Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Özet

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Özet

Ticari satıcılardan bir dizi modifiye sentetik oligonükleotidin mevcudiyeti, herhangi bir standart moleküler biyoloji laboratuvarında çalıştırılabilen nükleik asit metabolize edici enzimlerin çeşitli özelliklerini karakterize etmek için karmaşık tahlillerin geliştirilmesine izin vermiştir. Floresan etiketlerin kullanılması, bu yöntemleri, radyoaktif malzemeler kullanmadan veya radyoaktif malzemelerin depolanması ve hazırlanması için tasarlanmış bir laboratuvar, yani bir Sıcak Laboratuvar gerektirmeden, standart PAGE elektroforez ekipmanı ve floresan özellikli bir görüntüleyiciye sahip araştırmacılar için erişilebilir hale getirmiştir. Fosforilasyon gibi standart modifikasyonların isteğe bağlı olarak eklenmesi, tahlil kurulumunu basitleştirebilirken, DNA hasarlarını veya ara ürünleri taklit eden modifiye edilmiş nükleotidlerin spesifik olarak dahil edilmesi, enzim davranışının belirli yönlerini araştırmak için kullanılabilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen sentetik oligonükleotidler kullanılarak enzimler tarafından DNA işlemenin çeşitli yönlerini sorgulamak için tahlillerin tasarımı ve yürütülmesi gösterilmektedir. Bunlar, ligazların farklı DNA ve RNA hibrit yapılarını bozmak için ligazların birleşme veya nükleazların yeteneğini, DNA ligaz tarafından diferansiyel kofaktör kullanımını ve enzimlerin DNA bağlama kapasitesinin değerlendirilmesini içerir. Sentetik nükleotid substratları tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken faktörler tartışılır ve bir dizi nükleik asit ligaz, polimeraz ve nükleaz enzim tahlili için kullanılabilecek temel bir oligonükleotid seti sağlanır.

Giriş

Tüm yaşam formları, replikasyon, transkripsiyon ve DNA onarımı dahil olmak üzere temel biyolojik süreçleri gerçekleştirmek için nükleik asit işleme enzimlerine ihtiyaç duyar. Bu yollar için temel enzimatik işlevler, RNA/DNA moleküllerinin kopyalarını üreten polimerazlar, polinükleotid substratlarına katılan ligazlar, bunları bozan nükleazlar ve nükleik asit duplekslerini eriten veya topolojilerini değiştiren helikazlar ve topoizomerazlardır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Ek olarak, bu enzimlerin birçoğu klonlama, teşhis ve yüksek verimli dizileme gibi uygulamalar için gerekli moleküler araçları sağlar 11,12,13,14,15.

Bu enzimlerin fonksiyonel özellikleri, kinetiği ve substrat özgüllükleri, oligonükleotidlerin tavlanmasıyla üretilen etiketli DNA/RNA substratları kullanılarak belirlenebilir. Alt tabakaların ve ürünlerin izlenmesi geleneksel olarak, daha sonra fotoğraf filmi veya bir fosfor görüntüleme sistemi^16,17 ile tespit edilebilen 5' iplikçik ucuna bir radyoaktif etiket (³²P) yerleştirilerek gerçekleştirilmiştir. Radyoaktif işaretli substratlar, artan deneysel hassasiyet avantajı sunarken ve bir nükleotidin kimyasal özelliklerini değiştirmezken, radyoizotoplarla çalışmaktan kaynaklanan potansiyel sağlık tehlikeleri, DNA ve RNA tespiti için daha güvenli bir alternatif sağlamak için radyoaktif olmayan nükleik asit etiketlemesinin geliştirilmesini teşvik etmiştir 18,19,20. Bunlar arasında, doğrudan floresan algılama, zamana bağlı floresan ve enerji transferi/floresan söndürme testleri dahil olmak üzere floresan algılama, en çok yönlü 21,22,23,24 olarak öne çıkıyor. Geniş florofor dizisi, her oligonükleotid²⁵ üzerinde benzersiz raporlayıcılar içeren farklı DNA/RNA substratları tasarımlarını mümkün kılar. Ek olarak, floroforların stabilitesi, radyoizotoplarla karşılaştırıldığında, kullanıcıların önemli miktarlarda floresan etiketli DNA substratları üretmesine ve korumasına olanak tanır¹⁹. Bu florofor etiketli substratlar, bağlanma ve/veya enzim aktivitesini analiz etmek için farklı metal ve nükleotid kofaktör kombinasyonları ile birlikte ilgilenilen protein ile inkübe edilebilir. Jel görüntüleme sistemi ile çeşitli florofor boya kanalları kullanılarak bağlanma veya aktivitenin görselleştirilmesi gözlemlenebilir. Bu teknik kullanılarak yalnızca floresan olarak işaretlenmiş oligonükleotidler görülebileceğinden, etiketli oligonükleotidin boyutundaki herhangi bir artış veya azalmayı takip etmek kolay olacaktır. Jeller daha sonra, jel üzerinde bulunan tüm DNA bantlarını görselleştirmek için nükleik asit boyama boyaları ile de boyanabilir.

Poli-nükleik asit ligazları, DNA/RNA fragmanlarını birleştiren, 5' fosforile DNA terminalleri ile DNA'nın 3' OH'si arasında bir fosfodiester bağı oluşturarak kırılmaların sızdırmazlığını katalize eden enzimlerdir. Nükleotid substrat gereksinimlerine göre iki gruba ayrılabilirler. Yüksek oranda korunmuş NAD'ye bağımlı ligazlar tüm bakterilerde^{bulunur 26} yapısal olarak çeşitli ATP'ye bağımlı enzimler yaşamın tüm alanlarında tanımlanabilir ^8,27. DNA ligazları, replikasyon sırasında Okazaki fragmanının işlenmesinde önemli bir rol oynamanın yanı sıra, onarımdan sonra kalan spontan çentiklerin ve çentiklerin sızdırmazlığı yoluyla nükleotid ve baz eksizyon onarımı gibi çeşitli DNA onarım yollarında yer alır ^8,10. Farklı DNA ligazları, çift yönlü çentikler, çift sarmallı kırılmalar, uyumsuzluklar ve boşlukların yanı sıra RNA ve DNA hibritleri 28,29,30 dahil olmak üzere farklı DNA kırılma konformasyonlarını birleştirmek için değişen kapasiteler sergiler. Bir nükleik asit dubleks^31,32,33'te yan yana 5' ve 3' terminaller oluşturmak için oligonükleotidlerin 5' fosfat ile tavlanmasıyla çok çeşitli ligatlanabilir substratlar birleştirilebilir. En yaygın analiz yöntemi, bir uç nokta tahlil formatında üre PAGE ile çözünürlüktür; Bununla birlikte, son yenilikler arasında, yüksek verime³⁴, kütle spektrometrik profillemeye³⁵ izin veren kılcal jel elektroforezinin yanı sıra zamana bağlı izlemeye³⁶ izin veren homojen bir moleküler işaret testinin kullanımı yer almaktadır.

Bir ligasyon reaksiyonundaki ilk adım, ligaz enziminin adenozin trifosfat (ATP) veya Nikotinamid adenin dinükleotidi (NAD) ile aderilasyonudur ve bu da bir kovalent enzim ara maddesi ile sonuçlanır. Reaksiyondaki ikinci adım, çentik bölgesinin 5' ucundaki nükleik asit substratının adenilasyonudur, bunu nükleik asit çentik ipliklerinin ligasyonu takip eder. E. coli'de rekombinant olarak eksprese edilen birçok ligaz enzimi, adenillenmiş formda saflaştırılır ve bu nedenle, bir nükleotid kofaktörü eklenmeden nükleik asitleri başarılı bir şekilde bağlayabilir. Bu, nükleik asitlerin ligasyonu için hangi belirli tipte nükleotid kofaktörüne ihtiyaç duyduklarını belirlemeyi zorlaştırır. DNA ligaz aktivitesini değerlendirmek için tahlilleri tanımlamaya ek olarak, etiketlenmemiş substratlar kullanarak enzimi dedenilasyon yaparak kofaktör kullanımını güvenilir bir şekilde belirlemek için bir yöntem de sunulmaktadır.

Nükleazlar, nükleik asitler³⁷ arasındaki fosfodiester bağlarını parçalayan geniş ve çeşitli bir DNA/RNA modifiye edici enzimler ve katalitik RNA'lar grubudur. Nükleaz enzim işlevleri, DNA replikasyonu, onarımı ve RNA işlemede gereklidir ve DNA, RNA veya her ikisi için şeker özgüllüklerine göre sınıflandırılabilir. Endonükleazlar, bir DNA/RNA zinciri içindeki fosfodiester bağlarını hidrolize ederken, eksonükleazlar DNA/RNA zincirlerini 3' veya 5' ucundan her seferinde bir nükleotidi hidrolize eder ve bunu DNA'nın 3' ila 5' veya 5' ila 3' ucundan yapabilir³⁸.

Birçok nükleaz proteini spesifik değildir ve birden fazla süreçte yer alabilirken, diğerleri belirli bir dizi veya DNA hasarı için oldukça spesifiktir ^6,39,40. Diziye özgü nükleazlar, klonlama, mutajenez ve genom düzenleme gibi çok çeşitli biyoteknolojik uygulamalarda kullanılır. Bu uygulamalar için popüler nükleazlar, kısıtlama nükleazları⁴¹, çinko parmak nükleazları⁴², transkripsiyonel aktivatör benzeri efektör nükleazlar ve en son olarak, RNA güdümlü tasarlanmış CRISPR nükleazları^43'tür. Uyumsuzluğa özgü RecB benzeri nükleaz alanı ^5,44 aracılığıyla DNA'daki uyumsuzluklar için özgüllüğe sahip olan EndoMS nükleaz gibi hasara özgü nükleazlar yakın zamanda tanımlanmıştır. Nükleaz aktivite deneyleri, tarihsel olarak, radyoaktif işaretli substratlar ile süreksiz deneyler olarak yapılmıştır; Bununla birlikte, diğer dezavantajlarına ek olarak, bunlar, floresan etiketli substratlar^45,46 kullanıldığında mümkün olan bir nükleaz proteini tarafından kesilen bölgenin tanımlanmasına izin vermez. Daha yakın zamanlarda, farklı durumlarda DNA ile etkileşime giren farklı DNA boyaları kullanarak çalışan sürekli nükleaz tahlilleri geliştirilmiştir; örneğin, dsDNA ile etkileşime girdiğinde, bağlanmamış durumundan daha yüksek bir floresan sinyali yaymak veya spesifik olarak kısa RNA'lara^{bağlanmak 47}. Diğer sürekli nükleaz tahlilleri, 5' ucunda bir florofor grubu ve 3' ucunda bir söndürücü bulunan DNA saç tokaları kullanır, böylece florofor ve söndürücü^48'in ayrılması nedeniyle oligonükleotid bozuldukça floresan artar. Bu tahliller, DNA parçalayıcı proteinlerin kinetiğini karakterize etmeye izin verirken, enzimin işlevi ve substratı hakkında önceden bilgi gerektirir ve ayrıca boya bağlanmasında bir farka neden olmak için DNA konformasyonunu değiştiren enzimlerle sınırlıdır. Bu nedenle, tek tek nükleaz ürünlerini çözen son nokta tahlilleri, protein aktivitesinin neden olduğu DNA modifikasyonları hakkında bilgi sağlamak için hala arzu edilir.

Burada, yeni nükleaz, polimeraz ve ligaz enzimlerinin aktivitesini test etmek için substratlar oluşturmak üzere karıştırılabilen ve eşleştirilebilen floresan etiketli DNA/RNA oligonükleotidlerinin tasarımı için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu temel oligonükleotid dizileri setinin doğrulanması, deneysel tasarımı basitleştirir ve çok sayıda ısmarlama substrat satın almaya gerek kalmadan çok çeşitli enzimatik işlevlerin ekonomik profilini çıkarmayı kolaylaştırır. DNA ligaz aktivitesi örneği kullanılarak, bu substratlarla standart bir DNA işleme enzim testinin çalıştırılması için ayrıntılı bir prosedür sağlanmıştır ve nükleaz ve polimeraz enzimlerinin tahlil edilmesi ve analiz edilmesi için modifikasyonlar açıklanmaktadır. Ek olarak, DNA ligaz enziminin kofaktör özgüllüğünü yüksek doğrulukla belirlemek için modifiye edilmiş bir test verilir ve çok bileşenli ligasyonların montajını değerlendirmek için çift etiketli problar kullanılır. Son olarak, elektroforetik hareketlilik kaydırma testi (EMSA) ile aynı substratlarla protein-DNA etkileşimlerini belirlemek için kullanılmasına izin vermek için temel tahlil formatındaki modifikasyonlar tartışılmaktadır.

Protokol

1. Oligonükleotidlerin tasarımı ve satın alınması

NOT: İstenilen dublekslere monte edilecek ve tavlanacak tek sarmallı oligonükleotidler tasarlayın. Bir dubleks içindeki ipliklerden biri veya daha fazlası, ilgilenilen enzim tarafından oligonükleotid işlemesini izlemek için bir floresan parçası taşımalıdır. Bir dizi aktivite için bir araya getirilebilen tek sarmallı dizilerin temel bir seti Tablo 1'de verilmiştir.

1. Aşağıda tarif edildiği gibi ilgilenilen enzim için gerekli olan spesifik modifikasyonları dahil edin.
   1. DNA ligaz substratları için (Şekil 1): Üç oligonükleotidden en basit substratı birleştirin: 5' fosforile donör zincir (NL2), 5' FAM etiketli alıcı zincir (NL1) ve ikisini köprüleyen bir tamamlayıcı (NL3).
      1. Ligatable çentiğin 5' terminalini sağlayan tellerin, 2. adımda substrat ana karışımının montajından önce fosforile edildiğinden emin olun. Bunu NL2 üzerinde bir modifikasyon olarak sipariş edin ( Tablo 1'de verildiği gibi) veya oligonükleotidleri yeniden süspanse ettikten sonra T4 polinükleotid kinaz ile enzimatik fosforilasyon kullanın.
      2. Şekil 1A'da (NL6 / NL7 ve NL8 / NL9) gösterilen çift sarmallı kırılmaların tamamlayıcısını içeren NL6 ve NL8'in 5'-terminal fosforilasyonunu içerir, çünkü bu, bir kısıtlama endonükleazından üretilen doğal substrata en çok benzer. Çok parçalı montajlar için ligasyonun göreli kapsamlarını belirlemek için çift etiketli bir alt tabaka kullanın (bkz. adım 6).
      3. Uyumsuzluklar (NL10) ve boşluklar (NL11) oluşturmak için kompleman ipliğini değiştirin.
         NOT: Basit çentikli alt tabaka üzerindeki varyasyonlar Şekil 1A'da gösterilmiştir. Altı çizili konumu değiştirerek daha da geniş bir uyumsuzluk aralığı veya daha uzun boşluklar üretmek için diğer dizileri kullanmak mümkündür.
      4. RNA oligonükleotidleri için DNA oligonükleotidlerini değiştirin.
         NOT: Basit çentikli alt tabaka üzerindeki varyasyonlar Şekil 1B'de gösterilmiştir. Daha geniş bir DNA/RNA dupleksleri aralığı, örneğin hem RNA hem de DNA içeren çift sarmallı kırılmalar oluşturmak için burada verilen temel setin ek kombinasyonları ile oluşturulabilir. Bu varyasyonun bir örneği, çift etiketli bir stratejinin kullanıldığı aşağıdaki 6. adımda verilmiştir.
   2. DNA polimeraz substratları için: Basit bir primer-uzatma testi vermek için Tablo 1'de listelenen oligonükleotidler NL1 ve NL3'ü birleştirin. NL1 (primer) veya NL3 (şablon) ipliklerine modifikasyonlar uygulayarak polimeraz aktivitesinin ek yönlerini araştırın.
      1. Şablon iplikçik üzerindeki hasarlı lezyonları atlama yeteneğini belirlemek için hasarlı baz analoglarını 20. pozisyondan önce NL3 oligonükleotidine dahil edin.
      2. Hasarlı bir astarı uzatma yeteneğini belirlemek için hasarlı baz analoglarını 1 pozisyonundaki NL20 oligonükleotidine dahil edin.
      3. Bir RNA primerinin uzantısını veya bir RNA şablonunun kullanımını araştırmak için dubleks içinde RNL1 veya RNL3 kullanın.
   3. Nükleaz substratları için (Şekil 2): Oligonükleotidleri, kapsamlı olmayan bir çift ve tek sarmallı substrat aralığı (Şekil 2Ai) ve ayrıca bir dizi kanatlı ve yayvan bağlantı noktası (Şekil 2Aii) ve hasarlı substratlar (Şekil 2B) verecek şekilde birleştirin.
      1. Ribonükleaz aktivitelerini araştırmak için, yinelemeli olarak NL1, NL2 ve NL3'ü RNL1, RNL2 ve RNL3 ile değiştirin. Bu seti daha da genişletmek için HJ5 ve HJ6'nın ek RNA versiyonlarını kullanın.
      2. Oksidatif hasarı, abazik bir onarım ara ürününü veya bir deaminasyon ürününü taklit eden merkezi olarak yerleştirilmiş bir modifikasyona sahip oligonükleotidler MD5, MD6 ve MD9'u kullanın (Şekil 2B). Alt tabakalar bu konumda ipliğin bölünmesini algılayacaktır. Çift iplikli bölünmeyi tespit etmek için tamamlayıcı NL3 zincirini TAMRA gibi ortogonal bir florofor ile etiketleyin (bkz. adım 6).
      3. Hem prob (NL5 ve ND9) hem de kompleman (MD10 ve NL10) ipliklerindeki uyumsuz bölgelerde çift sarmallı kesmeyi tespit etmek için tamamlayıcının ortogonal etiketlemesini kullanın.
2. Ticari bir satıcıdan ilgili floroforları ve diğer modifikasyonları içeren sentetik oligonükleotidler sipariş edin.
   NOT: Açıklanan tahliller için 100 nM'lik bir sentez ölçeği ve sentezi takiben HPLC saflaştırması uygundur.

2. Nükleik asit dublekslerinin montajı ve tavlanması

1. Oligonükleotidlerin yeniden süspansiyonu ve seyreltilmesi
   1. Açmadan önce, nükleik asidin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için liyofilize oligonükleotidleri 2 mL'lik tüplerinde 2-5 dakika tezgah üstü bir santrifüjde tam hızda santrifüjleyin.
   2. Oligonükleotidleri TE tamponunda (10 mM tris (hidroksimetil) aminometan (Tris), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)) içinde yeniden süspanse ederek 100 μM'lik bir ana stok hazırlayın. Oligonükleotidlerin, tekrarlanan yumuşak girdaplama ve tam hızda kısa santrifüjleme ile iyice yeniden süspanse edildiğinden emin olun.
   3. Ana stoğun bir kısmını TE tamponu ile seyrelterek 10 μM'lik bir stok hazırlayın. Tablo 2'ye göre 0,5 μM, 0,7 μM veya 2,5 μM konsantrasyonlarda çalışma stokları hazırlamak için 10 μM stoğu ultra saf su (MQ su) ile seyreltin.
2. Reaksiyon ana karışımlarının montajı ve tavlanması
   1. Tablo 2'de verilen kombinasyonları ve Tablo 3'te verilen hacimleri kullanarak reaksiyon ana karışımlarını oluşturmak için çalışma stoklarını kullanın. Standart DNA ligaz testi ve burada açıklanan diğer tahlillerin çoğu için, nihai tampon bileşimi, iki değerlikli katyon olarak 10 mM Mg ile 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM Ditiyotreitol'dür (DTT).
   2. Oligonükleotidleri bir PCR veya mikrosantrifüj tüpünde bir ısıtma bloğu veya termosikleter kullanarak 95 ° C'de 5 dakika ısıtarak tavlayın. 30 dakika (hacim <1 mL) ila 1 saat (hacim >1 mL) oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Daha uzun oligonükleotidler (>40 nt) için, 45 dakika boyunca 95 ° C ila 25 ° C arasında bir aşağı rampaya sahip bir termosikler kullanarak daha yavaş soğutma gerçekleştirin veya tavlama karışımı içeren tüpü 1 L'lik bir kaynar su kabında yüzdürün ve gece boyunca oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
   3. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra ana karışıma nükleotid kofaktörleri ve diğer ısıya duyarlı tampon bileşenleri ekleyin. Enzim ilavesiyle son reaksiyon karışımını doğrudan test için kullanın (aşağıdaki 3. adıma bakın) veya ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.

3. Standart tahlil kurulumu

1. Tahlil reaksiyonunun montajı ve başlatılması
   1. 22.5 μL'lik ilgilenilen substrat ana karışımını 2.5 μL DNA ligaz veya bir PCR tüpünde ilgilenilen diğer enzim ile birleştirin. Reaksiyonları iki veya üç kopya halinde çalıştırın, özellikle de sonuçlar niceliksel olarak belirlenecekse.
   2. Tahlil numunelerine protein içermeyen bir kontrol (yalnızca tampon) ekleyin. Gerekirse, bu noktada hiçbir kofaktör denetimi eklemeyin.
      NOT: Enzimler -20 °C'de %50 v/v gliserol içinde saklanabilir, bu da doğrudan çözeltiden pipetlenmelerine olanak tanır. Gliserol içeren enzim çözeltilerinin, karıştırmak için pipetleme veya hafif girdaplama yoluyla eklemeden önce iyice karıştırıldığından emin olun.
2. Reaksiyonları hemen 25 °C'de bir PCR makinesine aktarın ve 30 dakika inkübe edin. Enzim aktivitesi için en uygun koşullara bağlı olarak sıcaklığı ve süreyi değiştirin.
3. 5 μL yükleme boyası (%95 formamid, 0.5 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), bromofenol mavisi) ekleyerek reaksiyonları söndürün ve 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.

4. Tahlil sonuçlarının analizi

1. Tris-Borat-EDTA (TBE)-Üre PAGE jellerini aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
   1. %20 akrilamid, 7 M Üre ve 1x TBE çözeltisinden oluşan bir stok hazırlayın. Burada açıklanan oligonükleotid seti için, optimum çözünürlük için 29:1 oranında Akrilamid/Bis Çözeltisi kullanın.
   2. Bir jel için, 10 mL %20 akrilamid ve 7 M üre çözeltisini 100 μL APS (%10) ve 3 μL Tetrametiletilendiamin (TMED) ile birleştirin ve bir jel tekerine dökün.
2. Jel katılaştıktan sonra, numuneleri TBE üre jeli üzerinde 45 - 55 °C'de çalıştırın.
   1. Jeli, harici ısıtma ile jel başına 10 mA'da 30 dakika boyunca 1x TBE tamponunda önceden çalıştırın.
   2. Bir mera pipeti kullanarak 1x TBE ile yıkayarak jelin kuyucuklarındaki fazla üreyi çıkarın.
   3. Her reaksiyondan 10 μL yükleyin ve harici ısıtma ile 1.0-1.5 saat boyunca 10 mA'da çalıştırın.
3. Seçilen florofor için doğru ayarlarla görüntüleyici üzerindeki jeli görselleştirin. FAM için, çoğu görüntüleyicide önceden ayarlanmış olarak saklanan 495/519 nm'de uyarma/emisyon veren bir filtre seti kullanın.
4. Görüntüleyici ile görüntü işleme yazılımı veya ImageJ^49,50 gibi harici bir program kullanarak ürünün ve alt tabakanın bant yoğunluğunu ölçün ve aşağıdaki formülü kullanarak ürünün yüzdesini hesaplayın:
   
   Burada P , ürün bandının entegre değeridir ve S , alt tabaka bandının entegre alanıdır. DNA ligaz reaksiyonu örneğinde, ürün bandı 40 nükleotidde (nt) ve substrat bandı 20 nt'de çalışır.

5. Kofaktör özgüllüğünü test etmek için DNA ligazın de-adenilasyonu

1. Reaksiyon ana karışımlarının hazırlanması
   1. Tablo 4'te tarif edildiği gibi FAM etiketli NL1 oligonükleotidi içeren bir ana karışım seti hazırlayın. Tablo 1'te açıklandığı gibi, FAM etiketi olmayan NL4 oligonükleotidi içeren ikinci bir set hazırlayın.
   2. Ayrı olarak, her iki DNA dupleksini 5 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın ve 25 °C'de 30 dakika ila 1 saat soğutun. Her iki ana karışıma da nükleotid kofaktörü eklemeyin.
2. De-adenilasyon reaksiyonunun montajı ve başlatılması
   1. Etiketlenmemiş ana karışımın 10 μL'sini 2.5 μL ligaz enzimi ile birleştirerek test edilecek her kofaktör tipi/konsantrasyonu için tek bir de-adenilasyon reaksiyonu hazırlayın.
   2. Kofaktör kontrolü olmayan ve protein kontrolü olmayan ek tüpler hazırlayın (enzim yerine 2.5 μL tampon eklenir).
   3. Reaksiyonları, enzimin optimum aktivitesine özgü bir sıcaklıkta 1-2 saat inkübe edin. Enzim hala adenile edilmişse inkübasyon süresi arttırılabilir.
3. Ligasyon reaksiyonunu kofaktör ile çalıştırın.
   1. Etiketli ana karışımdan 10 μL ve istenen nükleotid kofaktörlerinden 2.5 μL ekleyin (ör., ATP, NAD, ADP veya GTP) doğrudan de-adenillenmiş reaksiyona (0.1-1 mM nihai konsantrasyon).
   2. Nükleotidsiz kofaktör kontrolüne 2.5 μL reaksiyon tamponu ekleyin.
   3. Reaksiyonları daha önce kullanılanla aynı zaman periyodu ve sıcaklık için inkübe edin. 4. adımda açıklandığı gibi söndürün ve görselleştirin.

6. Splinted ligasyon veya çok parçalı montaj için çift etiketli alt tabakaların kullanılması

1. Halihazırda kullanılan florofordan farklı bir uyarma / emisyon spektrumuna sahip floresan parçalı bir oligonükleotid tasarlayın ve satın alın.
   1. Burada açıklanan kurulumda, 3' ucunda 5-Karboksitetrametilrodamin (TAMRA) bulunan NL2 (TAMRA) oligonükleotid kullanın (Tablo 1).
2. Ana karışımı aşağıda açıklandığı gibi birleştirin.
   1. Montajda kullanılan tüm oligonükleotidlerin eşmolar oranlarının yanı sıra tampon ve iki değerlikli katyonlar da dahil olmak üzere adım 2'de açıklanan reaksiyonun bileşenlerini birleştirin.
   2. 95 °C'de 5 dakika ısıtarak ve 25 °C'de 30 dakika - 1 saat soğutarak tavlayın. Kofaktör ve enzimi ekleyin ve 3. adımda anlatıldığı gibi inkübe edin.
3. Alt tabakadaki florofor çifti için uygun kanalları kullanarak numuneleri 4. adımda açıklandığı gibi çalıştırın ve görüntüleyin. FAM ve TAMRA söz konusu olduğunda, bunlar çoğu görüntüleyicide bulunan Floresein (FITC) ve Tetrametil rodamin (TRITC) kanallarıdır.

7. Doğal jel üzerinde Elektroforetik Mobilite Kaydırma Testi (EMSA) ile DNA bağlanmasının değerlendirilmesi

1. Aşağıda açıklandığı gibi %10 doğal bir TBE PAGE jeli hazırlayın.
   1. 2.5 mL %40 akrilamid, 1 mL 10x TBE, 100 μL %10 APS, 3 μL TMED ve 6.5 mL MQ suyu birleştirin ve bir jel tekeri içine dökün.
2. Bağlanma reaksiyonunu aşağıda açıklandığı gibi birleştirin.
   1. EMSA alt tabakasını Tablo 5'e göre birleştirin, böylece EDTA (10 mM) dahil edilir ve metal iyonları atlanır.
   2. 20 μL EMSA substrat ana karışımını bir PCR tüpünde 5 μL protein ile birleştirin. Protein içermeyen bir kontrol örneği ekleyin. 25 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. Aşağıda açıklandığı gibi yerel elektroforez ile analiz edin.
   1. Numunelere 5 μL 5x doğal yükleme boyası (100 mM EDTA, %0,25 bromofenol mavisi, %25 v/v gliserol ve 1 mL'ye kadar MQ su) ekleyin.
   2. Hazırlanan jeli yükleyin ve boya önü jelin ucunun birkaç cm üzerinde olana kadar su sirkülasyonu ile soğutarak 2-3 saat boyunca 60 V'ta çalıştırın.
   3. Jelleri 4. adımda açıklandığı gibi görselleştirin ve analiz edin.

Sonuçlar

DNA ligaz ile ligasyon
DNA ligaz enzimatik aktivitesi, bir üre PAGE jeli üzerinde görselleştirildiğinde floresan olarak işaretlenmiş oligonükleotidin boyutunda bir artışa neden olacaktır. Tablo 2'de listelenen hem DNA hem de RNA ligasyonu için substratlar söz konusu olduğunda, bu, 20 nt'den 40 nt'ye iki katına çıkan bir boyuta karşılık gelir (Şekil 3A). Optimal enzim aktivitesi, sıcaklık, protein konsantrasyonu veya inkübasyon sür...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
Oligonükleotid tasarımı ve satın alma: Dubleks oluşumu için oligonükleotidleri satın alırken, dizi tasarımını dikkate almak önemlidir. ⁵⁷ siparişinden önce GC içeriği, erime sıcaklığı, ikincil yapı ve dimerizasyon potansiyeli gibi nükleotid dizisinin özelliklerini tahmin etmek için bir oligo analizör aracının kullanılması önerilir.

Nükleik asit duplekslerinin montajı ve tavlanması: RNA/RN...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers