استخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي ، باستخدام أمثلة على إنزيمات ligase و nuclease و polymerase. يستخدم الفحص قليل النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت وغير المسماة والتي يمكن دمجها لتشكيل دوبلكس تحاكي أضرار الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي أو وسيطة المسار ، مما يسمح بتوصيف سلوك الإنزيم.

Abstract

سمح توفر مجموعة من قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة من البائعين التجاريين بتطوير مقايسات متطورة لتوصيف الخصائص المتنوعة لإنزيمات استقلاب الحمض النووي التي يمكن تشغيلها في أي مختبر بيولوجيا جزيئية قياسي. جعل استخدام الملصقات الفلورية هذه الطرق في متناول الباحثين الذين لديهم معدات PAGE الكهربائية القياسية وجهاز تصوير يدعم الفلورسنت ، دون استخدام مواد مشعة أو الحاجة إلى مختبر مصمم لتخزين وإعداد المواد المشعة ، أي مختبر ساخن. يمكن أن تؤدي الإضافة الاختيارية للتعديلات القياسية مثل الفسفرة إلى تبسيط إعداد الفحص ، في حين يمكن استخدام الدمج المحدد للنيوكليوتيدات المعدلة التي تحاكي تلف الحمض النووي أو المواد الوسيطة لاستكشاف جوانب محددة من سلوك الإنزيم. هنا ، يتم عرض تصميم وتنفيذ المقايسات لاستجواب العديد من جوانب معالجة الحمض النووي بواسطة الإنزيمات باستخدام oligonucleotides الاصطناعية المتاحة تجاريا. وتشمل هذه قدرة الأربطة على الانضمام أو النيوكليازات على تحلل الهياكل الهجينة المختلفة للحمض النووي والحمض النووي الريبي ، واستخدام العامل المساعد التفاضلي بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي ، وتقييم قدرة ربط الحمض النووي للإنزيمات. تتم مناقشة العوامل التي يجب مراعاتها عند تصميم ركائز النوكليوتيدات الاصطناعية ، ويتم توفير مجموعة أساسية من oligonucleotides التي يمكن استخدامها لمجموعة من فحوصات إنزيم الحمض النووي ، والبلمرة ، ومقايسات إنزيم النيوكلياز.

Introduction

تتطلب جميع أشكال الحياة إنزيمات معالجة الحمض النووي لتنفيذ العمليات الحيوية الأساسية، بما في ذلك التضاعف والنسخ وإصلاح الحمض النووي (DNA). الوظائف الأنزيمية الرئيسية لهذه المسارات هي البلمرة ، التي تولد نسخا من جزيئات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي ، والأربطة التي تنضم إلى ركائز عديد النوكليوتيد ، والنيوكليازات التي تحللها ، واللوليكات و topoisomerases ، التي تذوب دوبلكس الحمض النووي أو تغير طوبولوجيتها^{1،2،3،4،5،6،7}

Protocol

1. تصميم وشراء قليل النوكليوتيدات

ملاحظة: صمم قليل النيوكليوتيدات أحادية الشريط ليتم تجميعها وتلدينها في الدوبلكس المطلوب. يجب أن يحمل واحد أو أكثر من الخيوط في دوبلكس جزءا من الفلورسنت لتتبع معالجة قليل النوكليوتيد بواسطة الإنزيم محل الاهتمام. وترد في الجدول 1 مجموعة أساسية من التسلسلات المفردة التي يمكن تجميعها لمجموعة من الأنشطة.

1. قم بدمج التعديلات المحددة اللازمة للإنزيم محل الاهتمام كما هو موضح أدناه.
   1. بالنسبة لركائز إنزيم ربط الحمض النووي (الشكل 1): قم بتجميع أبسط ركيزة من ثلاثة قليل النيوكليوتيدات: حبلا مانحا مفسفرا 5 بوصات (NL2) ، وشريط متقبل يحمل علامة F....

النتائج

الربط بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي
سيؤدي النشاط الأنزيمي لإنزيم ربط الحمض النووي إلى زيادة في حجم قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت عند تصوره على هلام اليوريا PAGE. في حالة الركائز لكل من ربط الحمض النووي والحمض النووي الريبي المدرجة في الجدول 2 ، فإن هذا يتوافق مع مضا.......

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
تصميم وشراء قليل النوكليوتيد: عند شراء قليل النوكليوتيدات لتشكيل مزدوج ، من الضروري مراعاة تصميم التسلسل. يوصى باستخدام أداة محلل oligo للتنبؤ بخصائص تسلسل النوكليوتيدات ، مثل محتوى GC ، ودرجة حرارة الانصهار ، والبنية الثانوية ، وإمكانية dimerization ، قب?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers