Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Verfügbarkeit einer Reihe von modifizierten synthetischen Oligonukleotiden von kommerziellen Anbietern hat die Entwicklung ausgefeilter Assays zur Charakterisierung verschiedener Eigenschaften von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen ermöglicht, die in jedem Standardlabor für Molekularbiologie durchgeführt werden können. Die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen hat diese Methoden für Forscher mit Standard-PAGE-Elektrophoresegeräten und einem fluoreszenzfähigen Imager zugänglich gemacht, ohne dass radioaktive Materialien verwendet werden müssen oder ein Labor für die Lagerung und Aufbereitung von radioaktiven Materialien erforderlich ist, d. h. ein Hot Lab. Die optionale Hinzufügung von Standardmodifikationen wie Phosphorylierung kann den Assay-Aufbau vereinfachen, während der spezifische Einbau von modifizierten Nukleotiden, die DNA-Schäden oder Zwischenprodukte nachahmen, verwendet werden kann, um spezifische Aspekte des Enzymverhaltens zu untersuchen. Hier wird das Design und die Durchführung von Assays zur Untersuchung verschiedener Aspekte der DNA-Prozessierung durch Enzyme unter Verwendung kommerziell verfügbarer synthetischer Oligonukleotide demonstriert. Dazu gehören die Fähigkeit von Ligasen, sich zu verbinden, oder von Nukleasen, verschiedene DNA- und RNA-Hybridstrukturen abzubauen, die unterschiedliche Verwendung von Cofaktoren durch die DNA-Ligase und die Bewertung der DNA-Bindungskapazität von Enzymen. Faktoren, die bei der Entwicklung synthetischer Nukleotidsubstrate zu berücksichtigen sind, werden diskutiert, und es wird ein grundlegender Satz von Oligonukleotiden bereitgestellt, die für eine Reihe von Nukleinsäure-Ligasen-, Polymerase- und Nuklease-Enzym-Assays verwendet werden können.

Einleitung

Alle Lebensformen benötigen Nukleinsäure-verarbeitende Enzyme, um grundlegende biologische Prozesse durchzuführen, einschließlich Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Wichtige enzymatische Funktionalitäten für diese Signalwege sind Polymerasen, die Kopien von RNA/DNA-Molekülen erzeugen, Ligasen, die Polynukleotidsubstrate verbinden, Nukleasen, die sie abbauen, sowie Helikasen und Topoisomerasen, die Nukleinsäure-Duplexe schmelzen oder ihre Topologie verändern 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protokoll

1. Entwicklung und Kauf von Oligonukleotiden

HINWEIS: Entwerfen Sie einzelsträngige Oligonukleotide, die zu den gewünschten Duplexen zusammengebaut und geglüht werden sollen. Einer oder mehrere der Stränge in einem Duplex müssen eine fluoreszierende Einheit tragen, um die Oligonukleotidverarbeitung durch das interessierende Enzym zu verfolgen. Ein Basissatz von einzelsträngigen Sequenzen, die für eine Reihe von Aktivitäten assembliert werden können, ist in Tabelle 1 enthalten.

1. Integrieren Sie die spezifischen Modifikationen, die für das interessierende Enzym erforderlich sind, wie unten beschriebe....

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Oligonukleotiddesign und -kauf: Beim Kauf von Oligonukleotiden für die Duplexbildung ist es wichtig, das Sequenzdesign zu berücksichtigen. Es wird empfohlen, vor der Bestellung ein Oligo-Analysewerkzeug zu verwenden, um die Eigenschaften der Nukleotidsequenz wie GC-Gehalt, Schmelztemperatur, Sekundärstruktur und Dimerisierungspotenzial vorherzusagen⁵⁷.

Assemblierung und Annealing von Nukleinsäure-Duplexen: Bei der .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers