Использование модифицированных синтетических олигонуклеотидов для анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты

Резюме

Здесь представлен протокол анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, с использованием примеров ферментов лигазы, нуклеазы и полимеразы. В анализе используются флуоресцентно меченые и немеченые олигонуклеотиды, которые могут быть объединены для образования дуплексов, имитирующих повреждения РНК и/или ДНК или промежуточные пути, что позволяет охарактеризовать поведение фермента.

Аннотация

Доступность ряда модифицированных синтетических олигонуклеотидов от коммерческих поставщиков позволила разработать сложные анализы для характеристики различных свойств ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, которые могут быть запущены в любой стандартной лаборатории молекулярной биологии. Использование флуоресцентных меток сделало эти методы доступными для исследователей со стандартным оборудованием для электрофореза PAGE и флуоресцентным тепловизором, не используя радиоактивные материалы и не требуя лаборатории, предназначенной для хранения и подготовки радиоактивных материалов, т.е. горячей лаборатории. Необязательное добавление стандартных модификаций, таких как фосфорилирование, может упростить настройку анализа, в то время как специфическое включение модифицированных нуклеотидов, которые имитируют повреждения ДНК или промежуточные продукты, может быть использовано для исследования конкретных аспектов поведения фермента. Здесь демонстрируется разработка и проведение анализов для изучения нескольких аспектов процессинга ДНК ферментами с использованием коммерчески доступных синтетических олигонуклеотидов. К ним относятся способность лигаз присоединяться или нуклеазы разрушать различные гибридные структуры ДНК и РНК, дифференциальное использование кофактора ДНК-лигазой и оценка ДНК-связывающей способности ферментов. Обсуждаются факторы, которые следует учитывать при проектировании синтетических нуклеотидных субстратов, а также приводится базовый набор олигонуклеотидов, которые могут быть использованы для ряда анализов лигазы нуклеиновой кислоты, полимеразы и нуклеазного фермента.

Введение

Все формы жизни нуждаются в ферментах, процессирующих нуклеиновые кислоты, для осуществления фундаментальных биологических процессов, включая репликацию, транскрипцию и репарацию ДНК. Ключевыми ферментативными функциями для этих путей являются полимеразы, которые генерируют копии молекул РНК/ДНК, лигазы, которые присоединяются к полинуклеотидным субстратам, нуклеазы, которые разрушают их, а также геликазы и топоизомеразы, которые расплавляют дуплексы нуклеиновых кислот или изменяют их топологию 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

протокол

1. Разработка и закупка олигонуклеотидов

Примечание: Проектирование одноцепочечных олигонуклеотидов для сборки и отжига в желаемые дуплексы. Одна или несколько цепей в дуплексе должны содержать флуоресцентный фрагмент для отслеживания процесса олигонуклеотида интересующим ферментом. Базовый набор одноцепочечных последовательностей, которые могут быть собраны для ряда действий, представлен в таблице 1.

1. Включите конкретные модификации, необходимые для интересующего фермента, как описано ниже.
   1. Для субстратов ДНК-лигазы (рис. 1): Соберите простейший субстрат из тре....

Результаты

Лигирование по ДНК-лигазе
Ферментативная активность ДНК-лигазы приведет к увеличению размера флуоресцентно меченного олигонуклеотида при визуализации на геле мочевины PAGE. В случае субстратов для лигирования ДНК и РНК, перечисленных в таблице 2, это соответствует у.......

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Дизайн и покупка олигонуклеотидов: При покупке олигонуклеотидов для образования дуплекса важно учитывать дизайн последовательности. Рекомендуется использовать инструмент олигоанализатора для прогнозирования свойств нуклеотидной последоват.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers