A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

Abstract

הזמינות של מגוון אוליגונוקלאוטידים סינתטיים מותאמים מספקים מסחריים אפשרה פיתוח של בדיקות מתוחכמות כדי לאפיין תכונות מגוונות של אנזימים מטבוליזם חומצת גרעין שניתן להריץ בכל מעבדה סטנדרטית לביולוגיה מולקולרית. השימוש בתוויות פלואורסצנטיות הפך את השיטות הללו לנגישות לחוקרים עם ציוד אלקטרופורזה סטנדרטי של PAGE ומכשיר הדמיה פלואורסצנטי, ללא שימוש בחומרים רדיואקטיביים וללא צורך במעבדה המיועדת לאחסון והכנה של חומרים רדיואקטיביים, כלומר מעבדת הוט. התוספת האופציונלית של שינויים סטנדרטיים כגון זרחן יכולה לפשט את הגדרת המבחן, בעוד שניתן להשתמש בשילוב ספציפי של נוקלאוטידים שעברו שינוי המחקים נזקי DNA או מתווכים כדי לחקור היבטים ספציפיים של התנהגות אנזימים. כאן, התכנון והביצוע של בדיקות כדי לחקור מספר היבטים של עיבוד DNA על ידי אנזימים באמצעות אוליגונוקלאוטידים סינתטיים זמינים מסחרית מודגמים. אלה כוללים את היכולת של ליגאזות להצטרף או nucleases כדי לפרק מבנים היברידיים שונים של DNA ו- RNA, שימוש בקו-פקטור דיפרנציאלי על ידי ליגאז DNA, והערכה של יכולת קשירת DNA של אנזימים. נדונים גורמים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון מצעי נוקלאוטידים סינתטיים, ומסופקת קבוצה בסיסית של אוליגונוקלאוטידים שניתן להשתמש בהם עבור מגוון של חומצות גרעין ליגאז, פולימראז ובדיקות אנזימי נוקלאז.

Introduction

כל צורות החיים דורשות אנזימים לעיבוד חומצות גרעין כדי לבצע תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כולל שכפול, שעתוק ותיקון DNA. פונקציות אנזימטיות עיקריות עבור מסלולים אלה הן פולימראזות, אשר מייצרות עותקים של מולקולות RNA/DNA, ליגאזות המצטרפות למצעי פולינוקלאוטידים, נוקלאזות המשפילות אותן, ומנחתים וטופואיזומראזות, אשר ממיסים דופלקסים של חומצות גרעין או משנים את הטופולוגיה שלהם 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protocol

1. תכנון ורכישה של אוליגונוקלאוטידים

הערה: תכננו אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים שיורכבו ויחושלו לדופלקסים הרצויים. אחד או יותר מהגדילים בדופלקס חייב לשאת מואטי פלואורסצנטי למעקב אחר עיבוד אוליגונוקלאוטיד על ידי האנזים המעניין. קבוצת בסיס של רצפים חד-גדיליים שניתן להרכיב למגוון פעילויות מוצגת בטבלה 1.

  1. שלבו את השינויים הספציפיים הדרושים לאנזים המעניין כמתואר להלן.
    1. עבור מצעי ליגאז דנ"א (איור 1): הרכיבו את המצע הפשוט ביותר משלושה אוליגונוקלאוטידים: גדיל תורם זרחני 5' (NL2), גדיל מקבל 5' FAM (NL1), ומשלים שמגשר בין השניים (NL3).
      1. ודא שגדילים המספקים את הקצה של 5....

תוצאות

קשירה על ידי DNA ligase
פעילות אנזימטית של ליגאז DNA תגרום להגדלת גודלו של האוליגונוקלאוטיד המסומן באופן פלואורסצנטי כאשר הוא מוצג על ג'ל PAGE של אוריאה. במקרה של הסובסטרטים עבור קשירת דנ"א ורנ"א המפורטים בטבלה 2, זה מתאים להכפלת הגודל מ-20 nt ל-40 nt (איור 3A). פעילות א?.......

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
תכנון ורכישה של אוליגונוקלאוטידים: בעת רכישת אוליגונוקלאוטידים ליצירת דופלקס, חיוני לשקול תכנון רצף. מומלץ להשתמש בכלי אנלייזר אוליגו לחיזוי תכונות רצף הנוקלאוטידים, כגון תכולת GC, טמפרטורת התכה, מבנה משני ופוטנציאל דימריזציה, לפני הזמנת57.<.......

Disclosures

SEG ו-UR הם עובדים של ArcticZymes Technologies AS, המפיצה את ליגאז R2D. ל-AW, ER-S ו-RS אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

AW נתמך על ידי מלגת Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS היא זוכת מלגת ניו זילנד פוסט אנטארקטיקה. SG ו- UR מודים למכון הכימי באוניברסיטת טרומסו - האוניברסיטה הארקטית הנורבגית לתמיכה טכנית.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)BioRad1610156
Adenosine triphosphate (ATP)Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)Many suppliers
Benchtop centrifugeMany suppliers
BorateMany suppliers
Bromophenol blueMany suppliers
Dithiothreitol (DTT)Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bathMany suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamideMany suppliers
Gel casting systemMany suppliers
Heating blockMany suppliers
Magnesium ChlorideMany suppliersOther metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Many suppliers
Micropipettes and tipsMany suppliers1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)Many suppliers
OligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesNAThermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipetteMany suppliers
PCR thermocyclerMany suppliers
PCR tubesMany suppliers
RNAse awayThermoFisher7002PKOnly needed when working with RNA oligos
RNase AWAYMerck83931-250MLSurfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free waterNew England BiolabsB1500LOnly needed when working with RNA oligos
Sodium ChlorideMany suppliers
SUPERase IN RNase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethaneMany suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)Merck
ureaMany suppliers
VortexMany suppliers

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209PAGEDNADNADNANucleasesDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved