핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

요약

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

초록

상업 공급업체의 다양한 변형 합성 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있게 됨에 따라 모든 표준 분자 생물학 실험실에서 실행할 수 있는 핵산 대사 효소의 다양한 특성을 특성화할 수 있는 정교한 분석을 개발할 수 있었습니다. 형광 라벨을 사용함으로써 연구자들은 방사성 물질을 사용하거나 방사성 물질의 저장 및 준비를 위해 설계된 실험실(예: Hot Lab)을 필요로 하지 않고 표준 PAGE 전기영동 장비와 형광 지원 이미저를 사용하여 이러한 방법에 액세스할 수 있게 되었습니다. 인산화(phosphorylation)와 같은 표준 변형을 선택적으로 추가하면 분석 설정을 단순화할 수 있으며, DNA 손상 또는 중간체를 모방하는 변형된 뉴클레오티드의 특정 통합을 사용하여 효소 행동의 특정 측면을 조사할 수 있습니다. 여기에서는 상업적으로 이용 가능한 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 효소에 의한 DNA 처리의 여러 측면을 조사하기 위한 분석의 설계 및 실행을 보여줍니다. 여기에는 서로 다른 DNA 및 RNA 하이브리드 구조를 분해하는 리가아제의 결합 능력 또는 뉴클레아제의 능력, DNA 리가아제에 의한 차별적 보조인자 사용, 효소의 DNA 결합 능력 평가가 포함됩니다. 합성 뉴클레오티드 기질을 설계할 때 고려해야 할 요인에 대해 논의하고, 다양한 핵산 리가아제, 중합효소 및 뉴클레아제 효소 분석에 사용할 수 있는 기본 올리고뉴클레오티드 세트를 제공합니다.

서문

모든 생명체는 복제, 전사 및 DNA 복구를 포함한 기본적인 생물학적 과정을 수행하기 위해 핵산 처리 효소를 필요로 합니다. 이러한 경로에 대한 주요 효소 기능은 RNA/DNA 분자의 복사본을 생성하는 중합효소, 폴리뉴클레오티드 기질을 결합하는 리가아제, 이를 분해하는 뉴클레아제, 핵산 이중체를 녹이거나 토폴로지를 변경하는 헬리카제 및 토포이소머라제입니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 또한, 이러한 효소의 대부분은 클로닝, 진단 및 고처리량 시퀀싱 11,12,13,14,15와 같은 응용 분야에

프로토콜

1. 올리고뉴클레오티드의 설계 및 구매

참고: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 설계하여 원하는 듀플렉스로 조립하고 어닐링합니다. 듀플렉스에 있는 하나 이상의 가닥은 관심 효소에 의한 올리고뉴클레오티드 처리를 추적하기 위해 형광 부분을 가져야 합니다. 다양한 활동을 위해 조립할 수 있는 단일 가닥 서열의 기본 세트가 표 1에 나와 있습니다.

1. 아래에 설명된 대로 관심 효소에 필요한 특정 변형을 통합합니다.
   1. DNA 리가아제 기질의 경우(그림 1): 5' 인산화 공여체 가닥(NL2), 5' FAM 표지 수용체 가닥(NL1) 및 둘을 연결하는 보체(NL3)의 세 가지 올리고뉴클레오티드에서 가장 간단한 기질을 조립합니다.
      1. ligatable nick의 5' 말단을 제공하는 가닥이 2단계에서 기판 마스터 믹스를 조립하기 전에 인산화되었는지 확인합니다. 이것을 NL2에 대한 변형으로 주문하거나( 표 1에 제시된 대로) 올리고뉴클레오티드를 재현탁한 후 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 함께 효소 인산화를 사용하십시오.
      2. 그....

토론

프로토콜의 중요한 단계
올리고뉴클레오티드 설계 및 구매: 이중 형성을 위한 올리고뉴클레오티드를 구매할 때는 염기서열 설계를 고려하는 것이 필수적입니다. ⁵⁷을 주문하기 전에 올리고 분석기 도구를 사용하여 GC 함량, 용융 온도, 2차 구조 및 이합체화 전위와 같은 뉴클레오티드 서열의 특성을 예측하는 것이 좋습니다.

핵산 듀플렉스의 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers