JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أصبحت هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث مشكلة صحية عامة عالمية. الهدف من هذه الدراسة هو استكشاف الآثار العلاجية والآليات ذات الصلة لحبوب الطب الصيني التقليدي Xiaoyao على هذه الحالة.

Abstract

هشاشة العظام هو مرض استقلابي شائع لدى النساء المسنات وبعد انقطاع الطمث ، مع عدم وجود أعراض واضحة خلال مراحله المبكرة. في المراحل الأخيرة من هذه الحالة ، يكون المرضى عرضة للكسور ، وهذا يمكن أن يؤثر بشكل خطير على صحتهم ونوعية حياتهم. جعلت الزيادة العالمية في متوسط العمر المتوقع هشاشة العظام مصدر قلق عالمي. كانت حبوب شياو ياو سابقا
المستخدمة في علاج الاكتئاب. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن الدواء له نشاط يشبه الإستروجين ، مما أثر على التعبير عن ALP ، وهي علامة مبكرة خاصة ببانيات العظم ، و COL-1 ، وهو مكون رئيسي لمصفوفة العظام خارج الخلية. تم تقييم حبوب Xiaoyao لآثارها على هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (PMOM) في الفئران. تم الوصول إلى المعلومات المستهدفة لكل مكون عشبي من حبوب Xiaoyao من خلال قاعدة بيانات علم الأدوية لأنظمة الطب الصيني التقليدي (TCMSP). تم استخدام المعلومات من GeneCard و OMIM و PharmGkb و TTD و DrugBank ومواقع الويب الأخرى لبناء الشبكة التنظيمية للمجمع العشبي من خلال شبكة Cytoscape و String لتقييم تفاعلات البروتين. تم استئصال المبيض للفئران ، وعولجت بجرعات عالية ومنخفضة من حبوب Xiaoyao وتمت مقارنتها بالضوابط. تم تقييم أعراضهم عن طريق الكيمياء المناعية لأنسجة العظام. أشارت النتائج إلى أن حبوب Xiaoyao لديها القدرة على تخفيف أعراض PMOM في الفئران التي تم استئصال المبيض من خلال مسار إشارات IL-17. هذا الدواء لديه القدرة على أن يصبح عاملا علاجيا جديدا لعلاج هشاشة العظام.

Introduction

تعرف منظمة الصحة العالمية (WHO) هشاشة العظام (OP) بأنها مرض يتميز بانخفاض في كتلة العظام وتدهور البنية المجهرية لأنسجة العظام ، مما يؤدي إلى زيادة هشاشة العظام ، وبالتالي زيادة خطر الكسر1. الأهمية السريرية لهشاشة العظام هي أنه يمكن أن يؤدي إلى كسور ، والتي ترتبط بارتفاع معدل الوفيات والمراضة والتكاليف الاقتصادية2. يحدث مرض هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (PMOP) بسبب انخفاض مستويات هرمون الاستروجين لدى النساء بعد انقطاع الطمث ، مما يؤدي إلى زيادة نشاط ناقضة العظم ، مما يؤدي إلى فقدان العظام وتدمير البنية المجهرية للعظام. هذا غالبا ما يسبب هشاشة العظام مع تأثير خطير على الصحة3. تشمل العلاجات الحالية ل PMOP العلاج ببدائل الإستروجين ، والبايفوسفونيت ، وهرمون الغدة الدرقية ، ولكن يمكن أن يكون لها درجات متفاوتة من الآثار الضارة ، وعدم كفاية الامتثال على المدى الطويل ، وارتفاع التكاليف4. لذلك ، فإن الأدوية العشبية بأسعار معقولة هي بديل قابل للتطبيق لنسبة كبيرة من السكان.

يتم تضمين حبوب Xiaoyao في دستور الأدوية الصيني5 ، وتحتوي على ثمانية مكونات عشبية ، بما في ذلك Chai Hu و Angelica sinensis و White paeonia lactiflora و Atractylodes macrocephalaو Poria cocos و Menthae Herba وعرق السوس والزنجبيل الطازج. من المعروف أن كل هذه الأعشاب فعالة في إزالة السموم من الكبد وتقوية الطحال وتغذية الدم وتنظيم الدورة الشهرية ، كما تم استخدام الخليط لعلاج الاكتئاب6. ومع ذلك ، فإن دور حبوب Xiaoyao في هشاشة العظام غير واضح.

اقترحت الدراسات المبكرة أن الالتهاب يمكن أن يؤدي إلى فقدان العظام7 ، وأن انخفاض كثافة العظام المرتبط بهذه العملية قد يتسارع بسبب انقطاع الطمث. بالإضافة إلى ذلك ، هناك علاقة قوية بين تطور مرض هشاشة العظام والالتهابات. العامل الالتهابي ، إنترلوكين -17 (IL-17) ، هو عامل مؤيد للالتهابات تفرزه خلايا Th17 ، وهي مجموعة فرعية من الخلايا الليمفاوية التائية CD4 +. ترتبط هذه الخلايا بالعديد من الحالات الالتهابية المزمنة ، وتلعب دورا مهما في تطور تدمير العظام في التهاب المفاصل الروماتويدي8. بالإضافة إلى ذلك ، يحفز IL-17 منشط مستقبلات الربيطة للعامل النووي-κ B (RANKL) ، الذي ينظم تكوين العظام ، مما يؤدي إلى ارتشاف عظمي أكبر من تكوين العظام9. يحفز IL-17 التعبير عن السيتوكينات الأخرى المولدة للعظم مثل TNFα و IL-1 و IL-6 و IL-8. لديه القدرة على التآزر مع العوامل الالتهابية الأخرى ، مما يجعله مستجيبا التهابيا مهما10.

أظهرت الدراسات أيضا وجود صلة بين حبوب Xiaoyao والالتهاب. أكد Shi et al.11 و Fang et al.12 مؤخرا أن حبوب Xiaoyao يمكن أن تقلل من مستويات IL-6 و TNF-α ، على التوالي. في دراسة أخرى لالتهاب الكبد الدهني المرتبط بالتمثيل الغذائي ، أفيد أن حبوب Xiaoyao يمكن أن تنظم التعبير عن حمض البروبيونيك ، والذي بدوره يمنع التعبير عن TNF-α ويمارس تأثيرا مضادا للالتهابات13. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، من غير المعروف ما إذا كانت حبوب Xiaoyao يمكن أن تنظم تطور PMOM عن طريق التوسط في استجابة التهابية من خلال IL-17 ، والذي كان الهدف من هذه الدراسة.

تنبأت هذه الدراسة بتقاطع أهداف حبوب Xiaoyao والجينات المرتبطة بهشاشة العظام من خلال تحليل علم الأدوية الشبكي والمعلوماتية الحيوية وتحليل الجينات المتقاطعة لتفاعلات البروتين و GO و KEGG. بناء على النتائج المتوقعة ، يمكن ملاحظة التعبير عن Act1 و IL-6 ، وهما بروتينات رئيسية في مسار إشارات IL-17 ،14,15 ، بالإضافة إلى علامات دوران العظام الفوسفاتيز القلوي (ALP) والكولاجين من النوع الأول (COL-1) ، لمراقبة الفعالية العلاجية لحبوب Xiaoyao في نموذج الفئران PMOM.

Protocol

وافقت لجنة أخلاقيات المختبر بجامعة يوجيانغ الطبية للقوميات على بروتوكول الدراسة (رقم الموافقة: 2022101502). تم إيواء إناث الفئران C57BL / 6 ، الذين تتراوح أعمارهم بين 10-12 أسبوعا ، وفئة SPF وأوزان الجسم (22 ± 2) جم ، في مركز التجارب الحيوانية من فئة SPF بجامعة Youjiang الطبية للقوميات. تم الحفاظ على التجارب عند درجة حرارة 24-26 درجة مئوية ورطوبة نسبية من 55٪ إلى 60٪.

1. قاعدة بيانات علم الأدوية لأنظمة الطب الصيني التقليدي ومنصة التحليل

ملاحظة: قاعدة بيانات علم الأدوية لأنظمة الطب الصيني التقليدي ومنصة التحليل (TCMSP ؛ https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) هي منصات صيدلة الطب الصيني التي تحتوي على معلومات حول مكونات الطب الصيني التقليدي والخصائص والأهداف والأمراض المتعلقة ب ADME16,17.

  1. الوصول إلى واجهة ويب TCMSP. ابحث عن اسم Herb ، وأدخل اسم الدواء الصيني ، وانقر فوق بحث. انقر فوق الاسم اللاتيني في نتائج البحث. إجراء فحص على نتائج المكونات مع المعلمات OB ≥ 30 ٪ و DL ≥ 0.18.
  2. انسخ جميع النتائج واحفظها بتنسيق TXT ، المسمى الطب الصيني Name_ingredients.txt.
  3. ضمن معلومات الأهداف في علامة التبويب الأهداف ذات الصلة، قم بتصفية معرف Mol (أي النتيجة في الخطوة 1.2).
  4. انسخ النتائج التي تمت تصفيتها واحفظها بتنسيق TXT المسمى Chinese Medicine Name_targets.txt.
    ملاحظة: من خلال الخطوات المذكورة أعلاه ، تم الحصول على جميع المكونات النشطة المؤهلة والمعلومات المستهدفة المقابلة للطب الصيني التقليدي (TCM).
  5. ضع كافة ملفات ingredients.txt المذكورة أعلاه وملفات targets.txt في نفس المجلد وضع نصوص Perl النصية (ملف الترميز التكميلي 1) في هذا المجلد.
  6. افتح CMD ، واكتب مسار مجلد القرص المضغوط ، وأدخله ، وقم بتشغيل برنامج Perl النصي. الحصول على ملف نصي جديد (allTargets.txt). يحتوي هذا الملف النصي الجديد (allTargets.txt) على الاسم العشبي واسم المكون ومعرف المكون والهدف.

2. قاعدة بيانات يونيبروت

ملاحظة: تحتوي قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org/) على تسلسلات البروتين البشري المشروحة بمعلومات وظيفية ، وتستخدم لتطبيع أسماء الأهداف لأسمائها الرسمية18.

  1. انتقل إلى واجهة ويب UniProt. انقر فوق علامة التبويب بحث ، وحدد UniProtKB، ثم انقر فوق بحث.
  2. تصفية في الشريط الجانبي الأيسر ، حدد تمت المراجعة (Swiss-Prot) للحالة والإنسان للكائنات الشائعة. انقر فوق تنزيل، وحدد تنزيل الكل، وحدد TSV للتنسيق، وانقر فوق تنزيل لتنزيل ملف التعليق التوضيحي.
  3. قم بفك ضغط الملف الذي تم تنزيله إلى المجلد الحالي ، وافتح الملف الذي تم فك ضغطه ، وانسخه والصقه في ملف نصي باسم ann.txt.

3. تحويل معرف هدف الدواء

  1. ضع جميع الملفات المستهدفة للدواء التي allTargets.txt الحصول عليها في القسم 1 ann.txt الحصول على ملف التعليق التوضيحي UniProt في القسم 2 في مجلد وضع نصوص Perl (ملف الترميز التكميلي 2) فيه.
  2. افتح CMD ، واكتب cd + space + مسار المجلد ، وأدخله ، وقم بتشغيل برنامج Perl النصي للحصول على ملف نصي جديد (allTargets.symbol.txt). يحتوي هذا الملف النصي الجديد (allTargets.symbol.txt) على اسم الأعشاب ومعرف المكون واسم المكون ومعرف الجين.

4. البحث في قاعدة البيانات

  1. GeneCards: قاعدة بيانات الجينات البشرية (GeneCards)
    ملاحظة: توفر قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/) معلومات التنبؤ والتعليقات التوضيحية للجينات البشرية. يتم استخدامه للوصول إلى أهداف المرض19,20.
    1. انتقل إلى واجهة ويب GeneCards. اكتب هشاشة العظام في مربع البحث وانقر فوق بحث.
    2. انقر فوق تصدير وحدد تصدير إلى Excel.
    3. افتح الملف الذي تم تنزيله ، وانسخ الجينات ذات درجة الصلة ≥ 1 ، والصقها واحفظها في ملف باسم GeneCards.txt.
  2. قاعدة بيانات OMIM
    ملاحظة: تحتوي قاعدة بيانات OMIM (https://omim.org) على الجينات البشرية والأمراض الوراثية والسمات21.
    1. انتقل إلى واجهة الويب OMIM. انقر فوق GENE Map ، واكتب هشاشة العظام في مربع البحث ، وانقر فوق بحث.
    2. انقر فوق تنزيل باسم وحدد ملف Excel.
    3. افتح الملف الذي تم تنزيله ، وانسخ اسم الجين في عمود الرمز المعتمد ، والصقه واحفظه في ملف باسم OMIM.txt.
  3. قاعدة بيانات PharmGkb
    ملاحظة: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org) ، قاعدة معارف علم الصيدلة الجيني ، تحتوي على تعليقات توضيحية لملصقات الأدوية ، ومسارات تتمحور حول الأدوية ، وملخصات علم الوراثة الدوائية ، والعلاقات بين الجينات والأدوية والأمراض22.
    1. انتقل إلى واجهة موقع PharmGkb. أدخل هشاشة العظام في مربع البحث ، وانقر فوق بحث ، وحدد جين في الشريط الجانبي الأيسر.
    2. أدخل جميع النتائج يدويا واحفظها في ملف يسمى PharmGkb.txt.
  4. TTD: قاعدة بيانات الهدف العلاجي (TTD)
    ملاحظة: توفر قاعدة بيانات TTD (https://idrblab.org/ttd/) معلومات عن أهداف البروتين والحمض النووي، والأمراض المستهدفة، ومعلومات عن المسار، والأدوية المقابلة لكل هدف23.
    1. انتقل إلى واجهة ويب TTD. اكتب هشاشة العظام في مربع البحث وانقر فوق بحث.
    2. انقر فوق معلومات الهدف ضمن معرف الهدف في النتيجة، وانسخ اسم الهدف والصقه واحفظه في ملف باسم TTD.txt. تم الحصول على ما مجموعه 33 نتيجة. احفظ كل نتيجة بنفس الطريقة.
  5. قاعدة بيانات بنك الأدوية على الإنترنت (DrugBank)
    ملاحظة: تحتوي قاعدة بيانات DrugBank (https://go.drugbank.com) على معلومات حول الأدوية وأهداف الأدوية ، والتفاعلات الدوائية ، وآليات الأدوية ، واستقلاب الأدوية24.
    1. انتقل إلى واجهة موقع DrugBank. حدد المؤشرات في علامة تبويب البحث، واكتب هشاشة العظام في مربع البحث، وانقر فوق بحث.
    2. انقر فوق إدخال هشاشة العظام في النتائج لمزيد من المعلومات ، وانقر فوق علامة التبويب الأدوية والأهداف ، وانقر فوق الارتباط المناسب في عمود TARGET من الجدول.
    3. انقر فوق التفاصيل في البروتين، وانسخ اسم الجين، والصقه، واحفظه في ملف باسم DrugBank.txt. احفظ كل نتيجة بنفس الطريقة.

5. مخطط فين

  1. دمج الجينات المرتبطة بالأمراض ورسم خرائط فين
    1. ضع ملفات txt المحفوظة وكذلك البرنامج النصي في نفس المجلد.
    2. افتح رمز R (دمج الجينات المرتبطة بالأمراض) ، وانسخ والصق المسار حيث يتم تخزين ملف txt أعلاه في السطر حيث يوجد setwd في كود R.
    3. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل رمز R المعدل ، واحفظه. اضبط الجين ، وقم بتسمية الملف Disease.txt.
    4. افتح موقع رسم مخطط فين ؛ في قسم الإدخال ، انسخ والصق محتوى النص المحفوظ في الأقسام من 4 إلى 8 واحدا تلو الآخر في القائمة ، وقم بتسميته بقاعدة البيانات المعنية ، وانقر فوق إرسال.
    5. انقر فوق حفظ الصورة باسم PNG أسفل الصورة ، واحفظ نتيجة النص في نفس المجلد.
  2. تقاطع أهداف الدواء والجينات المرتبطة بالأمراض
    1. ضع ملف allTargets.symbol.txt الذي تم الحصول عليه في القسم 3 وملف Disease.txt الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5.1.3 في نفس المجلد.
    2. افتح رمز R (هدف الدواء والجين المرتبط بالمرض يتقاطعان) ، وانسخ والصق المسار حيث يتم تخزين ملف txt أعلاه إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
    3. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل رمز R المعدل ، واحفظه. اضبط الجين ، وقم بتسمية الملف Drug_Disease.txt.
    4. افتح موقع ويب رسم رسم فني. في قسم الإدخال ، انسخ allTargets.symbol.txt والصقها Disease.txt في القائمة وقم بتسميتها بعد الملفات الخاصة بها.
    5. انقر فوق حفظ الصورة بتنسيق PNG أسفل الصورة ، واحفظ نتائج النص في نفس المجلد.

6. بناء الشبكة التنظيمية لمركب الطب الصيني التقليدي

  1. ضع ملف allTargets.symbol.txt الذي تم الحصول عليه في القسم 3 في نفس المجلد مثل ملف Disease.txt ونص Perl المقابل (ملف الترميز التكميلي 3).
  2. افتح CMD ، واكتب مسار ملف القرص المضغوط ، واضغط على Enter ، وقم بتشغيل البرنامج النصي Perl. احصل على أربعة ملفات txt جديدة: net.geneLists.txt و net.molLists.txt و net.network.txt و net.type.txt. يحتوي الملف network.txt على معرف مكون الطب الصيني التقليدي، الجين الهدف، العلاقة الهدف، واسم المكون. يحتوي net.type.txt على اسم العقدة والسمات والانتماء. net.geneLists.txt هي قائمة الجينات ، net.molLists.txt هي قائمة المكونات.
  3. انسخ الملفات النصية التي تم الحصول عليها حديثا في نفس المجلد الجديد.
  4. افتح برنامج Cytoscape 3.9.1 ، وانقر فوق ملف ، وانقر فوق استيراد ، وحدد ملف نموذج الشبكة. حدد net.network.txt، وضع العمود الأول من معرف المكون كعقدة مصدر، والعمود الثاني من الجينات كعقدة هدف، والعمود الثالث من علاقة الاستهداف كنوع تفاعل، وانقر فوق موافق.
  5. استيراد net.type.txt من نافذة جدول العقدة. انقر فوق علامة التبويب تحديد، وحدد العقد، وحدد من ملف قائمة المعرف، وحدد net.geneLists.txt، وانقر فوق فتح.
  6. انقر فوق علامة التبويب تخطيط، وحدد تخطيط دائرة مرتبة حسب الدرجة، وحدد العقد المحددة فقط. اضبط ارتفاع وعرض العقد على 70.
  7. انقر فوق المربع الثاني في الارتفاع، وحدد degree.layout في العمود، وحدد التعيين المستمر في نوع التعيين، وانقر نقرا مزدوجا فوق نافذة ضبط الارتفاع على الجانب الأيسر من التعيين الحالي لضبط الحدود العليا والسفلى للارتفاع إلى نطاق مناسب.
  8. كرر العملية مع خيار العرض.
  9. انقر فوق علامة التبويب تخطيط مرة أخرى وانقر فوق أدوات التخطيط > ضبط المقياس بحيث لا تتداخل العقد.
  10. انقر فوق النافذة اليمنى العليا للبرنامج لجعل شبكة العقدة غير محددة ، وانقر فوق علامة التبويب تحديد ، وحدد العقد ، وحدد من ملف قائمة المعرف ، وحدد net.molLists.txt ، وانقر فوق فتح.
  11. انقر فوق علامة التبويب تخطيط، وحدد تخطيط سمات المجموعة، وحدد العقد المحددة فقط، وانقر فوق النوع.
  12. انقر فوق تسمية حجم الخط في العمود الأيمن واضبط القيمة الافتراضية على 12. انقر على القيمة الافتراضية في الصورة/الرسم البياني 1 في العمود الأيمن.
  13. حدد المخططات في النافذة المنبثقة، وانقر فوق مخطط دائري، وحدد العناصر في عمود الأعمدة المتاحة باستثناء الدرجة. تخطيط على عمود الأعمدة المحددة وانقر فوق تطبيق.
  14. انقر فوق Border Paint في العمود الأيسر واضبط القيمة الافتراضية على #003EF8. انقر فوق علامة التبويب Edge أسفل الشريط الجانبي الأيسر واضبط العرض على 0.8.
  15. انقر على ملف في شريط الأدوات العلوي، وحدد تصدير، ثم حدد شبكة إلى صورة.
  16. في النافذة المنبثقة ، حدد تنسيق PNG للتنسيق ، وحدد دليل الحفظ وقم بتسمية شبكة الصور ، واضبط حجم التكبير في الصورة إلى الحد الأقصى 500٪ ، وحدد خلفية شفافة ، وانقر فوق "موافق " لإنهاء حفظ الصورة.

7. شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI)

  1. افتح موقع STRING على الويب (https://string-db.org/) ، وانقر فوق بروتين متعدد ، وانقر فوق استعراض في تحميل ملف ، وحدد ملف Drug_Disease.txt الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5.2.3 ، وحدد الإنسان العاقل في الكائنات الحية. انقر فوق بحث وانقر فوق متابعة.
  2. انقر فوق الإعدادات ، واضبط الحد الأدنى لدرجة التفاعل المطلوبة على أعلى ثقة (0.900) ، وحدد إخفاء العقد غير المتصلة في الشبكة في خيارات عرض الشبكة. انقر فوق تحديث.
  3. قم بإجراء تعديلات على العقد في مخطط الشبكة بحيث لا يكون هناك تداخل أو انسداد.
  4. انقر فوق تصدير وانقر فوق تنزيل كصورة نقطية عالية الدقة للحصول على خريطة شبكة العمل البيني للبروتين بتنسيق PNG. أيضا ، قم بتنزيل ملف TSV كإخراج نص جدولي قصير. احفظ كلا الملفين في مجلد موحد. يحتوي ملف TSV على اسم الجين، معرف STRING الداخلي، وعشرات لسمات مختلفة.

8. البناء الأساسي لشبكة PPI

  1. ضع ملف TSV الذي تم الحصول عليه في القسم 7 والبرامج النصية Perl المطلوبة في مجلد جديد.
  2. افتح برنامج Cytoscape 3.9.1 ، وانقر فوق ملف ، وحدد استيراد ، وانقر فوق الشبكة من ملف ، وحدد ملف TSV أعلاه ، وضع عقدة العمود الأول 1 كعقدة مصدر وعقدة العمود الثاني 2 كعقدة هدف ، وانقر فوق موافق.
  3. انقر فوق نمط في الشريط الجانبي الأيسر ، وانقر فوق القيمة الافتراضية في العرض ، واضبطها على 60. قم بسحب العقد وإفلاتها بحيث لا يكون هناك تداخل ولا انسداد في الشبكة.
  4. انقر فوق التطبيقات في شريط الأدوات العلوي، وانقر فوق CytoNCA، ثم انقر فوق فتح.
  5. في العمود الأيمن، حدد بدون وزن ضمن بين، والقرب، والدرجة، والمتجه الذاتي، والأسلوب المستند إلى المتوسط المحلي للاتصال، والشبكة، وانقر فوق تحليل.
  6. عند اكتمال التحليل ، انقر فوق Node Table في النافذة اليمنى السفلية ، وانقر فوق تصدير ، واحفظه في المجلد ، وقم بتسميته بالدرجة 1.
    ملاحظة: يجب تثبيت المكون الإضافي CytoNCA في برنامج Cytoscape. للقيام بذلك، انقر فوق التطبيقات في شريط الأدوات العلوي، وانقر فوق APP Manager، وأدخل CytoNCA في مربع البحث، وحدد CytoNCA في العمود الأوسط من النتائج التي تم إرجاعها، وانقر فوق تثبيت.
  7. افتح score1 ، واضبط عمود الاسم على العمود الأول ، وانسخ المعلومات الموجودة في الجدول ، والصقها في ملف نصي جديد ، وقم بتسميتها score1.txt ، واحفظها.
  8. افتح رمز R وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف score1.txt إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  9. افتح برنامج R وقم بتشغيل الكود المعدل للحصول على ملفين جديدين ، score2.txt و score2.gene.txt. يحتوي الملف score2.txt على الجينات التي كانت جميع درجات البرنامج فيها أكبر من الوسيط والدرجات المحددة لكل برنامج. يحتوي score2.gene.txt على الجينات التي سجلت درجات أكبر من الوسيط لجميع العناصر.
  10. للمتابعة في Cytoscape ، انقر فوق AnalysisPanel 1 في النافذة اليمنى السفلية ، وانقر فوق تحميل من ملف على الجانب الأيسر من النافذة ، وحدد score2.gene.txt ، وانقر فوق فتح ، وانقر فوق موافق في النافذة المنبثقة.
  11. انقر فوق تحديد العقد في الجزء السفلي وانقر فوق موافق في النافذة المنبثقة.
  12. انقر فوق ملف في شريط الأدوات العلوي ، وحدد تصدير ، وانقر فوق شبكة إلى صورة ، واضبط التكبير (٪) في حجم الصورة إلى الحد الأقصى 500٪ ، وحدد خلفية شفافة ، واحفظ الملف في نفس المجلد ، وقم بتسميته network1.
  13. انقر فوق إنشاء شبكة فرعية في الشريط الجانبي الأيمن من النافذة السفلية لإنشاء شبكة فرعية ، وتحليل الشبكة الفرعية ، والنقر فوق التطبيقات في شريط الأدوات في الأعلى ، والنقر فوق CytoNCA وانقر فوق فتح.
  14. في الشريط الجانبي الأيمن، حدد بدون وزن ضمن بين والتقارب والدرجة والمتجه الذاتي والأسلوب المستند إلى المتوسط المحلي للاتصال والشبكة، وانقر فوق تحليل.
  15. عند الانتهاء من التحليل ، انقر فوق جدول العقدة في النافذة اليمنى السفلية ، وانقر فوق تصدير ، واحفظه في مجلد جديد باسم score2.
  16. افتح score2 ، واضبط عمود الاسم على العمود الأول ، وانسخ المعلومات الموجودة في الجدول ، والصقها في ملف نصي جديد ، وقم بتسميتها score2.txt ، واحفظها.
  17. افتح رمز R وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف score2.txt إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  18. افتح برنامج R وقم بتشغيل الكود المعدل للحصول على ملفين جديدين: score3.txt و score3.gene.txt. يحتوي ملف score3.txt على الجينات التي سجلت درجات أكبر من الوسيط لجميع العناصر والدرجات المحددة لكل عنصر. يحتوي score3.gene.txt على الجينات التي سجلت درجات أكبر من الوسيط لجميع العناصر.
  19. للمتابعة في Cytoscape ، انقر فوق AnalysisPanel 1 في النافذة اليمنى السفلية ، وانقر فوق تحميل من ملف على الجانب الأيسر من النافذة ، وحدد score3.gene.txt ، وانقر فوق فتح ، وانقر فوق موافق في النافذة المنبثقة.
  20. انقر فوق تحديد العقد في الجزء السفلي وانقر فوق موافق في النافذة المنبثقة.
  21. انقر فوق ملف في شريط الأدوات العلوي، وحدد تصدير، وانقر فوق شبكة إلى صورة، واضبط التكبير/التصغير (٪) في حجم الصورة إلى 500٪، وتحقق من خلفية شفافة، واحفظ الملف في نفس المجلد المستخدم في هذه الخطوة، وأطلق عليه اسم network2.
  22. انقر فوق إنشاء شبكة فرعية على الشريط الجانبي الأيمن من النافذة أدناه لإنشاء شبكة فرعية.
  23. انقر فوق ملف في شريط الأدوات في الجزء العلوي ، وحدد تصدير ، وانقر فوق شبكة إلى صورة ، واضبط التكبير (٪) في حجم الصورة إلى الحد الأقصى البالغ 500٪ ، وحدد خلفية شفافة ، واحفظ الملف في نفس المجلد المستخدم في هذه الخطوة وقم بتسميته network3.

9. تحويل معرف الجينات

  1. ضع ملف Drug_Disease.txt في نفس المجلد الجديد مثل ملف التعليمات البرمجية المطلوب.
  2. افتح رمز R (ملف الترميز التكميلي 4) وانسخ والصق المسار حيث يوجد ملف Drug_Disease.txt إلى السطر حيث يوجد setwd في رمز R.
  3. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل الكود المعدل باستخدام المؤسسة. Hs.eg.db الحزمة لتحويل معرف الجين ، وتشغيلها بعد الانتهاء من ملف جديد id.txt. يحتوي id.txt على رمز الجين والمعرف المقابل.

10. تحليل التخصيب GO

  1. ضع ملف id.txt من الخطوة السابقة في نفس المجلد مثل التعليمات البرمجية لتحليل إثراء GO.
  2. افتح رمز R (ملف الترميز التكميلي 5) واضبط دليل العمل على id.txt والمسار الذي يتم تخزين رمز GO فيه.
  3. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل التعليمات البرمجية المعدلة ، واستخدم clusterProfiler، org. Hs.eg.db ، إثراء المؤامرة ، مؤامرة ggplot2 ، الرسوم البيانية لتحليل الإثراء GO ، ومخططات الفقاعات. احصل على ثلاثة ملفات جديدة ، GO.txt و barplot.pdf و bubble.pdf ، بعد اكتمال التشغيل.
    ملاحظة: GO.txt هو ملف نتائج التخصيب الذي يحتوي على تصنيف التخصيب (BP ، CC ، MF) ، GO ID ، GO NAME ، نسبة الجينات ، نسبة الخلفية ، القيمة p لأهمية التخصيب ، القيمة p المصححة (p.ADJUST ، القيمة) ، معرف الجين (الاسم) ، وعدد الجينات المخصبة في كل GO. barplot.pdf هو الرسم البياني ، فقاعة. PDF عبارة عن مؤامرة فقاعة.

11. تحليل إثراء KEGG

  1. ضع ملف id.txt في نفس المجلد مثل التعليمات البرمجية لتحليل التخصيب KEGG.
  2. افتح رمز R (ملف الترميز التكميلي 6) واضبط دليل العمل على المسار حيث يتم تخزين رمز id.txt و KEGG.
  3. افتح برنامج R ، وقم بتشغيل التعليمات البرمجية المعدلة ، واستخدم clusterProfiler، org. Hs.eg.db ، و enrichplot ، وحزمة ggplot2 لرسم الرسوم البيانية لتحليل إثراء GO ، ومخططات الفقاعات ، ومخططات المسار. يكتمل التشغيل بإنتاج ثلاثة ملفات جديدة ، KEGG.txt و barplot.pdf و bubble.pdf.
    ملاحظة: ملف KEGG.txt هو ملف نتيجة إثراء يحتوي على معرف المسار ، وصف المسار ، نسبة الجينات ، نسبة الخلفية ، قيمة p لأهمية التخصيب ، القيمة p المصححة (p.ضبط ، qvalue) ، معرف الجين (الاسم) ، وعدد الجينات المخصبة في كل مسار. barplot.pdf هو مخطط شريطي ، و bubble.pdf هو مخطط فقاعي.
  4. ابحث IL-17 في ملف KEGG.txt ؛ تظهر النتيجة أن هناك مسارا واحدا فقط ؛ انسخ معرف المسار.
  5. افتح رمز R ، والصق معرف المسار IL-17 في KEGGID ، واستخدم حزمة pathview لتسمية خريطة المسار. قم بتشغيل رمز R المعدل واحصل على ملفين جديدين ، hsa04657.pathview.png و hsa04657.png.
    ملاحظة: ملف hsa04657.png هو خريطة المسار ، hsa04657.pathview.png هو خريطة المسار المسمى ، وتلك المسماة باللون الأحمر هي الجينات الموجودة في شبكة التفاعلات.

12. إعداد حبوب شياو ياو

ملاحظة: لمعرفة طريقة التحضير المستخدمة، يرجى الرجوع إلى دستور الأدوية الصيني5.

  1. خذ 100 غرام من تشاي هو ، و 100 غرام من أنجليكا سينينسيس ، و 100 غرام من بيونيا لاكتيفلورا البيضاء ، و 100 غرام من Atractylodes macrocephala، و 100 غرام من بوريا كوكوس ، و 80 غرام من Radix glycyrrhizae preparate ، و 20 غرام من Menthae herba.
  2. باستخدام مطحنة الحجر أو آلة البودرة ، سحق الأعشاب إلى مسحوق ناعم. يتم الجمع بين العديد من الأعشاب بالنسب المذكورة أعلاه وسحقها في مسحوق ناعم لخلطها معا بشكل طبيعي. استخدم غربال دواء مكون من 80 شبكة بقطر داخلي 180 ميكرومتر ± 7.6 ميكرومتر وقم بغربال المسحوق المسحوق. تخلط جيدا.
  3. خذ 100 غرام من الزنجبيل ، أضف الماء ، واغليه 2x لمدة 20 دقيقة في كل مرة. يصفى ويترك جانبا.
  4. خذ لوحة طبية ، واغمس مكنسة صغيرة في ماء الزنجبيل ، وفرشها على البلاك ، وخذ المسحوق أعلاه ، ورشها على ماء الزنجبيل ، واقلب البلاك بحيث يكون كل المسحوق مبللا ويمكن تشكيله على شكل كرة.
    ملاحظة: تشكيل اللوحة الطبية هو خطوة أساسية أثناء إعداد حبوب الطب الصيني التقليدي. سيتم تقسيم معظم خيزران موسو إلى شرائح ونسجها في هيكل عظمي. يتم نسج جلد الخيزران ، أو tengpi ، في السطح ، ويصبح مستديرا. يجب طلاء سطح اللوحة بطبقة رقيقة بزيت التونغ ثم تنظيفها بطبقة من الورنيش. يتم تجفيفه ليصبح مانعا لتسرب الماء. الحبوب المصنوعة بهذه الطريقة ستكون مستديرة وسلسة.
  5. فرشاة على ماء الزنجبيل مرة أخرى ، ورش مسحوق ، وتدوير لوحة بحيث يتم تقريب الدواء تدريجيا وتكبيره. ضع في مكان بارد للتجفيف.

13. إنشاء النموذج الحيواني

  1. بعد 7 أيام من التأقلم ، قسم الفئران التجريبية بشكل عشوائي إلى 4 مجموعات ، وهي مجموعة العمليات الوهمية (الشام ، حيث تمت إزالة الدهون حول المبايض فقط) وثلاث مجموعات من الفئران المبيض تتكون من مجموعة نموذجية (OVX) بالإضافة إلى مجموعات إدارة حبوب Xiaoyao منخفضة وعالية التركيز.
  2. تخدير الفئران ب 3٪ بنتوباربيتال الصوديوم (40 مجم / كجم) يتم حقنه داخل الصفاق. تأكد من أن الفئران تدخل حالة التخدير من خلال مراقبة استرخاء العضلات المعمم والتنفس العميق والبطيء والحركة البطيئة. ضع مرهم العين على عيون الفئران قبل الجراحة.
  3. ضع في وضعية الانبطاح واحلق المنطقة الكلوية من الظهر باستخدام ماكينة حلاقة. إجراء التطهير المحلي مع 75 ٪ من الإيثانول.
  4. قم بعمل شق طولي بحوالي 1 سم بشكل ثنائي ، بالقرب من المنطقة الظهرية للكلية ، وقم بشق اللفافة لفصل العضلات والبريتوني.
  5. حدد الجزء العلوي من قرن الرحم وقناتي فالوب للربط. أدخل ملقط في الشق للاستكشاف ، وحدد موقع المبيض ، المغطى بأنسجة دهنية في نمط قرنبيط أحمر فاتح ، مع قناة فالوب مرتبة حلزونيا أسفل المبيض ، تربط المبيض بقرن الرحم25. إزالة المبايض مع مقص الجراحية وخياطة.
  6. قم بإزالة كمية صغيرة من الأنسجة الدهنية بالقرب من المبيض كعنصر تحكم في مجموعة العمليات الوهمية. مراقبة حتى تستعيد وعيها. ضع ما بعد الجراحة في أقفاص منفصلة حتى الشفاء التام.
  7. لمنع العدوى ، قم بتزويد الفئران بالجنتاميسين لمدة 3 أيام بعد الجراحة. بعد العملية ، تأكد من اتباع نظام غذائي طبيعي وبيئة نمو جيدة وفقا للحالة الفعلية للفئران. إذا كان هناك أي تشوهات ، مثل عدوى الجرح أو فقدان الشهية ، استشر مدرب مركز المختبر على الفور.

14. إعطاء الدواء

ملاحظة: وفقا للمنهجية التجريبية لعلم الأدوية26 ، كان تحويل الجرعات البشرية والحيوانية المستخدمة 9 جم من حبوب Xiaoyao لشخص بالغ يبلغ وزنه 70 كجم ، أي ما يعادل جرعة واحدة (جرعة لإدارة واحدة).

  1. بالنسبة للمجموعات ذات الجرعات المنخفضة والعالية ، استخدم 0.683 جم / كجم و 2.73 جم / كجم ، على التوالي ، لمجموعة من 8. استخدم اليد اليسرى لشل حركة الماوس بحيث يكون فم الماوس في خط مستقيم مع المريء. أمسك إبرة التزويج في اليد اليمنى ، وأدخلها برفق في المريء على طول الجدار الخلفي للبلعوم من زاوية فم الماوس.
  2. في هذه المرحلة ، قد يتغير اتجاه إبرة التزويج قليلا لتحفيز عملية البلع المستحثة. حقن الدواء. قم بإجراء هذا مرة واحدة يوميا لمدة 12 أسبوعا.
  3. بالنسبة للمجموعات التي تديرها الوهمية والنموذجية ، يتم تطبيق محلول ملحي مرة واحدة يوميا لمدة 12 أسبوعا بكمية يحددها وزن.
  4. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم وقص أطرافها الخلفية. جلد الأطراف لفصل العضلات عن عظم الفخذ. علاج عظم الفخذ الفئران مع حل إزالة الكلس EDTA لمدة 1 شهر واستبدالها بمحلول جديد يوميا.

15. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE) تلطيخ

  1. إزالة أنسجة الفخذ لمدة 8 دقائق ثم وضعها في الإيثانول المتدرج لمدة 3 دقائق. شطف بالماء الجاري لمدة 1 دقيقة.
  2. أضف محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بالتنقيط إلى الأقسام لتغطية الأنسجة بالكامل ، وصمة عار لمدة 5 دقائق ، واغسلها بماء الصنبور
  3. أضف محلول تمايز حمض الهيدروكلوريك إلى الأنسجة الموجودة على الشريحة ، مع التأكد من أنه يغطي الأنسجة بالكامل. توقف عند ملاحظة تغير لون الأنسجة. شطف بماء الصنبور.
  4. أضف محلول صبغة Eosin بالتنقيط واتركه يغطي الأنسجة تماما ، ويعمل لمدة 30 ثانية إلى 2 دقيقة. شطف الصبغة الزائدة بالماء الجاري.
  5. قم بإجراء تجفيف الإيثانول المتدرج باستخدام 75٪ من الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، وقم بالتنظيف باستخدام محلول إزالة الشمع لمدة 3 دقائق.
  6. قم بإسقاط كمية مناسبة من اللثة المحايدة على الشريحة وفقا لحجم الأنسجة ، وقم بخفض الغطاء بعناية ، وتجنب فقاعات الهواء.

16. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وتحليل الكيمياء الهيستولوجية المناعية

  1. إزالة العضلات والأربطة الزائدة حول عينات عظم الفخذ من مجموعات مختلفة من الفئران وإصلاح أنسجة العينة في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة.
  2. قم بتجفيف أنسجة العظام في الهواء وإجراء التصوير المقطعي المحوسب الدقيق عن طريق مسح أنسجة العظام من أجل الحصول على بيانات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ثلاثية الأبعاد.
  3. من كتل شمع الماوس المحفوظة ، قم بتقطيعها إلى أقسام متصلة بسمك 6 ميكرومتر واخبز الشرائح على حرارة 70 درجة مئوية -72 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  4. قم بإزالة الشمع لمدة 8 دقائق ، متبوعا بمعالجة الإيثانول اللامائية بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق ، والإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، وشطف PBS لمدة 5 دقائق لمدة 3x.
  5. قم بإجراء إصلاح EDTA بالضغط العالي لمدة 15 دقيقة متبوعا بغسل PBS لمدة 5 دقائق لمدة 3x.
  6. أضف 3٪ بيروكسيد الهيدروجين بالتنقيط إلى الأنسجة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لمدة 3 أضعاف.
  7. استخدم قلم الكيمياء الهيستولوجية المناعية لرسم دائرة. يغسل مع غسل PBS لمدة 3 دقائق لمدة 3x.
  8. بقعة في الجسم المضاد الأساسي (مضاد ل ALP أرنب pAb (1: 200) ، أرنب مضاد COL-1 pAb (1: 200) ، أرنب مضاد IL-17 pAb (1: 275) ، مضاد Act1 (1: 500) ، مضاد ل IL-6 أرنب pAb (1: 500)) طوال الليل ، متبوعا بشطف مؤقت PBS لمدة 5 دقائق لمدة 3x.
  9. أضف بالتنقيط الجسم المضاد الثانوي (Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG المترافق HRP (H + L ؛ 1: 2000)) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. يغسل مع العازلة PBS لمدة 3 دقائق لمدة 3x.
  10. احتضان في DAB جاهزة للاستخدام لمدة 3-5 دقائق ، ثم شطف مع برنامج تلفزيوني.
  11. أداء إعادة تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق ، تليها شطف PBS.
  12. استخدم محلول التمايز لمدة 10 ثوان تقريبا ، متبوعا بشطف PBS.
  13. أضف محلول أزرق عائد لمدة 10 ثوان ، متبوعا بشطف PBS.
  14. قم بإجراء 75٪ من معالجة الإيثانول اللامائية لمدة 5 دقائق ، والإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، ومسح لمدة 3 دقائق. استخدم راتنجا محايدا لختم الشرائح.

النتائج

المكونات النشطة وأهداف عمل حبوب Xiaoyao
من خلال البحث في قاعدة بيانات TCMSP والفحص وفقا لمعايير التوافر البيولوجي عن طريق الفم (OB) ≥ 30٪ والخصائص الشبيهة بالأدوية (DL) ≥ 0.18 ، تم العثور على 125 مكونا نشطا في حبوب Xiaoyao. من بينها ، المكونات 6 و 4 و 9 و 13 و 2 و 6 و 83 و 2 كانت من White Paeonia lactiflora و Atr...

Discussion

وفقا للإحصاءات ، تسبب هشاشة العظام 1.5 مليون كسور كل عام في الولايات المتحدة ، والغالبية العظمى منها تحدث عند النساء بعد انقطاعالطمث 27. مع زيادة عدد السكان المسنين ، من المتوقع أن تحدث غالبية كسور الورك المستقبلية في العالم في آسيا وأنه بحلول عام 2050 ، سيصل العدد الإجمالي لهذه ا?...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

دعم برنامج البحث العلمي وتطوير التكنولوجيا في مدينة بايز (20224128) هذا العمل. يشكر المؤلفون الدكتور ديف سورانا من إمبريال كوليدج لندن و YMUN على تحرير المخطوطة. ساهمت YYX و ZYW بالتساوي في هذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1ml SamplerGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001For anesthesia in mice
4%polyformaldehydeBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.P1110For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06For postoperative suturing
Absorbent cotton ballWinnerMIANQIU-500gFor sterilization and hemostasis
Adhesive slidesJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105For tissue sectioning
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLFor anesthesia in mice
Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1866Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 miceBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)For use in animal experiments
Carbon steel surgical bladesPremier Medical Equipment Co.SP239For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAbBIOSS ANTIBODIESbs-6202RBinds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1140For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibodyproteintech14695-1-APBinds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20xBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.DA1010For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.E1171-500mlFor tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching BufferBeyotime BiotechnologyP0100BSequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquidServicebioG1128-1LFor dewaxing paraffin sections
Ethyl AlcoholCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody DiluentEpizyme BiotechPS119LFor antibody dilution
Hematoxylin Differentiation SolutionServicebioG1039-500MLFor differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining KitBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1120-3*100mlFor tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handlePremier Medical Equipment Co.SP0088For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-2Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibodyproteintech13082-1-APBinds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibodyproteintech21865-1-APBinds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry penBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4For postoperative suturing
Neutral BalsamBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G8590As a slice sealer
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)Epizyme BiotechPS108PAvoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibodyBIOSS ANTIBODIESbs-6292RBinds to alkaline phosphatase in tissues
SalineAffiliated Hospital Youjiang Medical University For NationalitiesLHN500For animals by gavage
Shaving/Electric clippersHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse NeedlePremier Medical Equipment Co.SP784For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)ZhuoyouyueYKNWW-10.5For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight TipPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJFor mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm ElbowGWJ-12-55WFor use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)proteintechPR30002For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cmJP16*24For mouse surgery
Xiaoyao pillsJiuzhitang Co.,Ltd.YPG-041For animal drug delivery
Others
R 4.3.1Data processing
Cytoscape3.9.1National Resource for Network BiologyBuilding a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54fNational Institutes of HealthImage processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0AdobeFor image combination
GraphpadPrism 9.5GraphPad SoftwareStatistical analysis of data
cellsens DimensionOLYMPUSFor slicing and photographing
OLYMPUS BX53OLYMPUSFor HE staining and immunohistochemical section photography

References

  1. Kanis, J. A., Melton, L. J., Christiansen, C., Johnston, C. C., Khaltaev, N. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res. 9 (8), 1137-1141 (1994).
  2. Amin, U., Mcpartland, A., O'sullivan, M., Silke, C. An overview of the management of osteoporosis in the aging female population. Womens Health (Lond). 19, 17455057231176655 (2023).
  3. Słupski, W., Jawień, P., Nowak, B. Botanicals in postmenopausal osteoporosis. Nutrients. 13 (5), 1609 (2021).
  4. Sharma, A., et al. Understanding the mechanistic potential of plant based phytochemicals in management of postmenopausal osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114850 (2023).
  5. . Pharmacopoeia of people's republic of china. Chinese Pharmacopeia Commission. , (2020).
  6. Ji, Y., et al. Xiaoyao pills ameliorate depression-like behaviors and oxidative stress induced by olfactory bulbectomy in rats via the activation of the pik3ca-akt1-nfe2l2/bdnf signaling pathway. Front Pharmacol. 12, 643456 (2021).
  7. Lencel, P., Magne, D. Inflammaging: The driving force in osteoporosis. Med Hypotheses. 76 (3), 317-321 (2011).
  8. Daoussis, D., Andonopoulos, A. P., Liossis, S. N. Wnt pathway and il-17: Novel regulators of joint remodeling in rheumatic diseases. Looking beyond the rank-rankl-opg axis. Semin Arthritis Rheum. 39 (5), 369-383 (2010).
  9. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Netw. 18 (1), e8 (2018).
  10. Amatya, N., Garg, A. V., Gaffen, S. L. Il-17 signaling: The yin and the yang. Trends Immunol. 38 (5), 310-322 (2017).
  11. Shi, B., et al. Xiaoyao pills prevent lipopolysaccharide-induced depression by inhibiting inflammation and protecting nerves. Front Pharmacol. 10, 1324 (2019).
  12. Fang, Y., et al. Xiaoyao pills attenuate inflammation and nerve injury induced by lipopolysaccharide in hippocampal neurons in vitro. Neural Plast. 2020, 8841332 (2020).
  13. Zhang, X., et al. Effect of xiaoyao pills on fecal endogenous metabolites in rats with metabolism-associated steatohepatitis. J Shanxi Med University. 55, 36-43 (2024).
  14. Xiao, J., et al. Il-17 in osteoarthritis: A narrative review. Open Life Sci. 18 (1), 20220747 (2023).
  15. Mcgeachy, M. J., Cua, D. J., Gaffen, S. L. The il-17 family of cytokines in health and disease. Immunity. 50 (4), 892-906 (2019).
  16. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13 (2014).
  17. Wang, T., et al. Exploring the mechanism of luteolin by regulating microglia polarization based on network pharmacology and in vitro experiments. Sci Rep. 13 (1), 13767 (2023).
  18. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  19. Barshir, R., et al. Genecarna: A comprehensive gene-centric database of human non-coding rnas in the genecards suite. J Mol Biol. 433 (11), 166913 (2021).
  20. Wang, T., Jiang, X., Lu, Y., Ruan, Y., Wang, J. Identification and integration analysis of a novel prognostic signature associated with cuproptosis-related ferroptosis genes and relevant lncrna regulatory axis in lung adenocarcinoma. Aging (Albany NY). 15 (5), 1543-1563 (2023).
  21. Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Scott, A. F., Hamosh, A. Omim.Org: Leveraging knowledge across phenotype-gene relationships. Nuc Acid Res. 47 (D1), D1038-D1043 (2019).
  22. Whirl-Carrillo, M., et al. An evidence-based framework for evaluating pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 110 (3), 563-572 (2021).
  23. Zhou, Y., et al. Ttd: Therapeutic target database describing target druggability information. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1465-D1477 (2024).
  24. Knox, C., et al. Drugbank 6.0: The drugbank knowledgebase for 2024. Nuc Acid Res. 52 (D1), D1265-D1275 (2024).
  25. Rendi, M. H., Muehlenbachs, A., Garcia, R. L., Boyd, K. L. . Comparative anatomy and histology a mouse and human atlas. Chapter 17, 253-284 (2012).
  26. Chen, S. X. R. B. X. . Pharmacology experimental methodology. , (2002).
  27. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical practice. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  28. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  29. Walker, M. D., Shane, E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 389 (21), 1979-1991 (2023).
  30. Hwang, Y. H., Jang, S. A., Lee, A., Kim, T., Ha, H. Poria cocos ameliorates bone loss in ovariectomized mice and inhibits osteoclastogenesis in vitro. Nutrients. 12 (5), 1383 (2020).
  31. Ling, X., et al. Shu-di-huang and gan-cao herb pair restored the differentiation potentials of mesenchymal stem progenitors in treating osteoporosis via downregulation of nf-κb signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 7795527 (2021).
  32. Zhou, L. P., et al. protective effects of danggui buxue tang alone and in combination with tamoxifen or raloxifene in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 9, 779 (2018).
  33. Huangfu, L., Li, R., Huang, Y., Wang, S. The il-17 family in diseases: From bench to bedside. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 402 (2023).
  34. Majumder, S., Mcgeachy, M. J. Il-17 in the pathogenesis of disease: Good intentions gone awry. Annu Rev Immunol. 39, 537-556 (2021).
  35. Le Goff, B., et al. Implication of il-17 in bone loss and structural damage in inflammatory rheumatic diseases. Mediators Inflamm. 2019, 8659302 (2019).
  36. Zhang, J. R., et al. Different modulatory effects of il-17, il-22, and il-23 on osteoblast differentiation. Mediators Inflamm. 2017, 5950395 (2017).
  37. Peng, R., et al. Il-17 promotes osteoclast-induced bone loss by regulating glutamine-dependent energy metabolism. Cell Death Dis. 15 (2), 111 (2024).
  38. Sato, K., et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper t cell subset that links t cell activation and bone destruction. J Exp Med. 203 (12), 2673-2682 (2006).
  39. Shetty, S., Kapoor, N., Bondu, J. D., Thomas, N., Paul, T. V. Bone turnover markers: Emerging tool in the management of osteoporosis. Indian J Endocrinol Metab. 20 (6), 846-852 (2016).
  40. Selvaraj, V., Sekaran, S., Dhanasekaran, A., Warrier, S. Type 1 collagen: Synthesis, structure and key functions in bone mineralization. Differentiation. 136, 100757 (2024).
  41. Hu, T., et al. Xiaoyao san attenuates hepatic steatosis through estrogen receptor α pathway in ovariectomized apoe-/- mice. J Ethnopharmacol. 282, 114612 (2022).
  42. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  43. Schroeder, R. J., et al. Oral therapeutics post menopausal osteoporosis. Cureus. 15 (8), e42870 (2023).
  44. Patel, D., Gorrell, C., Norris, J., Liu, J. A narrative review of the pharmaceutical management of osteoporosis. Ann Jt. 8, 25 (2023).
  45. Minisola, S. Denosumab discontinuation: Covid-19 pandemic and beyond. JBMR Plus. 8 (7), ziae046 (2024).
  46. ACOG Committee on Clinical Practice Guidelines-Gynecology. Management of postmenopausal osteoporosis: ACOG clinical practice guideline no. 2. Obstet Gynecol. 139 (4), 698-717 (2022).
  47. Peng, Z., Xu, R., You, Q. Role of traditional Chinese medicine in bone regeneration and osteoporosis. Front Bioeng Biotechnol. 10, 911326 (2022).
  48. Li, J., et al. Clinical practice of traditional Chinese medicine for the treatment of postmenopausal osteoporosis: A literature review. Climacteric. 25 (6), 562-569 (2022).
  49. Zhang, N. D., et al. Traditional Chinese medicine formulas for the treatment of osteoporosis: Implication for antiosteoporotic drug discovery. J Ethnopharmacol. 189, 61-80 (2016).
  50. Ping, R., et al. Identifying the effective combination of acupuncture and traditional Chinese medicinal herbs for postmenopausal osteoporosis therapy through studies of their molecular regulation of bone homeostasis. J Tradit Chin Med. 44 (1), 212-219 (2024).
  51. Li, B., Jiang, C., Zhan, X. Combined therapy of yishen zhuanggu decoction and caltrate d600 alleviates postmenopausal osteoporosis by targeting foxo3a and activating the wnt/β-catenin pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 7732508 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved