Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

Abstract

La disponibilità di una gamma di oligonucleotidi sintetici modificati da fornitori commerciali ha permesso lo sviluppo di saggi sofisticati per caratterizzare diverse proprietà degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici che possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare standard. L'uso di etichette fluorescenti ha reso questi metodi accessibili ai ricercatori con apparecchiature standard per elettroforesi PAGE e un imager abilitato alla fluorescenza, senza utilizzare materiali radioattivi o richiedere un laboratorio progettato per lo stoccaggio e la preparazione di materiali radioattivi, ad esempio un Hot Lab. L'aggiunta opzionale di modifiche standard come la fosforilazione può semplificare la configurazione del saggio, mentre l'incorporazione specifica di nucleotidi modificati che imitano i danni al DNA o gli intermedi può essere utilizzata per sondare aspetti specifici del comportamento enzimatico. Qui vengono dimostrate la progettazione e l'esecuzione di saggi per interrogare diversi aspetti dell'elaborazione del DNA da parte di enzimi utilizzando oligonucleotidi sintetici disponibili in commercio. Questi includono la capacità delle ligasi di unirsi o delle nucleasi di degradare diverse strutture ibride di DNA e RNA, l'uso differenziale del cofattore da parte della DNA ligasi e la valutazione della capacità di legare il DNA degli enzimi. Vengono discussi i fattori da considerare nella progettazione di substrati nucleotidici sintetici e viene fornito un set di base di oligonucleotidi che possono essere utilizzati per una serie di saggi enzimatici di ligasi, polimerasi e nucleasi degli acidi nucleici.

Introduzione

Tutte le forme di vita richiedono enzimi di elaborazione dell'acido nucleico per eseguire processi biologici fondamentali, tra cui la replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA. Le principali funzionalità enzimatiche per queste vie sono le polimerasi, che generano copie di molecole di RNA/DNA, le ligasi che si uniscono ai substrati polinucleotidici, le nucleasi che le degradano, e le elicasi e le topoisomerasi, che fondono duplex di acidi nucleici o ne modificano la topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protocollo

1. Progettazione e acquisto di oligonucleotidi

NOTA: Progettare oligonucleotidi a singolo filamento da assemblare e ricuocere nei duplex desiderati. Uno o più filamenti in un duplex devono avere una porzione fluorescente per tracciare l'elaborazione degli oligonucleotidi da parte dell'enzima di interesse. Nella Tabella 1 viene fornito un set di base di sequenze a singolo filamento che possono essere assemblate per una vasta gamma di attività.

1. Incorporare le modifiche specifiche necessarie per l'enzima di interesse come descritto di seguito.
   1. Per i substrati della DNA ligasi (

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Progettazione e acquisto di oligonucleotidi: Quando si acquistano gli oligonucleotidi per la formazione di duplex, è essenziale considerare la progettazione della sequenza. Si consiglia di utilizzare uno strumento di analisi degli oligo per prevedere le proprietà della sequenza nucleotidica, come il contenuto di GC, la temperatura di fusione, la struttura secondaria e il potenziale di dimerizzazione, prima di ordinare⁵⁷.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers