Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Здесь представлен протокол анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, с использованием примеров ферментов лигазы, нуклеазы и полимеразы. В анализе используются флуоресцентно меченые и немеченые олигонуклеотиды, которые могут быть объединены для образования дуплексов, имитирующих повреждения РНК и/или ДНК или промежуточные пути, что позволяет охарактеризовать поведение фермента.
Доступность ряда модифицированных синтетических олигонуклеотидов от коммерческих поставщиков позволила разработать сложные анализы для характеристики различных свойств ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, которые могут быть запущены в любой стандартной лаборатории молекулярной биологии. Использование флуоресцентных меток сделало эти методы доступными для исследователей со стандартным оборудованием для электрофореза PAGE и флуоресцентным тепловизором, не используя радиоактивные материалы и не требуя лаборатории, предназначенной для хранения и подготовки радиоактивных материалов, т.е. горячей лаборатории. Необязательное добавление стандартных модификаций, таких как фосфорилирование, может упростить настройку анализа, в то время как специфическое включение модифицированных нуклеотидов, которые имитируют повреждения ДНК или промежуточные продукты, может быть использовано для исследования конкретных аспектов поведения фермента. Здесь демонстрируется разработка и проведение анализов для изучения нескольких аспектов процессинга ДНК ферментами с использованием коммерчески доступных синтетических олигонуклеотидов. К ним относятся способность лигаз присоединяться или нуклеазы разрушать различные гибридные структуры ДНК и РНК, дифференциальное использование кофактора ДНК-лигазой и оценка ДНК-связывающей способности ферментов. Обсуждаются факторы, которые следует учитывать при проектировании синтетических нуклеотидных субстратов, а также приводится базовый набор олигонуклеотидов, которые могут быть использованы для ряда анализов лигазы нуклеиновой кислоты, полимеразы и нуклеазного фермента.
Все формы жизни нуждаются в ферментах, процессирующих нуклеиновые кислоты, для осуществления фундаментальных биологических процессов, включая репликацию, транскрипцию и репарацию ДНК. Ключевыми ферментативными функциями для этих путей являются полимеразы, которые генерируют копии молекул РНК/ДНК, лигазы, которые присоединяются к полинуклеотидным субстратам, нуклеазы, которые разрушают их, а также геликазы и топоизомеразы, которые расплавляют дуплексы нуклеиновых кислот или изменяют их топологию 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
1. Разработка и закупка олигонуклеотидов
Примечание: Проектирование одноцепочечных олигонуклеотидов для сборки и отжига в желаемые дуплексы. Одна или несколько цепей в дуплексе должны содержать флуоресцентный фрагмент для отслеживания процесса олигонуклеотида интересующим ферментом. Базовый набор одноцепочечных последовательностей, которые могут быть собраны для ряда действий, представлен в таблице 1.
Лигирование по ДНК-лигазе
Ферментативная активность ДНК-лигазы приведет к увеличению размера флуоресцентно меченного олигонуклеотида при визуализации на геле мочевины PAGE. В случае субстратов для лигирования ДНК и РНК, перечисленных в таблице 2, это соответствует у.......
Критические шаги в протоколе
Дизайн и покупка олигонуклеотидов: При покупке олигонуклеотидов для образования дуплекса важно учитывать дизайн последовательности. Рекомендуется использовать инструмент олигоанализатора для прогнозирования свойств нуклеотидной последоват.......
SEG и UR являются сотрудниками компании ArcticZymes Technologies AS, которая занимается дистрибуцией R2D-лигазы. AW, ER-S и RS не имеют конкурирующих интересов.
AW поддерживается стипендией Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). РС является получателем стипендии Новой Зеландии для Постантарктической службы. SG и UR выражают благодарность Химическому институту при Университете Тромсё - Норвежскому арктическому университету за техническую поддержку.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) | BioRad | 1610156 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Many suppliers | ||
Ammonium persulfate (APS) | Many suppliers | ||
Benchtop centrifuge | Many suppliers | ||
Borate | Many suppliers | ||
Bromophenol blue | Many suppliers | ||
Dithiothreitol (DTT) | Many suppliers | ||
Electrophoresis system with circulating water bath | Many suppliers | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Many suppliers | ||
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 | Thermo Fisher Scientific | A32752 | |
Formamide | Many suppliers | ||
Gel casting system | Many suppliers | ||
Heating block | Many suppliers | ||
Magnesium Chloride | Many suppliers | Other metal ions may be preferred depending on the protein studied | |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Many suppliers | ||
Micropipettes and tips | Many suppliers | 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL | |
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) | Many suppliers | ||
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | NA | Thermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript and others also supply these |
pasture pipette | Many suppliers | ||
PCR thermocycler | Many suppliers | ||
PCR tubes | Many suppliers | ||
RNAse away | ThermoFisher | 7002PK | Only needed when working with RNA oligos |
RNase AWAY | Merck | 83931-250ML | Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces |
RNAse-free water | New England Biolabs | B1500L | Only needed when working with RNA oligos |
Sodium Chloride | Many suppliers | ||
SUPERase IN RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based) |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides |
Tetramethylethylenediamine (TMED) | Many suppliers | ||
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane | Many suppliers | ||
Ultrapure water (Milli-Q) | Merck | ||
urea | Many suppliers | ||
Vortex | Many suppliers |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены