Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

Abstract

La disponibilità di una gamma di oligonucleotidi sintetici modificati da fornitori commerciali ha permesso lo sviluppo di saggi sofisticati per caratterizzare diverse proprietà degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici che possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare standard. L'uso di etichette fluorescenti ha reso questi metodi accessibili ai ricercatori con apparecchiature standard per elettroforesi PAGE e un imager abilitato alla fluorescenza, senza utilizzare materiali radioattivi o richiedere un laboratorio progettato per lo stoccaggio e la preparazione di materiali radioattivi, ad esempio un Hot Lab. L'aggiunta opzionale di modifiche standard come la fosforilazione può semplificare la configurazione del saggio, mentre l'incorporazione specifica di nucleotidi modificati che imitano i danni al DNA o gli intermedi può essere utilizzata per sondare aspetti specifici del comportamento enzimatico. Qui vengono dimostrate la progettazione e l'esecuzione di saggi per interrogare diversi aspetti dell'elaborazione del DNA da parte di enzimi utilizzando oligonucleotidi sintetici disponibili in commercio. Questi includono la capacità delle ligasi di unirsi o delle nucleasi di degradare diverse strutture ibride di DNA e RNA, l'uso differenziale del cofattore da parte della DNA ligasi e la valutazione della capacità di legare il DNA degli enzimi. Vengono discussi i fattori da considerare nella progettazione di substrati nucleotidici sintetici e viene fornito un set di base di oligonucleotidi che possono essere utilizzati per una serie di saggi enzimatici di ligasi, polimerasi e nucleasi degli acidi nucleici.

Introduzione

Tutte le forme di vita richiedono enzimi di elaborazione dell'acido nucleico per eseguire processi biologici fondamentali, tra cui la replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA. Le principali funzionalità enzimatiche per queste vie sono le polimerasi, che generano copie di molecole di RNA/DNA, le ligasi che si uniscono ai substrati polinucleotidici, le nucleasi che le degradano, e le elicasi e le topoisomerasi, che fondono duplex di acidi nucleici o ne modificano la topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Inoltre, molti di questi enzimi forniscono strumenti molecolari essenziali per applicazioni come il clonaggio, la diagnostica e il sequenziamento ad alto rendimento 11,12,13,14,15.

Le caratteristiche funzionali, la cinetica e le specificità del substrato di questi enzimi possono essere determinate utilizzando substrati di DNA/RNA marcati prodotti mediante ricottura di oligonucleotidi. Il tracciamento dei substrati e dei prodotti è stato tradizionalmente ottenuto introducendo un'etichetta radioattiva (³²P) all'estremità del filamento 5', che può quindi essere rilevata da una pellicola fotografica o con un sistema di imaging al fosforo^16,17. Mentre i substrati radiomarcati offrono il vantaggio di una maggiore sensibilità sperimentale e non alterano le proprietà chimiche di un nucleotide, i potenziali rischi per la salute derivanti dal lavoro con i radioisotopi hanno incoraggiato lo sviluppo di marcature di acidi nucleici non radioattivi per fornire un'alternativa più sicura per la rilevazione di DNA e RNA 18,19,20. Tra questi, il rilevamento della fluorescenza, incluso il rilevamento diretto della fluorescenza, la fluorescenza risolta nel tempo e i saggi di trasferimento di energia/estinzione della fluorescenza si distinguono come i più versatili 21,22,23,24. L'ampia gamma di fluorofori consente diversi design di substrati di DNA/RNA con reporter unici su ciascun oligonucleotide²⁵. Inoltre, la stabilità dei fluorofori, rispetto ai radioisotopi, consente agli utenti di produrre e conservare quantità significative di substrati di DNA marcati in fluorescenza¹⁹. Questi substrati marcati con fluorofori possono essere incubati con la proteina di interesse, insieme a diverse combinazioni di cofattori metallici e nucleotidici, per analizzare il legame e/o l'attività enzimatica. La visualizzazione del legame o dell'attività può essere osservata utilizzando vari canali di coloranti fluorofori con un sistema di imaging su gel. Poiché con questa tecnica saranno visibili solo gli oligonucleotidi marcati in fluorescenza, qualsiasi aumento o diminuzione delle dimensioni dell'oligonucleotide marcato sarà facile da seguire. I gel possono anche essere colorati in seguito, con coloranti coloranti per acidi nucleici per visualizzare tutte le bande di DNA presenti sul gel.

Le ligasi degli acidi polinucleici sono enzimi che uniscono frammenti di DNA/RNA, catalizzando la sigillatura delle rotture mediante la formazione di un legame fosfodiestere tra i terminali del DNA fosforilato 5' e l'OH 3' del DNA. Possono essere divisi in due gruppi in base al loro requisito di substrato nucleotidico. Le ligasi NAD-dipendenti altamente conservate si trovano in tutti i batteri²⁶, mentre gli enzimi ATP-dipendenti, strutturalmente diversi, possono essere identificati in tutti i domini della vita ^8,27. Le DNA ligasi svolgono un ruolo importante nell'elaborazione dei frammenti di Okazaki durante la replicazione, oltre ad essere coinvolte in varie vie di riparazione del DNA, come la riparazione per escissione di nucleotidi e basi, attraverso la sigillatura di intaccature spontanee e intaccature che rimangono dopo la riparazione ^8,10. Diverse DNA ligasi mostrano diverse capacità di unire diverse conformazioni di rotture del DNA, tra cui intaccature in un duplex, rotture a doppio filamento, disallineamenti e lacune, nonché ibridi di RNA e DNA 28,29,30. Una vasta gamma di substrati legabili può essere assemblata mediante ricottura di oligonucleotidi con un fosfato 5' per generare termini 5' e 3' giustapposti in un duplex di acido nucleico 31,32,33. Il metodo di analisi più comune è la risoluzione mediante urea PAGE in un formato di saggio end-point; Tuttavia, le recenti innovazioni hanno incluso l'uso dell'elettroforesi su gel capillare, che consente un'elevata produttività³⁴, la profilazione spettrometrica di massa³⁵, nonché un saggio beacon molecolare omogeneo, che consente il monitoraggio risolto nel tempo³⁶.

Il primo passo in una reazione di legatura è l'adenilazione dell'enzima ligasi da parte dell'adenosina trifosfato (ATP) o della nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), risultando in un intermedio enzimatico covalente. Il secondo passo della reazione è l'adenilazione del substrato dell'acido nucleico all'estremità 5' del sito di nick, che è seguita dalla legatura dei filamenti di nick dell'acido nucleico. Molti enzimi ligasi che sono espressi in modo ricombinante in E. coli sono purificati nella forma adenilata e, quindi, sono in grado di legare con successo gli acidi nucleici senza l'aggiunta di un cofattore nucleotidico. Ciò rende difficile determinare quale particolare tipo di cofattore nucleotidico sono necessari per la legatura degli acidi nucleici. Oltre a descrivere i saggi per valutare l'attività della DNA ligasi, viene presentato anche un metodo per determinare in modo affidabile l'uso del cofattore de-adenilando l'enzima utilizzando substrati non marcati.

Le nucleasi sono un gruppo ampio e diversificato di enzimi che modificano il DNA/RNA e RNA catalitici che scindono i legami fosfodiestere tra gli acidi nucleici³⁷. Le funzionalità dell'enzima nucleasi sono necessarie nella replicazione, riparazione e processazione dell'RNA del DNA e possono essere classificate in base alla loro specificità zuccherina per DNA, RNA o entrambi. Le endonucleasi idrolizzano i legami fosfodiestere all'interno di un filamento di DNA/RNA, mentre le esonucleasi idrolizzano i filamenti di DNA/RNA un nucleotide alla volta dall'estremità 3' o 5' e possono farlo sia dall'estremità 3' a 5' che da 5' a 3' del DNA³⁸.

Mentre molte proteine nucleasi sono aspecifiche e possono essere coinvolte in più processi, altre sono altamente specifiche per una particolare sequenza o danno al DNA ^6,39,40. Le nucleasi sequenza-specifiche sono utilizzate in un'ampia gamma di applicazioni biotecnologiche, come la clonazione, la mutagenesi e l'editing del genoma. Le nucleasi popolari per queste applicazioni sono le nucleasi di restrizione⁴¹, le nucleasi a dita di zinco⁴², le nucleasi effettrici simili ad attivatori trascrizionali e, più recentemente, le nucleasi CRISPR ingegnerizzate guidate dall'RNA⁴³. Recentemente sono state identificate nucleasi danno-specifiche, come la nucleasi EndoMS, che ha specificità per i mismatch nel DNA attraverso il suo dominio ^5,44 della nucleasi RecB-like mismatch-specific. I saggi di attività nucleasica, storicamente, sono stati eseguiti come saggi discontinui con substrati radiomarcati; Tuttavia, oltre agli altri inconvenienti, questi non consentono l'identificazione del sito che viene tagliato da una proteina nucleasi, cosa possibile quando si utilizzano substrati marcati in fluorescenza ^45,46. Più recentemente, sono stati sviluppati saggi di nucleasi continua che funzionano utilizzando diversi coloranti di DNA che interagiscono con il DNA in stati diversi; ad esempio, emettendo un segnale fluorescente più elevato quando interagisce con il dsDNA rispetto al suo stato non legato, o legandosi specificamente a RNA corti⁴⁷. Altri saggi di nucleasi continua utilizzano forcine di DNA con un gruppo fluoroforo sul 5' e un quencher sull'estremità 3' in modo che la fluorescenza aumenti man mano che l'oligonucleotide viene degradato a causa di una separazione del fluoroforo e del quencher⁴⁸. Sebbene questi saggi consentano di caratterizzare la cinetica delle proteine che degradano il DNA, richiedono una conoscenza preliminare della funzione e del substrato dell'enzima e sono anche limitati agli enzimi che modificano la conformazione del DNA per causare una differenza nel legame del colorante. Per questo motivo, i saggi endpoint che risolvono i singoli prodotti nucleasici sono ancora auspicabili per fornire informazioni sulle modifiche del DNA causate dall'attività proteica.

Qui, viene presentata una procedura dettagliata per la progettazione di oligonucleotidi DNA/RNA marcati in fluorescenza che possono essere miscelati e abbinati per generare substrati per testare l'attività di nuovi enzimi nucleasi, polimerasi e ligasi. La convalida di questo set di base di sequenze oligonucleotidiche semplifica la progettazione sperimentale e facilita la profilazione economica di un'ampia gamma di funzionalità enzimatiche senza la necessità di acquistare un gran numero di substrati su misura. Viene fornita una procedura dettagliata per l'esecuzione di un saggio enzimatico standard di elaborazione del DNA con questi substrati, utilizzando l'esempio dell'attività della DNA ligasi e vengono descritte le modifiche per il saggio e l'analisi degli enzimi nucleasi e polimerasi. Inoltre, viene fornito un test modificato per determinare la specificità del cofattore dell'enzima DNA ligasi con elevata precisione e vengono utilizzate sonde a doppia marcatura per valutare l'assemblaggio di legature multicomponente. Infine, vengono discusse le modifiche al formato del saggio di base per consentirne l'utilizzo per determinare le interazioni proteina-DNA con gli stessi substrati mediante il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA).

Protocollo

1. Progettazione e acquisto di oligonucleotidi

NOTA: Progettare oligonucleotidi a singolo filamento da assemblare e ricuocere nei duplex desiderati. Uno o più filamenti in un duplex devono avere una porzione fluorescente per tracciare l'elaborazione degli oligonucleotidi da parte dell'enzima di interesse. Nella Tabella 1 viene fornito un set di base di sequenze a singolo filamento che possono essere assemblate per una vasta gamma di attività.

1. Incorporare le modifiche specifiche necessarie per l'enzima di interesse come descritto di seguito.
   1. Per i substrati della DNA ligasi (Figura 1): assemblare il substrato più semplice da tre oligonucleotidi: un filamento donatore fosforilato 5' (NL2), un filamento accettore marcato con FAM 5' (NL1) e un complemento che collega i due (NL3).
      1. Assicurarsi che i fili che forniscono il termine 5' dell'intaccatura legabile siano fosforilati prima dell'assemblaggio della miscela master del substrato nel passaggio 2. Ordinalo come modifica su NL2 (come indicato nella Tabella 1) o usa la fosforilazione enzimatica con la polinucleotide chinasi T4 dopo aver risospeso gli oligonucleotidi.
      2. Include la fosforilazione 5'-terminale di NL6 e NL8, che comprendono il complemento di rotture a doppio filamento raffigurate nella Figura 1A (NL6/NL7 e NL8/NL9) in quanto questo assomiglia molto al substrato naturale prodotto da un'endonucleasi di restrizione. Utilizzare un substrato a doppia marcatura per determinare le estensioni relative della legatura per assemblaggi in più parti (vedere il passaggio 6).
      3. Modificare il filamento del complemento per produrre disallineamenti (NL10) e lacune (NL11).
         NOTA: Le variazioni sul substrato intaccato semplice sono illustrate nella Figura 1A. È possibile utilizzare altre sequenze per produrre una gamma ancora più ampia di disallineamenti o spazi più lunghi variando la posizione sottolineata.
      4. Sostituire gli oligonucleotidi del DNA con gli oligonucleotidi dell'RNA.
         NOTA: Le variazioni sul substrato semplice intaccato sono illustrate nella Figura 1B. Una gamma più ampia di duplex DNA/RNA può essere generata da combinazioni aggiuntive del set di basi qui fornito per generare, ad esempio, rotture a doppio filamento contenenti sia RNA che DNA. Un esempio di questa variazione è fornito nel passaggio 6 di seguito, in cui viene utilizzata una strategia a doppia etichetta.
   2. Per i substrati della DNA polimerasi: assemblare gli oligonucleotidi NL1 e NL3 elencati nella Tabella 1 per fornire un semplice saggio di estensione del primer. Studiare ulteriori aspetti dell'attività della polimerasi introducendo modifiche nei filamenti NL1 (primer) o NL3 (modello).
      1. Incorporare analoghi di base danneggiati nell'oligonucleotide NL3 prima della posizione 20 per determinare la capacità di bypassare le lesioni danneggiate sul filamento stampo.
      2. Incorporare analoghi di base danneggiati nell'oligonucleotide NL1 in posizione 20 per determinare la capacità di estendere un primer danneggiato.
      3. Utilizzare RNL1 o RNL3 nel duplex per studiare l'estensione di un primer di RNA o l'uso di un modello di RNA.
   3. Per i substrati nucleasi (Figura 2): assemblare gli oligonucleotidi per fornire una gamma non esaustiva di substrati a doppio e singolo filamento (Figura 2Ai), nonché una gamma di giunzioni sbattute e allargate (Figura 2Aii) e substrati danneggiati (Figura 2B).
      1. Per sondare le attività della ribonucleasi, sostituire iterativamente NL1, NL2 e NL3 con RNL1, RNL2 e RNL3. Utilizzare versioni aggiuntive di RNA di HJ5 e HJ6 per espandere ulteriormente questo set.
      2. Utilizzare oligonucleotidi MD5, MD6 e MD9 che hanno una modifica posizionata centralmente che imita il danno ossidativo, un intermedio di riparazione abasico o un prodotto di deaminazione (Figura 2B). I substrati rileveranno la scissione del filamento in questa posizione. Etichettare il filamento NL3 del complemento con un fluoroforo ortogonale come TAMRA per rilevare la scissione del doppio filamento (vedere il passaggio 6).
      3. Utilizzare la marcatura ortogonale del complemento per rilevare il taglio a doppio filamento nei siti non corrispondenti sia sulla sonda (NL5 e ND9) che sui filamenti del complemento (MD10 e NL10).
2. Ordina oligonucleotidi sintetici che incorporano fluorofori pertinenti e altre modifiche da un fornitore commerciale.
   NOTA: Per i saggi descritti sono disponibili una scala di sintesi da 100 nM e la purificazione HPLC successiva alla sintesi.

2. Assemblaggio e ricottura di duplex di acidi nucleici

1. Risospensione e diluizione di oligonucleotidi
   1. Prima dell'apertura, centrifugare gli oligonucleotidi liofilizzati nelle loro provette da 2 ml alla massima velocità in una centrifuga da banco per 2-5 minuti per assicurarsi che l'acido nucleico si trovi sul fondo della provetta.
   2. Preparare un master stock di 100 μM risospendendo gli oligonucleotidi nel tampone TE [10 mM di tris(idrossimetil)amminometano (Tris), 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)). Assicurarsi che gli oligonucleotidi siano completamente risospesi mediante vortice delicato ripetuto e breve centrifugazione a piena velocità.
   3. Preparare un materiale da 10 μM diluendo un'aliquota di stock master con tampone TE. Diluire il brodo da 10 μM con acqua ultrapura (acqua MQ) per preparare materiali di lavoro con concentrazioni di 0,5 μM, 0,7 μM o 2,5 μM come da Tabella 2.
2. Assemblaggio e ricottura delle miscele master di reazione
   1. Utilizzare le scorte di lavoro per la composizione delle miscele madri di reazione utilizzando le combinazioni fornite nella tabella 2 e i volumi indicati nella tabella 3. Per il test standard della DNA ligasi e la maggior parte degli altri test qui descritti, la composizione finale del tampone è 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM Ditiotreitolo (DTT) con 10 mM Mg come catione bivalente.
   2. Ricuocere gli oligonucleotidi in una provetta per PCR o microcentrifuga riscaldandoli a 95 °C per 5 minuti utilizzando un blocco riscaldante o un termociclatore. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti (volumi <1 mL) a 1 h (volumi >1 mL). Per oligonucleotidi più lunghi (>40 nt), eseguire un raffreddamento più lento utilizzando un termociclatore con una rampa di discesa da 95 °C a 25 °C per 45 minuti, oppure far galleggiare il tubo contenente la miscela di ricottura in un becher da 1 litro di acqua bollente e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per una notte.
   3. Aggiungere cofattori nucleotidici e altri componenti tampone sensibili al calore alla miscela master dopo il raffreddamento a temperatura ambiente. Utilizzare la miscela di reazione finale direttamente per il saggio mediante l'aggiunta di enzima (vedere la fase 3 di seguito) o conservare a -20 °C per un uso futuro.

3. Configurazione standard del saggio

1. Assemblaggio e avvio della reazione di saggio
   1. Combinare 22,5 μl della miscela master del substrato di interesse con 2,5 μl della DNA ligasi o di un altro enzima di interesse in una provetta per PCR. Esegui le reazioni in doppio o triplice copia, soprattutto se i risultati saranno quantitati.
   2. Includere un controllo senza proteine (solo tampone) nei campioni di analisi. A questo punto non includere controlli di cofattori, se necessario.
      NOTA: Gli enzimi possono essere conservati a -20 °C in glicerolo al 50% v/v, consentendo loro di essere pipettati direttamente dalla soluzione. Assicurarsi che le soluzioni enzimatiche con glicerolo siano ben miscelate prima dell'aggiunta, pipettando per miscelare o agitando delicatamente.
2. Trasferire immediatamente le reazioni in una macchina per PCR a 25 °C e incubare per 30 minuti. Variare la temperatura e la durata a seconda delle condizioni ottimali per l'attività enzimatica.
3. Estinguere le reazioni aggiungendo 5 μL di colorante di carico (95% di formammide, acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA), blu di bromofenolo) e incubare a 95 °C per 5 minuti.

4. Analisi dei risultati dei saggi

1. Preparare i gel Tris-Borato-EDTA (TBE)-Urea PAGE come descritto di seguito.
   1. Preparare una scorta di acrilammide al 20%, 7 M di urea e 1x soluzione di TBE. Per il set di oligonucleotidi qui descritto, utilizzare la soluzione di acrilammide/bis in un rapporto 29:1 per una risoluzione ottimale.
   2. Per un gel, combinare 10 mL di acrilammide al 20% e una soluzione di urea 7 M con 100 μL di APS (10%) e 3 μL di tetrametiletilendiammina (TMED) e gettare in una rotella di gel.
2. Dopo che il gel si è solidificato, eseguire i campioni sul gel di urea TBE a 45 - 55 °C.
   1. Pre-rotolare il gel in 1x tampone TBE per 30 minuti a 10 mA per gel con riscaldamento esterno.
   2. Rimuovere l'urea in eccesso nei pozzetti del gel sciacquando con 1x TBE utilizzando una pipetta da pascolo.
   3. Caricare 10 μL di ciascuna reazione e far funzionare a 10 mA per 1,0-1,5 ore con riscaldamento esterno.
3. Visualizza il gel sull'imager con le impostazioni corrette per il fluoroforo scelto. Per la FAM, utilizzare un set di filtri che fornisca eccitazione/emissione a 495/519 nm, che viene memorizzato come preimpostato nella maggior parte degli imager.
4. Quantificare l'intensità della banda del prodotto e del substrato utilizzando il software di elaborazione delle immagini con l'imager o un programma esterno come ImageJ^49,50 e calcolare la percentuale del prodotto utilizzando la formula
   
   Dove P è il valore integrato della banda del prodotto e S è l'area integrata della banda del substrato. Nel caso della reazione della DNA ligasi, la banda del prodotto funziona a 40 nucleotidi (nt) e la banda del substrato a 20 nt.

5. De-adenilazione della DNA ligasi per testare la specificità del cofattore

1. Preparazione di master mix di reazione
   1. Preparare una serie della miscela master contenente l'oligonucleotide NL1 marcato con FAM come descritto nella Tabella 4. Preparare un secondo set contenente l'oligonucleotide NL1 senza etichetta FAM, come descritto nella Tabella 4.
   2. Separatamente, riscaldare entrambi i duplex di DNA a 95 °C per 5 minuti e raffreddare per 30 minuti a 1 ora a 25 °C. Non aggiungere cofattore nucleotidico a nessuna delle due miscele master.
2. Assemblaggio e inizio della reazione di de-dedenilazione
   1. Preparare una singola reazione di de-dedenilazione per ogni tipo/concentrazione di cofattore da testare combinando 10 μl della miscela master non marcata con 2,5 μl di enzima ligasi.
   2. Preparare provette aggiuntive come controllo senza cofattori e senza controllo proteico (2,5 μL di tampone aggiunti al posto dell'enzima).
   3. Incubare le reazioni a una temperatura specifica per l'attività ottimale dell'enzima, per 1-2 ore. Il tempo di incubazione può essere aumentato se l'enzima è ancora adenilato.
3. Esegui la reazione di legatura con il cofattore.
   1. Aggiungere 10 μl della miscela master marcata e 2,5 μl dei cofattori nucleotidici desiderati (ad es. ATP, NAD, ADP o GTP) direttamente alla reazione dedeninilata (concentrazione finale di 0,1-1 mM).
   2. Aggiungere 2,5 μl di tampone di reazione al controllo del cofattore senza nucleotidi.
   3. Incubare le reazioni per lo stesso periodo di tempo e temperatura utilizzati in precedenza. Spegni e visualizza come descritto nel passaggio 4.

6. Utilizzo di substrati a doppia marcatura per la legatura splinted o l'assemblaggio in più parti

1. Progettare e acquistare un oligonucleotide con una porzione fluorescente che abbia uno spettro di eccitazione/emissione diverso dal fluoroforo già utilizzato.
   1. Nella configurazione qui descritta, utilizzare l'oligonucleotide NL2 (TAMRA) con 5-carbossitetrametilrodamina (TAMRA) all'estremità 3' (Tabella 1).
2. Assemblare la miscela master come descritto di seguito.
   1. Combinare i componenti della reazione descritti al punto 2, compresi i rapporti equimolari di tutti gli oligonucleotidi utilizzati nell'assemblaggio, nonché i cationi tampone e bivalenti.
   2. Ricottura mediante riscaldamento a 95 °C per 5 min e raffreddamento a 25 °C per 30 min - 1 h. Aggiungere il cofattore e l'enzima e incubare come descritto nel passaggio 3.
3. Eseguire e visualizzare i campioni come descritto al punto 4 utilizzando i canali appropriati per la coppia di fluorofori nel substrato. Nel caso di FAM e TAMRA, si tratta dei canali della fluoresceina (FITC) e della tetrametilrodamina (TRITC) presenti sulla maggior parte degli imager.

7. Valutazione del legame del DNA mediante Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) su gel nativo

1. Preparare un gel TBE PAGE nativo al 10% come descritto di seguito.
   1. Combinare 2,5 mL di acrilammide al 40%, 1 mL di 10x TBE, 100 μL di APS al 10%, 3 μL di TMED e 6,5 mL di acqua MQ e gettare in una rotella di gel.
2. Assemblare la reazione di legame come descritto di seguito.
   1. Assemblare il substrato EMSA secondo la Tabella 5 in modo che l'EDTA (10 mM) sia incluso e gli ioni metallici siano omessi.
   2. Combinare 20 μl della master mix del substrato EMSA con 5 μl di proteina in una provetta per PCR. Includere un campione di controllo senza proteine. Incubare per 30 minuti a 25 °C.
3. Analizza mediante elettroforesi nativa come descritto di seguito.
   1. Aggiungere ai campioni 5 μl di colorante da carica nativo 5x (100 mM EDTA, 0,25% blu bromofenolo, 25% v/v glicerolo e acqua MQ fino a 1 mL).
   2. Caricare sul gel preparato e far funzionare a 60 V per 2-3 ore con raffreddamento mediante circolazione dell'acqua fino a quando il fronte del colorante si trova alcuni cm sopra l'estremità del gel.
   3. Visualizza e analizza i gel come descritto nel passaggio 4.

Risultati

Legatura mediante DNA ligasi
L'attività enzimatica della DNA ligasi si tradurrà in un aumento delle dimensioni dell'oligonucleotide marcato in fluorescenza quando visualizzato su un gel di urea PAGE. Nel caso dei substrati per la legatura del DNA e dell'RNA elencati nella Tabella 2, ciò corrisponde a un raddoppio delle dimensioni da 20 nt a 40 nt (Figura 3A). L'attività enzimatica ottimale può essere determinata modificando condizioni come la tempera...

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Progettazione e acquisto di oligonucleotidi: Quando si acquistano gli oligonucleotidi per la formazione di duplex, è essenziale considerare la progettazione della sequenza. Si consiglia di utilizzare uno strumento di analisi degli oligo per prevedere le proprietà della sequenza nucleotidica, come il contenuto di GC, la temperatura di fusione, la struttura secondaria e il potenziale di dimerizzazione, prima di ordinare⁵⁷.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers