Utilisation d’oligonucléotides synthétiques modifiés pour doser des enzymes métabolisant des acides nucléiques

Résumé

Ici, un protocole pour doser les enzymes métabolisant les acides nucléiques est présenté, à l’aide d’exemples d’enzymes ligase, nucléase et polymérase. Le test utilise des oligonucléotides marqués par fluorescence et non marqués qui peuvent être combinés pour former des duplex imitant les dommages à l’ARN et/ou à l’ADN ou les intermédiaires de voie, permettant la caractérisation du comportement enzymatique.

Résumé

La disponibilité d’une gamme d’oligonucléotides synthétiques modifiés auprès de fournisseurs commerciaux a permis la mise au point de tests sophistiqués pour caractériser diverses propriétés des enzymes métabolisantes des acides nucléiques qui peuvent être exécutés dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire standard. L’utilisation d’étiquettes fluorescentes a rendu ces méthodes accessibles aux chercheurs disposant d’un équipement d’électrophorèse PAGE standard et d’un imageur fluorescent, sans utiliser de matières radioactives ni nécessiter un laboratoire conçu pour le stockage et la préparation de matières radioactives, c’est-à-dire un laboratoire chaud. L’ajout facultatif de modifications standard telles que la phosphorylation peut simplifier la configuration du test, tandis que l’incorporation spécifique de nucléotides modifiés qui imitent les dommages à l’ADN ou les intermédiaires peut être utilisée pour sonder des aspects spécifiques du comportement enzymatique. Ici, la conception et l’exécution de tests pour interroger plusieurs aspects du traitement de l’ADN par des enzymes à l’aide d’oligonucléotides synthétiques disponibles dans le commerce sont démontrées. Il s’agit notamment de la capacité des ligases à se joindre ou des nucléases à dégrader différentes structures hybrides d’ADN et d’ARN, de l’utilisation différentielle de cofacteurs par l’ADN ligase et de l’évaluation de la capacité de liaison à l’ADN des enzymes. Les facteurs à prendre en compte lors de la conception de substrats nucléotidiques synthétiques sont discutés, et un ensemble de base d’oligonucléotides pouvant être utilisés pour une gamme de dosages de ligase d’acide nucléique, de polymérase et d’enzymes nucléases est fourni.

Introduction

Toutes les formes de vie ont besoin d’enzymes de traitement des acides nucléiques pour mener à bien les processus biologiques fondamentaux, notamment la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les principales fonctionnalités enzymatiques de ces voies sont les polymérases, qui génèrent des copies de molécules d’ARN/ADN, les ligases qui se joignent aux substrats polynucléotidiques, les nucléases qui les dégradent, et les hélicases et topoisomérases, qui font fondre les duplex d’acide nucléique ou modifient leur topologie 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protocole

1. Conception et achat d’oligonucléotides

REMARQUE : Concevez des oligonucléotides monobrin à assembler et à recuire dans les duplex souhaités. Un ou plusieurs des brins d’un duplex doivent porter une fraction fluorescente pour suivre le traitement des oligonucléotides par l’enzyme d’intérêt. Le tableau 1 présente un ensemble de base de séquences monocaténaires pouvant être assemblées pour une gamme d’activités.

1. Incorporer les modifications spécifiques nécessaires pour l’enzyme d’intérêt, comme décrit ci-dessous.
   1. Pour les substrats d’ADN ligase (Figure 1) : Ass....

Résultats

Ligature par l’ADN ligase
L’activité enzymatique de l’ADN ligase entraînera une augmentation de la taille de l’oligonucléotide marqué par fluorescence lorsqu’elle est visualisée sur un gel d’urée PAGE. Dans le cas des substrats pour la ligature de l’ADN et de l’ARN énumérés dans le tableau 2, cela correspond à un doublement de la taille de 20 nt à 40 nt (figure 3A). L’activité enzymatique optimale peut être déterminée par .......

Discussion

Étapes critiques du protocole
Conception et achat d’oligonucléotides : Lors de l’achat d’oligonucléotides pour la formation duplex, il est essentiel de prendre en compte la conception de séquences. Il est recommandé d’utiliser un outil d’analyse d’oligonucléotides pour prédire les propriétés de la séquence nucléotidique, telles que la teneur en GC, la température de fusion, la structure secondaire et le potentiel de dimérisation, avant d’en commander⁵⁷

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers