Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Özet

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Özet

Ticari satıcılardan bir dizi modifiye sentetik oligonükleotidin mevcudiyeti, herhangi bir standart moleküler biyoloji laboratuvarında çalıştırılabilen nükleik asit metabolize edici enzimlerin çeşitli özelliklerini karakterize etmek için karmaşık tahlillerin geliştirilmesine izin vermiştir. Floresan etiketlerin kullanılması, bu yöntemleri, radyoaktif malzemeler kullanmadan veya radyoaktif malzemelerin depolanması ve hazırlanması için tasarlanmış bir laboratuvar, yani bir Sıcak Laboratuvar gerektirmeden, standart PAGE elektroforez ekipmanı ve floresan özellikli bir görüntüleyiciye sahip araştırmacılar için erişilebilir hale getirmiştir. Fosforilasyon gibi standart modifikasyonların isteğe bağlı olarak eklenmesi, tahlil kurulumunu basitleştirebilirken, DNA hasarlarını veya ara ürünleri taklit eden modifiye edilmiş nükleotidlerin spesifik olarak dahil edilmesi, enzim davranışının belirli yönlerini araştırmak için kullanılabilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen sentetik oligonükleotidler kullanılarak enzimler tarafından DNA işlemenin çeşitli yönlerini sorgulamak için tahlillerin tasarımı ve yürütülmesi gösterilmektedir. Bunlar, ligazların farklı DNA ve RNA hibrit yapılarını bozmak için ligazların birleşme veya nükleazların yeteneğini, DNA ligaz tarafından diferansiyel kofaktör kullanımını ve enzimlerin DNA bağlama kapasitesinin değerlendirilmesini içerir. Sentetik nükleotid substratları tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken faktörler tartışılır ve bir dizi nükleik asit ligaz, polimeraz ve nükleaz enzim tahlili için kullanılabilecek temel bir oligonükleotid seti sağlanır.

Giriş

Tüm yaşam formları, replikasyon, transkripsiyon ve DNA onarımı dahil olmak üzere temel biyolojik süreçleri gerçekleştirmek için nükleik asit işleme enzimlerine ihtiyaç duyar. Bu yollar için temel enzimatik işlevler, RNA/DNA moleküllerinin kopyalarını üreten polimerazlar, polinükleotid substratlarına katılan ligazlar, bunları bozan nükleazlar ve nükleik asit duplekslerini eriten veya topolojilerini değiştiren helikazlar ve topoizomerazlardır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protokol

1. Oligonükleotidlerin tasarımı ve satın alınması

NOT: İstenilen dublekslere monte edilecek ve tavlanacak tek sarmallı oligonükleotidler tasarlayın. Bir dubleks içindeki ipliklerden biri veya daha fazlası, ilgilenilen enzim tarafından oligonükleotid işlemesini izlemek için bir floresan parçası taşımalıdır. Bir dizi aktivite için bir araya getirilebilen tek sarmallı dizilerin temel bir seti Tablo 1'de verilmiştir.

1. Aşağıda tarif edildiği gibi ilgilenilen enzim için gerekli olan spesifik modifikasyonları dahil edin.
   1. DNA ligaz substratları için (Şekil 1): Üç oligon....

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
Oligonükleotid tasarımı ve satın alma: Dubleks oluşumu için oligonükleotidleri satın alırken, dizi tasarımını dikkate almak önemlidir. ⁵⁷ siparişinden önce GC içeriği, erime sıcaklığı, ikincil yapı ve dimerizasyon potansiyeli gibi nükleotid dizisinin özelliklerini tahmin etmek için bir oligo analizör aracının kullanılması önerilir.

Nükleik asit duplekslerinin montajı ve tavlanması: RNA/RN.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers