שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

Abstract

הזמינות של מגוון אוליגונוקלאוטידים סינתטיים מותאמים מספקים מסחריים אפשרה פיתוח של בדיקות מתוחכמות כדי לאפיין תכונות מגוונות של אנזימים מטבוליזם חומצת גרעין שניתן להריץ בכל מעבדה סטנדרטית לביולוגיה מולקולרית. השימוש בתוויות פלואורסצנטיות הפך את השיטות הללו לנגישות לחוקרים עם ציוד אלקטרופורזה סטנדרטי של PAGE ומכשיר הדמיה פלואורסצנטי, ללא שימוש בחומרים רדיואקטיביים וללא צורך במעבדה המיועדת לאחסון והכנה של חומרים רדיואקטיביים, כלומר מעבדת הוט. התוספת האופציונלית של שינויים סטנדרטיים כגון זרחן יכולה לפשט את הגדרת המבחן, בעוד שניתן להשתמש בשילוב ספציפי של נוקלאוטידים שעברו שינוי המחקים נזקי DNA או מתווכים כדי לחקור היבטים ספציפיים של התנהגות אנזימים. כאן, התכנון והביצוע של בדיקות כדי לחקור מספר היבטים של עיבוד DNA על ידי אנזימים באמצעות אוליגונוקלאוטידים סינתטיים זמינים מסחרית מודגמים. אלה כוללים את היכולת של ליגאזות להצטרף או nucleases כדי לפרק מבנים היברידיים שונים של DNA ו- RNA, שימוש בקו-פקטור דיפרנציאלי על ידי ליגאז DNA, והערכה של יכולת קשירת DNA של אנזימים. נדונים גורמים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון מצעי נוקלאוטידים סינתטיים, ומסופקת קבוצה בסיסית של אוליגונוקלאוטידים שניתן להשתמש בהם עבור מגוון של חומצות גרעין ליגאז, פולימראז ובדיקות אנזימי נוקלאז.

Introduction

כל צורות החיים דורשות אנזימים לעיבוד חומצות גרעין כדי לבצע תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כולל שכפול, שעתוק ותיקון DNA. פונקציות אנזימטיות עיקריות עבור מסלולים אלה הן פולימראזות, אשר מייצרות עותקים של מולקולות RNA/DNA, ליגאזות המצטרפות למצעי פולינוקלאוטידים, נוקלאזות המשפילות אותן, ומנחתים וטופואיזומראזות, אשר ממיסים דופלקסים של חומצות גרעין או משנים את הטופולוגיה שלהם 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protocol

1. תכנון ורכישה של אוליגונוקלאוטידים

הערה: תכננו אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים שיורכבו ויחושלו לדופלקסים הרצויים. אחד או יותר מהגדילים בדופלקס חייב לשאת מואטי פלואורסצנטי למעקב אחר עיבוד אוליגונוקלאוטיד על ידי האנזים המעניין. קבוצת בסיס של רצפים חד-גדיליים שניתן להרכיב למגוון פעילויות מוצגת בטבלה 1.

1. שלבו את השינויים הספציפיים הדרושים לאנזים המעניין כמתואר להלן.
   1. עבור מצעי ליגאז דנ"א (איור 1): הרכיבו את המצע הפשוט ביותר משלושה אוליגונוקלאוטידים: גדיל תורם זרחני 5' (NL2), גדיל מקבל 5' FAM (NL1), ומשלים שמגשר בין השניים (NL3).
      1. ודא שגדילים המספקים את הקצה של 5....

תוצאות

קשירה על ידי DNA ligase
פעילות אנזימטית של ליגאז DNA תגרום להגדלת גודלו של האוליגונוקלאוטיד המסומן באופן פלואורסצנטי כאשר הוא מוצג על ג'ל PAGE של אוריאה. במקרה של הסובסטרטים עבור קשירת דנ"א ורנ"א המפורטים בטבלה 2, זה מתאים להכפלת הגודל מ-20 nt ל-40 nt (איור 3A). פעילות א?.......

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
תכנון ורכישה של אוליגונוקלאוטידים: בעת רכישת אוליגונוקלאוטידים ליצירת דופלקס, חיוני לשקול תכנון רצף. מומלץ להשתמש בכלי אנלייזר אוליגו לחיזוי תכונות רצף הנוקלאוטידים, כגון תכולת GC, טמפרטורת התכה, מבנה משני ופוטנציאל דימריזציה, לפני הזמנת⁵⁷.<.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers