Estudos sobre o efeito anti-inflamatório das pílulas Xiaoyao no tratamento da osteoporose pós-menopausa em camundongos

Resumo

A osteoporose pós-menopausa tornou-se um problema de saúde pública global. O objetivo deste estudo é explorar os efeitos terapêuticos e os mecanismos relacionados das pílulas Xiaoyao da medicina tradicional chinesa nessa condição.

Resumo

A osteoporose é uma doença metabólica comum em mulheres idosas e na pós-menopausa, sem sintomas óbvios durante seus estágios iniciais. Nos últimos estágios dessa condição, os pacientes são propensos a fraturas, o que pode afetar seriamente sua saúde e qualidade de vida. O aumento mundial da expectativa de vida tornou a osteoporose uma preocupação global. As pílulas Xiaoyao foram anteriormente
usado no tratamento da depressão. Além disso, a droga parecia ter atividade semelhante ao estrogênio, que afetou a expressão de ALP, um marcador precoce específico de osteoblastos, e COL-1, um componente importante da matriz extracelular óssea. As pílulas Xiaoyao foram avaliadas quanto aos seus efeitos na osteoporose pós-menopausa (PMOM) em camundongos. As informações de destino de cada componente herbal das pílulas Xiaoyao foram acessadas por meio do banco de dados de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP). Informações de GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank e outros sites foram usadas para construir a rede regulatória do complexo fitoterápico por meio da rede Cytoscape e String para avaliar as interações proteicas. Os camundongos foram ovariectomizados e tratados com altas e baixas doses de pílulas Xiaoyao e estes foram comparados aos controles. Seus sintomas foram avaliados por imunocitoquímica dos tecidos ósseos. Os resultados sugeriram que as pílulas Xiaoyao tiveram a capacidade de aliviar os sintomas de PMOM em camundongos ovariectomizados através da via de sinalização IL-17. Este medicamento tem o potencial de se tornar um novo agente terapêutico para o tratamento da osteoporose.

Introdução

A Organização Mundial da Saúde (OMS) define a osteoporose (PO) como uma doença caracterizada pela diminuição da massa óssea e deterioração da microarquitetura do tecido ósseo, levando a um aumento da fragilidade óssea e, portanto, a um aumento do risco de fratura¹. O significado clínico da osteoporose é que ela pode levar a fraturas, que estão associadas a alta mortalidade, morbidade e custos econômicos². A osteoporose pós-menopausa (PMOP) é causada por uma diminuição nos níveis de estrogênio em mulheres após a menopausa, o que leva a um aumento na atividade dos osteoclastos, resultando em perda óssea e destruição da microestrutura óssea. Isso geralmente causa osteoporose com sério impacto na saúde³. As terapias atuais para PMOP incluem terapia de reposição de estrogênio, bifosfonatos e paratormônio, mas podem ter graus variados de efeitos adversos, adesão insuficiente a longo prazo e altos custos⁴. Portanto, a fitoterapia acessível é uma alternativa viável para uma grande proporção da população.

As pílulas Xiaoyao estão incluídas na Farmacopeia^{Chinesa 5} e contêm oito componentes à base de plantas, incluindo Chai Hu, Angelica sinensis, Paeonia lactiflora branca, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, alcaçuz e gengibre fresco. Todas essas ervas são conhecidas por serem eficazes na desintoxicação do fígado e no fortalecimento do baço, na nutrição do sangue e na regulação do ciclo menstrual, e a mistura também tem sido usada para tratar^{a depressão.} No entanto, o papel das pílulas Xiaoyao na osteoporose não é claro.

Estudos iniciais sugeriram que a inflamação pode levar à perda óssea⁷ e que o declínio da densidade óssea associado a esse processo pode ser acelerado pela menopausa. Além disso, existe uma forte relação entre o desenvolvimento de osteoporose e inflamação. O fator inflamatório, interleucina-17 (IL-17), é um fator pró-inflamatório secretado pelas células Th17, um subconjunto de linfócitos T CD4+. Essas células estão associadas a várias condições inflamatórias crônicas e desempenham um papel importante no desenvolvimento da destruição óssea na artrite reumatoide⁸. Além disso, a IL-17 estimula o ativador do receptor ligante do fator nuclear κ B (RANKL), que regula a osteoclastogênese, levando a uma maior reabsorção óssea do que a formação óssea⁹. A IL-17 estimula a expressão de outras citocinas osteoclastogênicas, como TNFα, IL-1, IL-6 e IL-8. Tem a capacidade de sinergizar com outros fatores inflamatórios, tornando-se um importante efetor inflamatório¹⁰.

Estudos também mostraram uma ligação entre as pílulas Xiaoyao e a inflamação. Shi et ^al.11 e Fang et ^al.12 confirmaram recentemente que as pílulas Xiaoyao podem reduzir os níveis de IL-6 e TNF-α, respectivamente. Em outro estudo de esteato-hepatite associada ao metabolismo, foi relatado que as pílulas Xiaoyao poderiam regular positivamente a expressão de ácido propiônico, que por sua vez inibe a expressão de TNF-α e exerce um efeito anti-inflamatório¹³. No entanto, no momento, não se sabe se as pílulas Xiaoyao podem regular o desenvolvimento de PMOM mediando uma resposta inflamatória através da IL-17, que foi o objetivo deste estudo.

Este estudo previu a interseção dos alvos das pílulas Xiaoyao e genes relacionados à osteoporose por meio de farmacologia de rede e análise de bioinformática e analisou os genes de interseção para interações proteicas, GO e KEGG. Com base nos resultados previstos, pode-se observar a expressão de Act1 e IL-6, que são proteínas-chave na via de sinalização da IL-17 ^14,15, bem como os marcadores de remodelação óssea fosfatase alcalina (ALP) e colágeno tipo I (COL-1), para observar a eficácia terapêutica das pílulas Xiaoyao no modelo de camundongos PMOM.

Protocolo

O Comitê de Ética em Animais de Laboratório da Universidade Médica de Youjiang para Nacionalidades aprovou o protocolo do estudo (número de aprovação: 2022101502). Camundongos C57BL/6 fêmeas, com idade entre 10 e 12 semanas, classe SPF e pesos corporais (22 ± 2) g, foram alojados no Centro de Experimentos Animais da Classe SPF da Universidade Médica de Youjiang para Nacionalidades. Os animais experimentais foram mantidos a uma temperatura de 24-26 °C e umidade relativa de 55% a 60%.

1. Base de dados e plataforma de análise de farmacologia de sistemas de medicina tradicional chinesa

NOTA: O Banco de Dados e Análise de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) são plataformas de farmacologia de medicina chinesa que contêm informações sobre ingredientes da MTC, propriedades relacionadas ao ADME, alvos e doenças^16,17.

1. Acesse a interface web do TCMSP. Pesquise o nome de Herb, digite o nome do medicamento chinês e clique em Pesquisar. Clique em Nome latino nos resultados da pesquisa. Realize a triagem dos resultados dos ingredientes com os parâmetros OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18.
2. Copie todos os resultados e salve-os no formato TXT, denominado Medicina Chinesa Name_ingredients.txt.
3. Em Informações de Destinos na guia Destinos Relacionados, filtre por ID do Mol (ou seja, o resultado na etapa 1.2).
4. Copie os resultados filtrados e salve-os no formato TXT chamado Chinese Medicine Name_targets.txt.
   NOTA: Através das etapas acima, todos os ingredientes ativos elegíveis e as informações de destino correspondentes da medicina tradicional chinesa (MTC) foram obtidos.
5. Coloque todos os arquivos ingredients.txt e targets.txt acima na mesma pasta e coloque os scripts Perl (Arquivo de Codificação Suplementar 1) nessa pasta.
6. Abra o CMD, digite o caminho da pasta cd, digite-o e execute o script Perl. Obtenha um novo arquivo de texto (allTargets.txt). Este novo arquivo de texto (allTargets.txt) contém o nome da erva, o nome do ingrediente, o ID do ingrediente e o alvo.

2. Banco de dados UniProt

NOTA: O banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/) contém sequências de proteínas humanas anotadas com informações funcionais e é usado para normalizar os nomes dos alvos para seus nomes oficiais¹⁸.

1. Vá para a interface da Web do UniProt. Clique na guia Pesquisar , selecione UniProtKB e clique em Pesquisar.
2. Filtre na barra lateral esquerda, selecione Revisado (Swiss-Prot) para Status e Humano para organismos populares. Clique em Baixar, selecione Baixar tudo, selecione TSV para Formato e clique em Baixar para baixar o arquivo de anotação.
3. Descompacte o arquivo baixado na pasta atual, abra o arquivo descompactado e copie e cole-o em um arquivo de texto chamado ann.txt.

3. Conversão de ID de alvo de medicamento

1. Coloque todos os arquivos de destino de drogas allTargets.txt obtidos na seção 1 e o arquivo de anotação UniProt ann.txt obtido na seção 2 em uma pasta e coloque os scripts Perl (Arquivo de Codificação Suplementar 2) nela.
2. Abra o CMD, digite cd + espaço + caminho da pasta, insira-o e execute o script Perl para obter um novo arquivo de texto (allTargets.symbol.txt). Este novo arquivo de texto (allTargets.symbol.txt) contém o nome da erva, o ID do ingrediente, o nome do ingrediente e o ID do gene.

4. Pesquisa em banco de dados

1. GeneCards: Banco de dados de genes humanos (GeneCards)
   NOTA: O banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/) fornece informações de previsão e anotação para genes humanos. É usado para acessar alvos de doenças ^19,20.
   1. Vá para a interface da Web do GeneCards. Digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
   2. Clique em Exportar e selecione Exportar para o Excel.
   3. Abra o arquivo baixado, copie os genes com pontuação de relevância ≥ 1, cole e salve-os em um arquivo chamado GeneCards.txt.
2. Banco de dados OMIM
   NOTA: O banco de dados OMIM (https://omim.org) contém genes humanos, doenças genéticas e características²¹.
   1. Vá para a interface da Web do OMIM. Clique em GENE Map, digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
   2. Clique em Baixar como e selecione Arquivo do Excel.
   3. Abra o arquivo baixado, copie o nome do gene na coluna Símbolo Aprovado, cole-o e salve-o em um arquivo chamado OMIM.txt.
3. Banco de dados PharmGkb
   NOTA: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), a base de conhecimento farmacogenômica, contém anotações de rótulos de medicamentos, vias centradas em medicamentos, resumos farmacogenéticos e relações entre genes, medicamentos e doenças²².
   1. Acesse a interface do site do PharmGkb. Digite osteoporose na caixa de pesquisa, clique em Pesquisar e marque Gene na barra lateral esquerda.
   2. Insira todos os resultados manualmente e salve-os em um arquivo chamado PharmGkb.txt.
4. TTD: Banco de dados de alvos terapêuticos (TTD)
   NOTA: O banco de dados TTD (https://idrblab.org/ttd/) fornece informações sobre alvos de proteínas e ácidos nucleicos, doenças-alvo, informações sobre vias e medicamentos correspondentes para cada alvo²³.
   1. Vá para a interface da Web do TTD. Digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
   2. Clique em Informações do Destino em ID do Destino no resultado, copie o Nome do Destino, cole-o e salve-o em um arquivo chamado TTD.txt. Um total de 33 resultados foram obtidos. Salve cada resultado da mesma maneira.
5. Banco de dados do DrugBank Online (DrugBank)
   NOTA: O banco de dados do DrugBank (https://go.drugbank.com) contém informações sobre medicamentos e alvos de medicamentos, interações medicamentosas, mecanismos de medicamentos e metabolismo de medicamentos²⁴.
   1. Acesse a interface do site do DrugBank. Selecione Indicações na guia de pesquisa, digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
   2. Clique na entrada Osteoporose nos resultados para obter mais informações, clique na guia MEDICAMENTOS E ALVOS e clique no link apropriado na coluna ALVO da tabela.
   3. Clique em Detalhes em Proteína, copie o Nome do gene, cole-o e salve-o em um arquivo chamado DrugBank.txt. Salve cada resultado da mesma maneira.

5. Diagrama de Venn

1. Fusão de genes associados à doença e mapeamento de Venn
   1. Coloque os arquivos txt salvos, bem como o script na mesma pasta.
   2. Abra o código R (Merge Disease-Related Genes), copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está armazenado na linha onde o setwd está localizado no código R.
   3. Abra o software R, execute o código R modificado e salve. Defina o gene, nomeie o arquivo Disease.txt.
   4. Abra o site Draw Venn Diagram; na seção de entrada, copie e cole o conteúdo do texto salvo nas seções 4 a 8, um por um, na lista, nomeando-o com o respectivo banco de dados e clicando em Enviar.
   5. Clique em Salvar imagem como PNG abaixo da imagem e salve o resultado do texto na mesma pasta.
2. Interseção de alvos de drogas e genes associados a doenças
   1. Coloque o arquivo allTargets.symbol.txt obtido na seção 3 e o arquivo Disease.txt obtido na etapa 5.1.3 na mesma pasta.
   2. Abra o código R (alvo do medicamento e interseção de genes relacionados à doença), copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está armazenado na linha onde o setwd está localizado no código R.
   3. Abra o software R, execute o código R modificado e salve. Defina o gene, nomeie o arquivo Drug_Disease.txt.
   4. Abra o site Desenhar Diagrama de Venn. Na seção de entrada, copie e cole allTargets.symbol.txt e Disease.txt na lista e nomeie-os com seus respectivos arquivos.
   5. Clique em Salvar imagem como PNG abaixo da imagem e salve os resultados de texto na mesma pasta.

6. Construção da rede regulatória de compostos TCM

1. Coloque o arquivo allTargets.symbol.txt obtido na seção 3 na mesma pasta que o arquivo Disease.txt e o script Perl correspondente (Arquivo de Codificação Suplementar 3).
2. Abra o CMD, digite o caminho do arquivo cd, pressione Enter e execute o script Perl. Obtenha quatro novos arquivos txt: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt e net.type.txt. O arquivo network.txt contém o ID do ingrediente TCM, o gene alvo, a relação alvo e o nome do ingrediente. net.type.txt contém o nome do nó, os atributos e a afiliação. net.geneLists.txt é a lista de genes e net.molLists.txt é a lista de ingredientes.
3. Copie os arquivos de texto recém-obtidos na mesma nova pasta.
4. Abra o software Cytoscape 3.9.1, clique em Arquivo, clique em Importar e selecione Arquivo de formulário de rede. Selecione net.network.txt, coloque a primeira coluna de ID do componente como Nó de origem, a segunda coluna de Genes como Nó de destino e a terceira coluna de Relacionamento de direcionamento como Tipo de interação e clique em OK.
5. Importe net.type.txt da janela Tabela de Nós. Clique na guia Selecionar, selecione Nós, selecione Do arquivo de lista de ID, selecione net.geneLists.txt e clique em Abrir.
6. Clique na guia Layout, selecione Layout de círculo classificado por grau e selecione Somente nós selecionados. Ajuste a altura e a largura dos nós para 70.
7. Clique na Segunda Caixa em Altura, selecione degree.layout em Coluna, selecione Mapeamento Contínuo em Tipo de Mapeamento e clique duas vezes na Janela de Ajuste de Altura no lado direito do Mapeamento Atual para ajustar os limites superior e inferior da altura para um intervalo adequado.
8. Repita a operação com a opção Largura.
9. Clique na guia Layout novamente e clique em Ferramentas de layout > Ajustar a escala para que os nós não se sobreponham.
10. Clique na janela superior direita do software para desmarcar a rede do nó, clique na guia Selecionar , selecione Nós, selecione Do arquivo de lista de ID, selecione net.molLists.txt e clique em Abrir.
11. Clique na guia Layout, selecione Layout de atributos de grupo, selecione Somente nós selecionados e clique em Tipo.
12. Clique em Tamanho da fonte do rótulo na coluna esquerda e defina o Valor padrão como 12. Clique em Valor Padrão na Imagem/Gráfico 1 na coluna da esquerda.
13. Selecione Gráficos na janela pop-up, clique em Gráfico de pizza e selecione os Itens na coluna Colunas disponíveis, exceto grau. Layout na coluna de colunas selecionadas e clique em Aplicar.
14. Clique em Border Paint na coluna da esquerda e defina o Valor padrão como #003EF8. Clique na guia Edge na parte inferior da barra lateral esquerda e defina Largura para 0,8.
15. Clique em Arquivo na barra de ferramentas superior, selecione Exportar e, em seguida, selecione Rede para imagem.
16. Na janela pop-up, selecione o formato PNG para Formato, selecione o diretório de salvamento e nomeie a rede de imagens, ajuste o Zoom no tamanho da imagem para o máximo de 500%, selecione Fundo transparente e clique em OK para terminar de salvar a imagem.

7. Construções de Redes de Interação Proteína-Proteína (PPI)

1. Abra o site do STRING (https://string-db.org/), clique em Proteína Múltipla, clique em Procurar em Carregar um arquivo, selecione o arquivo Drug_Disease.txt obtido na etapa 5.2.3 e selecione Homo sapiens em Organismos. Clique em Pesquisar e clique em Continuar.
2. Clique em Configurações, defina a pontuação mínima de interação necessária para a confiança mais alta (0,900) e marque Ocultar nós desconectados na rede nas opções de exibição de rede. Clique em Atualizar.
3. Faça ajustes nos nós do diagrama de rede para que não haja sobreposição ou oclusão.
4. Clique em Exportações e clique em Baixar como um bitmap de alta resolução para obter o mapa da rede de entrelaçamento de proteínas no formato PNG. Além disso, baixe o arquivo TSV como uma saída de texto tabular curta. Salve os dois arquivos em uma pasta unificada. O arquivo TSV contém o nome do gene, o ID interno da STRING e as pontuações para diferentes atributos.

8. Construção do núcleo da rede PPI

1. Coloque o arquivo TSV obtido na seção 7 e os scripts Perl necessários em uma nova pasta.
2. Abra o software Cytoscape 3.9.1, clique em Arquivo, selecione Importar, clique em Rede do arquivo, selecione o arquivo TSV acima, coloque a primeira coluna node1 como Nó de origem e a segunda coluna node2 como Nó de destino e clique em OK.
3. Clique em Estilo na barra lateral esquerda, clique em Valor padrão em Largura e defina-o como 60. Arraste e solte os nós para que não haja sobreposição e oclusão na rede.
4. Clique em APPs na barra de ferramentas superior, clique em CytoNCA e clique em Abrir.
5. Na coluna da esquerda, selecione Sem peso em Intermediário, Proximidade, Grau, Vetor próprio, Método baseado em conectividade média local e Rede e clique em Analisar.
6. Quando a análise estiver concluída, clique em Tabela de nós na janela inferior direita, clique em Exportar, salve-o na pasta e nomeie-o como pontuação 1.
   NOTA: O plug-in CytoNCA precisa ser instalado no software Cytoscape. Para fazer isso, clique em Aplicativos na barra de ferramentas superior, clique em Gerenciador de aplicativos, digite CytoNCA na caixa de pesquisa, marque CytoNCA na coluna do meio dos resultados retornados e clique em Instalar.
7. Abra score1, ajuste a coluna de nome para a primeira coluna, copie as informações da tabela, cole-as em um novo arquivo de texto, nomeie-o score1.txt e salve-o.
8. Abra o código R e copie e cole o caminho onde o arquivo score1.txt está localizado na linha onde o setwd está localizado no código R.
9. Abra o software R e execute o código modificado para obter dois novos arquivos, score2.txt e score2.gene.txt. O arquivo score2.txt contém os genes para os quais todas as pontuações do programa foram maiores que a mediana e as pontuações específicas para cada programa. score2.gene.txt contém os genes que pontuaram mais do que a mediana para todos os itens.
10. Para continuar no Cytoscape, clique em AnalysisPanel 1 na janela inferior direita, clique em Carregar do arquivo no lado esquerdo da janela, selecione o score2.gene.txt, clique em Abrir e toque em OK na janela pop-up.
11. Clique em Selecionar nós na parte inferior e clique em OK na janela pop-up.
12. Clique em Arquivo na barra de ferramentas superior, selecione Exportar, clique em Rede para imagem, ajuste o Zoom (%) em Tamanho da imagem para o máximo de 500%, marque Fundo transparente e salve o arquivo na mesma pasta, nomeie-o como rede1.
13. Clique em Criar sub-rede na barra lateral direita da janela inferior para criar uma sub-rede, analise a sub-rede, clique em APPs na barra de ferramentas na parte superior, clique em CytoNCA e clique em Abrir.
14. Na barra lateral esquerda, selecione Sem peso em Intermediário, Proximidade, Grau, Vetor próprio, Método baseado em conectividade média local e Rede e clique em Analisar.
15. Quando a análise estiver concluída, clique em Tabela de nós na janela inferior direita, clique em Exportar e salve-a em uma nova pasta chamada score2.
16. Abra a pontuação2, ajuste a coluna de nome para a primeira coluna, copie as informações da tabela, cole-as em um novo arquivo de texto, nomeie-o score2.txt e salve-o.
17. Abra o código R e copie e cole o caminho onde o arquivo score2.txt está localizado na linha onde o setwd está localizado no código R.
18. Abra o software R e execute o código modificado para obter dois novos arquivos: score3.txt e score3.gene.txt. O arquivo score3.txt contém os genes que pontuaram mais do que a mediana para todos os itens e as pontuações específicas para cada item. score3.gene.txt contém os genes que pontuaram mais do que a mediana para todos os itens.
19. Para continuar no Cytoscape, clique em AnalysisPanel 1 na janela inferior direita, clique em Carregar do arquivo no lado esquerdo da janela, selecione a score3.gene.txt, clique em Abrir e toque em OK na janela pop-up.
20. Clique em Selecionar nós na parte inferior e clique em OK na janela pop-up.
21. Clique em Arquivo na barra de ferramentas superior, selecione Exportar, clique em Rede para imagem, ajuste o zoom (%) no tamanho da imagem para 500%, marque Fundo transparente e salve o arquivo na mesma pasta usada nesta etapa, nomeando-o rede2.
22. Clique em Criar sub-rede na barra lateral direita da janela abaixo para criar uma sub-rede.
23. Clique em Arquivo na barra de ferramentas na parte superior, selecione Exportar, clique em Rede para imagem, ajuste o Zoom (%) no tamanho da imagem para o máximo de 500%, marque Fundo transparente e salve o arquivo na mesma pasta usada nesta etapa e nomeie-o como rede3.

9. Conversão de ID de gene

1. Coloque o arquivo Drug_Disease.txt na mesma nova pasta que o arquivo de código necessário.
2. Abra o código R (Arquivo de Codificação Suplementar 4) e copie e cole o caminho onde o arquivo Drug_Disease.txt está localizado na linha onde o setwd está localizado no código R.
3. Abra o software R, execute o código modificado usando a organização. Hs.eg.db pacote para converter o ID do gene e executar após a conclusão de um novo arquivo id.txt. O id.txt contém o símbolo do gene e o ID correspondente.

10. Análise de enriquecimento GO

1. Coloque o arquivo id.txt da etapa anterior na mesma pasta que o código de análise de enriquecimento GO.
2. Abra o código R (Arquivo de Codificação Suplementar 5) e defina o diretório de trabalho como id.txt e o caminho onde o código GO está armazenado.
3. Abra o software R, execute o código modificado e use clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enriqueça o gráfico, o gráfico ggplot2, os histogramas de análise de enriquecimento GO e os gráficos de bolhas. Obtenha três novos arquivos, GO.txt, barplot.pdf e bubble.pdf, após a conclusão da execução.
   NOTA: O GO.txt é o arquivo de resultados de enriquecimento contendo classificação de enriquecimento (BP, CC, MF), GO ID, nome GO, proporção do gene, proporção de fundo, valor p de significância do enriquecimento, valor p corrigido (p.adjust, valor), ID do gene (nome) e número de genes enriquecidos em cada GO. barplot.pdf é o histograma, bolha. PDF é um gráfico de bolhas.

11. Análise de enriquecimento KEGG

1. Coloque o arquivo id.txt na mesma pasta que o código de análise de enriquecimento KEGG.
2. Abra o código R (Arquivo de Codificação Suplementar 6) e defina o diretório de trabalho para o caminho onde id.txt e o código KEGG estão armazenados.
3. Abra o software R, execute o código modificado e use o clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, pacote ggplot2 para plotar histogramas de análise de enriquecimento GO, gráficos de bolhas e gráficos de caminhos. A execução é concluída com a produção de três novos arquivos, KEGG.txt, barplot.pdf e bubble.pdf.
   NOTA: O arquivo KEGG.txt é um arquivo de resultado de enriquecimento contendo ID da via, descrição da via, proporção do gene, proporção de fundo, valor p de significância do enriquecimento, valor p corrigido (p.adjust, qvalue), ID do gene (nome) e o número de genes enriquecidos em cada via. barplot.pdf é um gráfico de barras e bubble.pdf é um gráfico de bolhas.
4. Pesquise IL-17 no arquivo KEGG.txt; O resultado mostra que existe apenas um caminho; copie o ID do caminho.
5. Abra o código R, cole o ID do caminho IL-17 em KEGGID e use o pacote pathview para rotular o mapa do caminho. Execute o código R modificado e obtenha dois novos arquivos, hsa04657.pathview.png e hsa04657.png.
   NOTA: O arquivo hsa04657.png é o mapa do caminho, hsa04657.pathview.png é o mapa do caminho rotulado e os rotulados em vermelho são os genes presentes na rede de interações.

12. Preparação de pílulas Xiaoyao

NOTA: Para o método de preparação usado, consulte a Farmacopeia Chinesa⁵.

1. Tome 100 g de Chai Hu, 100 g de Angelica sinensis, 100 g de Paeonia lactiflora branca, 100 g de Atractylodes macrocephala frito, 100 g de Poria cocos, 80 g de Radix glycyrrhizae preparada e 20 g de Menthae herba.
2. Usando um moinho de pedra ou uma máquina de pó, esmague as ervas até formar um pó fino; Várias ervas são combinadas nas proporções acima e pulverizadas em um pó fino para se misturar naturalmente. Use uma peneira de 80 malhas com um diâmetro interno de 180 μm ± 7,6 μm e peneire o pó pulverizado. Homogeneizar.
3. Pegue 100 g de gengibre, adicione água e ferva 2x por 20 minutos de cada vez. Coe e reserve.
4. Pegue uma placa medicinal, mergulhe uma pequena vassoura em água de gengibre, escove-a na placa, pegue o pó acima, polvilhe na água de gengibre e vire a placa para que todo o pó fique úmido e possa ser moldado em forma de bola.
   NOTA: A formação da placa medicinal é uma etapa essencial durante a preparação das pílulas da MTC. A maior parte do bambu moso será dividida em tiras e tecida em um esqueleto. A pele de bambu, ou tengpi, é tecida na superfície e torna-se arredondada. A superfície da placa deve ser finamente revestida com óleo de tungue e depois escovada com uma camada de verniz. Este é seco para se tornar estanque. As pílulas feitas dessa maneira serão redondas e lisas.
5. Pincele a água com gengibre novamente, polvilhe o pó e gire a placa para que o medicamento seja gradualmente arredondado e aumentado. Coloque em local fresco para secar.

13. Estabelecimento do modelo animal

1. Após 7 dias de aclimatação, divida aleatoriamente os camundongos experimentais em 4 grupos, a saber, o grupo de operação simulada (Sham, onde apenas a gordura ao redor dos ovários foi removida) e três grupos de camundongos ovariectomizados consistindo em um grupo modelo (OVX), bem como grupos de administração de pílulas Xiaoyao de baixa e alta concentração.
2. Anestesiar os camundongos com pentobarbital sódico a 3% (40 mg/kg) injetado por via intraperitoneal. Verifique se os camundongos entram no estado de anestesia observando relaxamento muscular generalizado, respiração profunda e lenta e movimento lento. Aplique pomada para os olhos dos camundongos antes da cirurgia.
3. Coloque os animais em decúbito ventral e raspe a região renal das costas com um barbeador animal. Realize a desinfecção local com etanol a 75%.
4. Faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1 cm bilateralmente, próximo à região dorsal do rim, e faça uma incisão na fáscia para separar os músculos e o peritônio.
5. Localize a parte superior do corno uterino e as trompas de falópio para ligadura. Insira uma pinça na incisão para exploração e localize o ovário, envolto por tecido adiposo em um padrão de couve-flor vermelha brilhante, com trompas de falópio dispostas em espiral abaixo do ovário, conectando o ovário ao corno uterino²⁵. Remova os ovários com tesoura cirúrgica e sutura.
6. Remova uma pequena quantidade de tecido adiposo perto do ovário como controle no grupo de operação simulada. Observe os animais até que eles recuperem a consciência. Colocar os animais em pós-operatório em gaiolas separadas até à recuperação total.
7. Para prevenir a infecção, forneça gentamicina aos camundongos por 3 dias após a cirurgia. Após a operação, garanta uma dieta normal e um bom ambiente de crescimento de acordo com a condição real dos camundongos. Se houver alguma anormalidade, como infecção da ferida ou perda de apetite, consulte imediatamente o instrutor do Centro de Animais de Laboratório.

14. Administração de medicamentos

NOTA: De acordo com a Metodologia Experimental de Farmacologia²⁶, a conversão das dosagens humanas e animais utilizadas foi de 9 g de comprimidos de Xiaoyao para um adulto de 70 kg, equivalente a uma dose (dosagem para uma única administração).

1. Para os grupos de dose baixa e alta, use 0,683 g/kg e 2,73 g/kg, respectivamente, para um grupo de 8 animais. Use a mão esquerda para imobilizar o mouse de modo que a boca do mouse fique em linha reta com o esôfago. Segurando a agulha de gavagem com a mão direita, insira-a suavemente no esôfago ao longo da parede posterior da faringe a partir do canto da boca do camundongo.
2. Nesse ponto, a direção da agulha de gavagem pode ser ligeiramente alterada para estimular uma ação de deglutição induzida. Injete a droga. Faça isso uma vez ao dia por 12 semanas.
3. Para os grupos simulado e modelo, administre solução salina uma vez ao dia durante 12 semanas em uma quantidade determinada pelo peso do animal.
4. Eutanásia de camundongos por luxação cervical e corte seus membros posteriores. Esfole os membros para separar o músculo do fêmur. Trate os fêmures de camundongos com solução de descalcificação EDTA por 1 mês e substitua por uma solução nova diariamente.

15. Coloração de hematoxilina-eosina (HE)

1. Desparafine os tecidos femorais por 8 min e depois coloque em etanol gradiente por 3 min; Enxágüe com água corrente por 1 min.
2. Adicione a solução de coloração de hematoxilina gota a gota nas seções para cobrir completamente o tecido, core por 5 min e lave com água da torneira
3. Adicione a solução de diferenciação de ácido clorídrico ao tecido na lâmina, garantindo que ela cubra completamente o tecido. Pare quando a descoloração do tecido for observada. Enxágue com água da torneira.
4. Adicionar a solução de corante de Eosina gota a gota e deixar cobrir completamente o tecido, atuando por 30 s a 2 min. Enxágue o excesso de corante com água corrente.
5. Realize a desidratação do etanol gradiente com etanol anidro a 75% por 5 min, seguido de etanol anidro por 5 min e limpe usando solução de desparafinação por 3 min.
6. Coloque uma quantidade adequada de goma neutra na lâmina de acordo com o tamanho do tecido e abaixe a lamínula com cuidado, evitando bolhas de ar.

16. Análise de micro-CT e imuno-histoquímica

1. Remova o excesso de músculos e ligamentos ao redor das amostras de fêmur de diferentes grupos de camundongos e fixe os tecidos da amostra em paraformaldeído a 4% por 24 h.
2. Secar os tecidos ósseos ao ar e realizar micro-CT por varredura de tecido ósseo para obter dados tridimensionais de micro-CT.
3. A partir dos blocos de cera de rato preservados, corte-os em seções contínuas de 6 μm de espessura e asse as fatias a 70 °C -72 °C por 30-60 min.
4. Desparafine por 8 min, seguido de tratamento com etanol anidro a 75% por 5 min, etanol anidro por 5 min e enxágue com PBS por 5 min por 3x.
5. Realize o reparo de alta pressão com EDTA por 15 minutos, seguido de lavagem com PBS por 5 minutos por 3x.
6. Adicione 3% de peróxido de hidrogênio gota a gota ao tecido, incube em temperatura ambiente por 10 min e lave com PBS por 5 min por 3x.
7. Use uma caneta imuno-histoquímica para desenhar um círculo. Lave com PBS por 3 min por 3x.
8. Coloração no anticorpo primário (pAb de coelho anti-ALP (1:200), pAb de coelho anti-COL-1 (1:200), pAb de coelho anti-IL-17 (1:275), anti-Act1 (1:500), pAb de coelho anti-IL-6 (1:500)) durante a noite, seguido de enxágue com tampão PBS por 5 min por 3x.
9. Adicione gota a gota o anticorpo secundário (Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG conjugado com HRP (H + L; 1: 2000)) e incube em temperatura ambiente por 60 min. Lave com tampão PBS por 3 min por 3x.
10. Incube em DAB pronto para uso por 3-5 min e depois enxágue com PBS.
11. Realize a recoloração de hematoxilina por 3 min, seguida de enxágue com PBS.
12. Use solução de diferenciação por cerca de 10 s, seguida de enxágue com PBS.
13. Adicione a solução azul de retorno por 10 s, seguida de enxágue com PBS.
14. Realize o tratamento com etanol anidro a 75% por 5 min, etanol anidro por 5 min e limpe por 3 min. Use resina neutra para selar as lâminas.

Resultados

Ingredientes ativos e alvos de ação das pílulas Xiaoyao
Ao pesquisar o banco de dados TCMSP e a triagem de acordo com os critérios de biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e propriedades semelhantes a medicamentos (DL) ≥ 0,18, 125 ingredientes ativos foram encontrados nas pílulas Xiaoyao. Entre eles, os ingredientes 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 e 2 eram de Paeonia lactiflora branca, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos<...

Discussão

Segundo as estatísticas, a osteoporose causa 1,5 milhão de fraturas a cada ano nos Estados Unidos, e a grande maioria delas ocorre em mulheres na pós-menopausa²⁷. Com o aumento do envelhecimento da população, prevê-se que a maioria das futuras fraturas de quadril do mundo ocorrerá na Ásia e que, até 2050, o número total delas em todo o mundo chegará a 8,2 milhões²⁸. O custo de prevenir fraturas é quase igual ao de tratá-las, e o uso de medicamentos inevitavelm...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography