addominali verso sinistra. Questo darà una finestra triangolare, consentendo la visualizzazione diretta dei muscoli psoas bilaterali.
      NOTA: A causa delle intime connessioni che i gangli hanno con i vasi addominali, i gangli simpatici, sebbene tipicamente situati sulla linea mediana, saranno leggermente deviati a sinistra (a destra del topo) insieme ai vasi. Una volta che i vasi addominali sono stati deviati, si dovrebbe visualizzare un triangolo, con i due lati a sinistra costituiti dai vasi addominali deviati e il lato destro definito dalla linea mediana del topo (tra i muscoli psoas bilaterali). I gangli simpatici si trovano al centro di questo triangolo (Figura 1A). Viaggiano verticalmente fianco a fianco e appaiono traslucidi. Possono sovrapporsi a un piccolo vaso che si tuffa nella linea mediana del topo e si sdraia sul muscolo psoas destro. Usa le pinzette per sezionare senza mezzi termini qualsiasi fascia sovrastante per rivelare i gangli (Figura 1B).
3. Identificare l'arteria renale sinistra e l'arteria testicolare o ovarica sinistra.
   NOTA: Si tratta di grandi vasi che formeranno un quadrilatero, i cui lati sono costituiti dall'arteria renale sinistra superiormente, dalla linea mediana dell'animale e dall'aorta addominale/vena cava inferiore lateralmente e dall'arteria testicolare o ovarica sinistra inferiormente. I gangli di livello L2 sono grandi e si trovano all'interno di questo quadrilatero (Figura 1A). Sezionare con cura per entrare in questo quadrilatero con una pinzetta e identificare i gangli L2 bilaterali (Figura 1B).
4. Una volta identificate le parti inferiore e superiore dei gangli, afferrare l'aspetto inferiore dei gangli bilaterali visibili con un paio di pinzette e tirare verso l'alto. La visualizzazione dei gangli più inferiormente, come L4 e L5, può essere aumentata spingendo delicatamente gli organi che ostruiscono la visuale inferiormente con il secondo paio di pinzette.
   NOTA: La visualizzazione del vaso perforante della linea mediana menzionato nel passaggio 3.2.2 garantirà una simpatectomia lombare più completa. Tenendo un secondo paio di pinzette nell'altra mano, tirare via la fascia e le connessioni neuronali che tengono i gangli nell'addome e contemporaneamente tirare verso l'alto i gangli stessi con il primo paio di pinzette. Solo un paio di pinzette dovrebbe trattenere i gangli, mentre l'altro libera la fascia e le connessioni neuronali. Una volta a livello dell'arteria testicolare o ovarica sinistra, può essere utile per l'identificazione di L2 se i gangli della catena inferiore sono ancora intatti, poiché i gangli L2 si muoveranno quando vengono tirati dalla catena inferiore. I gangli L3-5 possono essere rotti all'arteria testicolare o ovarica prima di estrarre i gangli L2 dal quadrilatero con una pinzetta. Gli unici gangli presenti all'interno del quadrilatero sono i gangli L2.
5. Questa procedura dovrebbe avere una perdita di sangue minima. In caso di sanguinamento, assicurarsi di un'emostasi adeguata prima della chiusura.

4. Chiusura cutanea

1. Dopo aver ottenuto un'emostasi adeguata, rimuovere la sutura che tiene in posizione i vasi addominali.
2. Utilizzando 2 applicatori sterili con punta di cotone, riposizionare con cura l'intestino deviato nella cavità addominale.
3. Con una sutura riassorbibile 5-0, eseguire un punto di sutura per approssimare i muscoli addominali.
4. Con la sutura in nylon 5-0, utilizzare semplici punti interrotti per chiudere la pelle.
5. Applicare uno strato generoso di unguento antibiotico, come Neosporin, sul sito dell'incisione.
6. Posiziona il mouse in una gabbia pulita su un termoforo.
7. Osserva il topo ogni 15 minuti fino a quando non è sveglio e deambulante. Questo di solito richiede meno di 30 minuti.

5. Saggio del sudore di pilocarpina

NOTA: Per valutare la deplezione dell'attività funzionale simpatica a seguito di una simpatectomia lombare, è stato utilizzato un test del sudore di pilocarpina 7 giorni dopo la simpasenttomia lombare.

1. Preparare una soluzione di pilocarpina cloridrato all'1% in NaCl allo 0,9% insieme a una miscela di fecola di patate al 10% in olio di ricino.
2. Usando un pennello, coprire la superficie plantare del piede con betadine. Lasciare asciugare completamente questo strato.
3. Una volta che lo strato di betadina è asciutto, usa un pennello separato per applicare uno strato di amido al 10% in olio di ricino.
4. Somministrare 0,25 μL/g di peso corporeo di pilocarpina all'1% per via sottocutanea utilizzando una siringa nella pelle flaccida sopra il collo. Avviare un timer immediatamente dopo la somministrazione di pilocarpina.
5. A 8 minuti dopo l'iniezione, scattare foto della superficie plantare del piede.
6. Utilizzando Fiji, contare il numero di macchie scure situate su tutti e sei (6) i piedini (Figura 2A).

6. Immunoistochimica

NOTA: Per valutare la degenerazione degli assoni simpatici nei nervi periferici dopo la simpatectomia lombare, i nervi sciatici bilaterali sono stati prelevati il giorno 21 postoperatorio.

1. Anestetizzare i topi (seguendo il passaggio 1 del protocollo), prelevare i nervi sciatici bilaterali e quindi sopprimere prontamente l'animale (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).
2. Posizionare i nervi sciatici direttamente in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato 0,01 M (PBS) per 20 minuti, quindi trasferirli al saccarosio al 20% in PBS 0,1 M per la crioprotezione notturna a 4 °C.
3. Sezionare i nervi sciatici longitudinalmente utilizzando un criostato a 20 μm e posizionare le sezioni su vetrini carichi.
4. Bloccare le sezioni nervose con il 10% di siero normale di capra (NGS) in soluzione salina tamponata tris con Tween 20 (TBST) all'1% per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Rimuovere il tampone bloccante e sostituirlo con gli anticorpi primari anti-tirosina idrossilasi di coniglio e anti-neurofilamenti di pollo diluiti nel tampone bloccante (10% NGS in TBST) rispettivamente a 1:750 e 1:1000. Lasciare incubare gli anticorpi primari per una notte in una camera di umidità a temperatura ambiente.
6. Lavare il vetrino con TBST 3 volte, 10 minuti per ogni lavaggio, prima di applicare gli anticorpi secondari capra anti-coniglio 647 e capra anti-pollo 488, entrambi diluiti a 1:200 nel tampone bloccante. Lasciare incubare gli anticorpi secondari in una camera di umidità per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Lavare la guida con TBST 4 volte, 10 minuti per ogni lavaggio, e lasciare asciugare la guida in un'area protetta dalla luce prima del montaggio.
8. Immagine di sezioni nervose distanti almeno 40 μm l'una dall'altra su un microscopio a fluorescenza sull'obiettivo 10x.
9. Nelle Figi, raddrizza le sezioni nervose e disegna tre linee verticali posizionate in modo casuale che coprono la larghezza della sezione. Conta il numero di assoni che attraversano ciascuna linea verticale e dividilo per la larghezza della sezione sulla linea verticale. Ripeti per ciascuna delle tre linee verticali per sezione. Fare la media dei tre valori ottenuti per sezione e fare la media dei valori delle tre sezioni per nervo.

Risultati

Questo protocollo descrive la rimozione chirurgica di neuroni simpatici lombari postgangliari da un topo. Due topi hanno ricevuto simpatectomia lombare e due topi sono serviti come controlli. Per ottenere una simpatectomia lombare chirurgica di successo, è necessario ottenere un'adeguata visualizzazione almeno dei gangli simpatici lombari bilaterali L2 e L3, come mostrato nella Figura 1. La rimozione dei gangli L4 e L5 consentirebbe di ottenere la completa denervazione simpatica della parte...

Discussione

I gangli simpatici lombari sono strutture molto piccole situate dietro molti organi addominali critici e grandi vasi. Pertanto, questa procedura richiede una precisione e un'accuratezza significative. Gran parte della difficoltà risiede nell'identificare i gangli simpatici intraoperatoriamente. Si suggerisce che lo studente sia in grado di identificare i gangli in un cadavere di topo prima di tentare questa procedura in un topo vivo. La risoluzione dei problemi sarà spesso necessaria quando si identificano i gangli sim...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 absorable suture	CP Medical	421A
5-0 nylon suture	Med-Vet International	MV-661
70% ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-4L
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
Anesthesia Vaporizer	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
Betadine	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	#000664
Chicken anti-neurofilament-heavy	Abcam	ab72996
Cryostat	Leica	CM1850
Data Analysis Software	Prism
Fine-tipped tweezers	World Precision Instruments	500233
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A32931
Goat anti-rabbit 647	Invitrogen	A21245
Heating pad	Braintree Scientific	39DP
Image Analysis Software	Fiji
Imaging Software	Nikon	NIS-Elements
Isoflurane	Med-Vet International	RXISO-250
Meloxicam	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
Needle driver	Roboz Surgical Store	RS-7894
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
Ophthalmic ointment	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant mice	Jackson Laboratory	#016223, #007914
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase	Abcam	ab112
Small straight scissors	Fine Science Tools	14084-09
Sterile cotton swabs 2x2	Dynarex	3252
Sterile cotton tipped applicators	Dynarex	4301
Sterile drape	Med-Vet International	DR4042
Sterile saline solution	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG mutant mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers	strain #017262-UCD	Jackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant mice	European Mouse Mutant Archive	strain #00254	Jackson Laboratory, strain #007914