A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.
הזמינות של מגוון אוליגונוקלאוטידים סינתטיים מותאמים מספקים מסחריים אפשרה פיתוח של בדיקות מתוחכמות כדי לאפיין תכונות מגוונות של אנזימים מטבוליזם חומצת גרעין שניתן להריץ בכל מעבדה סטנדרטית לביולוגיה מולקולרית. השימוש בתוויות פלואורסצנטיות הפך את השיטות הללו לנגישות לחוקרים עם ציוד אלקטרופורזה סטנדרטי של PAGE ומכשיר הדמיה פלואורסצנטי, ללא שימוש בחומרים רדיואקטיביים וללא צורך במעבדה המיועדת לאחסון והכנה של חומרים רדיואקטיביים, כלומר מעבדת הוט. התוספת האופציונלית של שינויים סטנדרטיים כגון זרחן יכולה לפשט את הגדרת המבחן, בעוד שניתן להשתמש בשילוב ספציפי של נוקלאוטידים שעברו שינוי המחקים נזקי DNA או מתווכים כדי לחקור היבטים ספציפיים של התנהגות אנזימים. כאן, התכנון והביצוע של בדיקות כדי לחקור מספר היבטים של עיבוד DNA על ידי אנזימים באמצעות אוליגונוקלאוטידים סינתטיים זמינים מסחרית מודגמים. אלה כוללים את היכולת של ליגאזות להצטרף או nucleases כדי לפרק מבנים היברידיים שונים של DNA ו- RNA, שימוש בקו-פקטור דיפרנציאלי על ידי ליגאז DNA, והערכה של יכולת קשירת DNA של אנזימים. נדונים גורמים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון מצעי נוקלאוטידים סינתטיים, ומסופקת קבוצה בסיסית של אוליגונוקלאוטידים שניתן להשתמש בהם עבור מגוון של חומצות גרעין ליגאז, פולימראז ובדיקות אנזימי נוקלאז.
כל צורות החיים דורשות אנזימים לעיבוד חומצות גרעין כדי לבצע תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כולל שכפול, שעתוק ותיקון DNA. פונקציות אנזימטיות עיקריות עבור מסלולים אלה הן פולימראזות, אשר מייצרות עותקים של מולקולות RNA/DNA, ליגאזות המצטרפות למצעי פולינוקלאוטידים, נוקלאזות המשפילות אותן, ומנחתים וטופואיזומראזות, אשר ממיסים דופלקסים של חומצות גרעין או משנים את הטופולוגיה שלהם 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
1. תכנון ורכישה של אוליגונוקלאוטידים
הערה: תכננו אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים שיורכבו ויחושלו לדופלקסים הרצויים. אחד או יותר מהגדילים בדופלקס חייב לשאת מואטי פלואורסצנטי למעקב אחר עיבוד אוליגונוקלאוטיד על ידי האנזים המעניין. קבוצת בסיס של רצפים חד-גדיליים שניתן להרכיב למגוון פעילויות מוצגת בטבלה 1.
קשירה על ידי DNA ligase
פעילות אנזימטית של ליגאז DNA תגרום להגדלת גודלו של האוליגונוקלאוטיד המסומן באופן פלואורסצנטי כאשר הוא מוצג על ג'ל PAGE של אוריאה. במקרה של הסובסטרטים עבור קשירת דנ"א ורנ"א המפורטים בטבלה 2, זה מתאים להכפלת הגודל מ-20 nt ל-40 nt (איור 3A). פעילות א?.......
שלבים קריטיים בפרוטוקול
תכנון ורכישה של אוליגונוקלאוטידים: בעת רכישת אוליגונוקלאוטידים ליצירת דופלקס, חיוני לשקול תכנון רצף. מומלץ להשתמש בכלי אנלייזר אוליגו לחיזוי תכונות רצף הנוקלאוטידים, כגון תכולת GC, טמפרטורת התכה, מבנה משני ופוטנציאל דימריזציה, לפני הזמנת57.<.......
SEG ו-UR הם עובדים של ArcticZymes Technologies AS, המפיצה את ליגאז R2D. ל-AW, ER-S ו-RS אין אינטרסים מתחרים.
AW נתמך על ידי מלגת Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS היא זוכת מלגת ניו זילנד פוסט אנטארקטיקה. SG ו- UR מודים למכון הכימי באוניברסיטת טרומסו - האוניברסיטה הארקטית הנורבגית לתמיכה טכנית.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) | BioRad | 1610156 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Many suppliers | ||
Ammonium persulfate (APS) | Many suppliers | ||
Benchtop centrifuge | Many suppliers | ||
Borate | Many suppliers | ||
Bromophenol blue | Many suppliers | ||
Dithiothreitol (DTT) | Many suppliers | ||
Electrophoresis system with circulating water bath | Many suppliers | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Many suppliers | ||
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 | Thermo Fisher Scientific | A32752 | |
Formamide | Many suppliers | ||
Gel casting system | Many suppliers | ||
Heating block | Many suppliers | ||
Magnesium Chloride | Many suppliers | Other metal ions may be preferred depending on the protein studied | |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Many suppliers | ||
Micropipettes and tips | Many suppliers | 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL | |
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) | Many suppliers | ||
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | NA | Thermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript and others also supply these |
pasture pipette | Many suppliers | ||
PCR thermocycler | Many suppliers | ||
PCR tubes | Many suppliers | ||
RNAse away | ThermoFisher | 7002PK | Only needed when working with RNA oligos |
RNase AWAY | Merck | 83931-250ML | Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces |
RNAse-free water | New England Biolabs | B1500L | Only needed when working with RNA oligos |
Sodium Chloride | Many suppliers | ||
SUPERase IN RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based) |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides |
Tetramethylethylenediamine (TMED) | Many suppliers | ||
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane | Many suppliers | ||
Ultrapure water (Milli-Q) | Merck | ||
urea | Many suppliers | ||
Vortex | Many suppliers |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved