Studien zur entzündungshemmenden Wirkung von Xiaoyao-Pillen bei der Behandlung von postmenopausaler Osteoporose bei Mäusen

Zusammenfassung

Postmenopausale Osteoporose hat sich zu einem globalen Problem der öffentlichen Gesundheit entwickelt. Das Ziel dieser Studie ist es, die therapeutischen Wirkungen und die damit verbundenen Mechanismen der Xiaoyao-Pillen der traditionellen chinesischen Medizin bei dieser Erkrankung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Osteoporose ist eine häufige Stoffwechselerkrankung bei älteren und postmenopausalen Frauen, die im Frühstadium keine offensichtlichen Symptome aufweist. In den letzten Stadien dieser Erkrankung sind die Patienten anfällig für Frakturen, die ihre Gesundheit und Lebensqualität ernsthaft beeinträchtigen können. Der weltweite Anstieg der Lebenserwartung hat Osteoporose zu einem globalen Problem gemacht. Die Xiaoyao-Pillen wurden zuvor
Wird bei der Behandlung von Depressionen verwendet. Darüber hinaus schien das Medikament eine östrogenähnliche Aktivität zu haben, die die Expression von ALP, einem frühen Osteoblasten-spezifischen Marker, und COL-1, einem Hauptbestandteil der extrazellulären Knochenmatrix, beeinflusste. Xiaoyao-Pillen wurden auf ihre Auswirkungen auf die postmenopausale Osteoporose (PMOM) bei Mäusen untersucht. Die Zielinformationen jeder pflanzlichen Komponente der Xiaoyao-Pillen wurden über die Datenbank der Systempharmakologie der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCMSP) abgerufen. Informationen von GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank und anderen Websites wurden verwendet, um das regulatorische Netzwerk des Kräuterkomplexes über Cytoscape und das String-Netzwerk zu konstruieren und die Proteininteraktionen zu bewerten. Die Mäuse wurden ovariektomiert und mit hohen und niedrigen Dosen von Xiaoyao-Pillen behandelt, und diese wurden mit Kontrollen verglichen. Ihre Symptome wurden durch Immunzytochemie des Knochengewebes beurteilt. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Xiaoyao-Pillen die Fähigkeit hatten, die Symptome von PMOM bei ovariektomierten Mäusen über den IL-17-Signalweg zu lindern. Dieses Medikament hat das Potenzial, ein neuartiges Therapeutikum zur Behandlung von Osteoporose zu werden.

Einleitung

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) definiert Osteoporose (OP) als eine Krankheit, die durch eine Abnahme der Knochenmasse und eine Verschlechterung der Mikroarchitektur des Knochengewebes gekennzeichnet ist, was zu einer Zunahme der Knochenbrüchigkeit und damit zu einem erhöhten Frakturrisiko führt¹. Die klinische Bedeutung der Osteoporose besteht darin, dass sie zu Frakturen führen kann, die mit hoher Mortalität, Morbidität und wirtschaftlichen Kosten verbunden sind². Postmenopausale Osteoporose (PMOP) wird durch eine Abnahme des Östrogenspiegels bei Frauen nach der Menopause verursacht, was zu einer Erhöhung der Osteoklastenaktivität führt, was zu Knochenverlust und Zerstörung der Knochenmikrostruktur führt. Dies führt häufig zu Osteoporose mit schwerwiegenden Auswirkungen auf die Gesundheit³. Zu den derzeitigen Therapien für PMOP gehören Östrogenersatztherapien, Bisphosphonate und Parathormon, aber sie können unterschiedlich starke Nebenwirkungen, unzureichende langfristige Compliance und hohe Kosten haben⁴. Daher ist eine erschwingliche pflanzliche Medizin für einen großen Teil der Bevölkerung eine praktikable Alternative.

Xiaoyao-Pillen sind im Chinesischen Arzneibuch⁵ enthalten und enthalten acht pflanzliche Bestandteile, darunter Chai Hu, Angelica sinensis, Weiße Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, Süßholz und frischer Ingwer. Alle diese Kräuter sind dafür bekannt, dass sie die Leber entgiften und die Milz stärken, das Blut nähren und den Menstruationszyklus regulieren, und die Mischung wurde auch zur Behandlung von Depressionen verwendet⁶. Die Rolle von Xiaoyao-Pillen bei Osteoporose ist jedoch unklar.

Frühe Studien deuten darauf hin, dass Entzündungen zu Knochenschwund führen können⁷ und dass der mit diesem Prozess verbundene Rückgang der Knochendichte durch die Menopause beschleunigt werden kann. Darüber hinaus besteht ein starker Zusammenhang zwischen der Entwicklung von Osteoporose und Entzündungen. Der Entzündungsfaktor Interleukin-17 (IL-17) ist ein entzündungsfördernder Faktor, der von Th17-Zellen, einer Untergruppe der CD4+ T-Lymphozyten, sezerniert wird. Diese Zellen werden mit mehreren chronischen Entzündungszuständen in Verbindung gebracht und spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Knochenzerstörung bei rheumatoider Arthritis⁸. Darüber hinaus stimuliert IL-17 den nuklearen Faktor-κ B-Ligandenrezeptor-Aktivator (RANKL), der die Osteoklastogenese reguliert, was zu einer stärkeren Knochenresorption als zur Knochenbildung führt⁹. IL-17 stimuliert die Expression anderer osteoklastogener Zytokine wie TNFα, IL-1, IL-6 und IL-8. Es hat die Fähigkeit, mit anderen Entzündungsfaktoren zu synergistieren, was es zu einem wichtigen Entzündungseffektor macht¹⁰.

Studien haben auch einen Zusammenhang zwischen Xiaoyao-Pillen und Entzündungen gezeigt. Shi et ^al.11 und Fang et ^al.12 haben kürzlich bestätigt, dass Xiaoyao-Pillen die Spiegel von IL-6 bzw. TNF-α senken können. In einer anderen Studie zur stoffwechselassoziierten Steatohepatitis wurde berichtet, dass Xiaoyao-Pillen die Expression von Propionsäure hochregulieren können, was wiederum die Expression von TNF-α hemmt und eine entzündungshemmende Wirkung ausübt¹³. Derzeit ist jedoch nicht bekannt, ob Xiaoyao-Pillen die Entwicklung von PMOM regulieren können, indem sie eine Entzündungsreaktion über IL-17 vermitteln, was das Ziel dieser Studie war.

Diese Studie sagte die Überschneidung der Ziele von Xiaoyao-Pillen und Osteoporose-bezogenen Genen durch Netzwerkpharmakologie und Bioinformatik-Analyse voraus und analysierte die sich überschneidenden Gene für Proteininteraktionen, GO und KEGG. Basierend auf den vorhergesagten Ergebnissen kann die Expression von Act1 und IL-6, den Schlüsselproteinen im IL-17-Signalweg, beobachtet werden^14,15 sowie die Knochenumsatzmarker alkalische Phosphatase (ALP) und Kollagen Typ I (COL-1), um die therapeutische Wirksamkeit der Xiaoyao-Pillen im PMOM-Mausmodell zu beobachten.

Protokoll

Die Ethikkommission für Versuchstiere der Medizinischen Universität Youjiang für Nationalitäten hat das Studienprotokoll genehmigt (Zulassungsnummer: 2022101502). Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 10-12 Wochen, SPF-Klasse und Körpergewicht (22 ± 2) g, wurden im SPF Class Animal Experiment Center der Youjiang Medical University for Nationalities untergebracht. Die Versuchstiere wurden bei einer Temperatur von 24-26 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % bis 60 % gehalten.

1. Systempharmakologie-Datenbank und Analyseplattform für traditionelle chinesische Medizin

HINWEIS: Die Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) sind pharmakologische Plattformen für die chinesische Medizin, die Informationen über TCM-Inhaltsstoffe, ADME-bezogene Eigenschaften, Ziele und Krankheiten enthalten^16,17.

1. Greifen Sie auf die TCMSP-Weboberfläche zu. Suchen Sie nach Herbs Namen, geben Sie den Namen des chinesischen Arzneimittels ein und klicken Sie auf Suchen. Klicken Sie in den Suchergebnissen auf Lateinischer Name . Führen Sie ein Screening der Ergebnisse der Inhaltsstoffe mit den Parametern OB ≥ 30 % und DL ≥ 0,18 durch.
2. Kopieren Sie alle Ergebnisse und speichern Sie sie im TXT-Format mit dem Namen Chinese Medicine Name_ingredients.txt.
3. Filtern Sie auf der Registerkarte "Verwandte Ziele" unter "Zielinformationen" nach Mol-ID (d. h. dem Ergebnis in Schritt 1.2).
4. Kopieren Sie die gefilterten Ergebnisse und speichern Sie sie im TXT-Format mit dem Namen Chinese Medicine Name_targets.txt.
   HINWEIS: Durch die obigen Schritte wurden alle in Frage kommenden Wirkstoffe und die entsprechenden Zielinformationen der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) erhalten.
5. Legen Sie alle oben genannten ingredients.txt Dateien und targets.txt Dateien im selben Ordner ab und legen Sie die Perl-Skripte (Supplementary Coding File 1) in diesem Ordner ab.
6. Öffnen Sie CMD, geben Sie den Pfad des CD-Ordners ein, geben Sie ihn ein und führen Sie das Perl-Skript aus. Holen Sie sich eine neue Textdatei (allTargets.txt). Diese neue Textdatei (allTargets.txt) enthält den Namen des Kräuters, den Namen des Inhaltsstoffs, die ID der Inhaltsstoffe und das Ziel.

2. UniProt-Datenbank

HINWEIS: Die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org/) enthält menschliche Proteinsequenzen, die mit funktionellen Informationen annotiert sind, und wird verwendet, um die Namen der Ziele auf ihre offiziellen Namen¹⁸ zu normalisieren.

1. Gehen Sie zur UniProt-Weboberfläche. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen , wählen Sie UniProtKB aus und klicken Sie auf Suchen.
2. Filtern Sie in der linken Seitenleiste, wählen Sie Reviewed (Swiss-Prot) für Status und Human für Popular organisms aus. Klicken Sie auf Herunterladen, wählen Sie Alle herunterladen, wählen Sie TSV als Format aus, und klicken Sie auf Herunterladen , um die Anmerkungsdatei herunterzuladen.
3. Entpacken Sie die heruntergeladene Datei in den aktuellen Ordner, öffnen Sie die entpackte Datei, kopieren Sie sie und fügen Sie sie in eine Textdatei mit dem Namen ann.txt ein.

3. Umwandlung der Wirkstoffziel-ID

1. Legen Sie alle in Abschnitt 1 allTargets.txt erhaltenen Wirkstoffzieldateien und die in Abschnitt 2 erhaltene UniProt-Annotationsdatei ann.txt in einen Ordner und legen Sie die Perl-Skripte (Supplementary Coding File 2) in diesen Ordner ab.
2. Öffnen Sie CMD, geben Sie cd + Leertaste + Ordnerpfad ein, geben Sie ihn ein und führen Sie das Perl-Skript aus, um eine neue Textdatei (allTargets.symbol.txt) zu erhalten. Diese neue Textdatei (allTargets.symbol.txt) enthält den Namen des Kräuters, die ID des Inhaltsstoffs, den Namen des Inhaltsstoffs und die Gen-ID.

4. Datenbank-Suche

1. GeneCards: Datenbank der Human Gene Database (GeneCards)
   HINWEIS: Die GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/) bietet Vorhersage- und Annotationsinformationen für menschliche Gene. Es wird verwendet, um auf Krankheitsziele zuzugreifen^19,20.
   1. Gehen Sie zur GeneCards-Weboberfläche. Geben Sie osteoporose in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Suchen.
   2. Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Nach Excel exportieren aus.
   3. Öffnen Sie die heruntergeladene Datei, kopieren Sie die Gene mit dem Relevanzwert ≥ 1, fügen Sie sie ein und speichern Sie sie in einer Datei mit dem Namen GeneCards.txt.
2. OMIM-Datenbank
   HINWEIS: Die OMIM-Datenbank (https://omim.org) enthält menschliche Gene, genetische Krankheiten und Merkmale²¹.
   1. Rufen Sie die OMIM-Weboberfläche auf. Klicken Sie auf GENE Map, geben Sie osteoporose in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Suchen.
   2. Klicken Sie auf Herunterladen als und wählen Sie Excel-Datei aus.
   3. Öffnen Sie die heruntergeladene Datei, kopieren Sie den Gennamen in die Spalte Genehmigtes Symbol, fügen Sie ihn ein und speichern Sie ihn in einer Datei mit dem Namen OMIM.txt.
3. Datenbank PharmGkb
   HINWEIS: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), die Wissensdatenbank für Pharmakogenomik, enthält Annotationen zu Arzneimitteletiketten, arzneimittelzentrierte Signalwege, pharmakogenetische Zusammenfassungen und Beziehungen zwischen Genen, Arzneimitteln und Krankheiten²².
   1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der PharmGkb-Website auf. Geben Sie Osteoporose in das Suchfeld ein, klicken Sie auf Suchen und aktivieren Sie Gen in der linken Seitenleiste.
   2. Geben Sie alle Ergebnisse manuell ein und speichern Sie sie in einer Datei mit dem Namen PharmGkb.txt.
4. TTD: Datenbank für therapeutische Zieldatenbanken (TTD)
   HINWEIS: Die TTD-Datenbank (https://idrblab.org/ttd/) enthält Informationen über Protein- und Nukleinsäureziele, Zielkrankheiten, Informationen über den Signalweg und entsprechende Arzneimittel für jedes Ziel²³.
   1. Gehen Sie zur TTD-Weboberfläche. Geben Sie osteoporose in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Suchen.
   2. Klicken Sie im Ergebnis unter Ziel-ID auf Zielinfo , kopieren Sie den Zielnamen, fügen Sie ihn ein und speichern Sie ihn in einer Datei mit dem Namen TTD.txt. Insgesamt wurden 33 Ergebnisse erzielt. Speichern Sie jedes Ergebnis auf die gleiche Weise.
5. Datenbank DrugBank Online (DrugBank)
   HINWEIS: Die DrugBank-Datenbank (https://go.drugbank.com) enthält Informationen über Arzneimittel und Wirkstoffziele, Arzneimittelwechselwirkungen, Arzneimittelmechanismen und Arzneimittelmetabolismus²⁴.
   1. Gehen Sie zur Benutzeroberfläche der DrugBank-Website. Wählen Sie auf der Registerkarte "Suche" die Option "Indikationen " aus, geben Sie "Osteoporose" in das Suchfeld ein und klicken Sie auf "Suchen".
   2. Klicken Sie auf den Eintrag Osteoporose in den Ergebnissen, um weitere Informationen zu erhalten, klicken Sie auf die Registerkarte MEDIKAMENTE UND ZIELE und klicken Sie auf den entsprechenden Link in der Spalte ZIEL der Tabelle.
   3. Klicken Sie in Protein auf Details, kopieren Sie den Gennamen, fügen Sie ihn ein und speichern Sie ihn in einer Datei mit dem Namen DrugBank.txt. Speichern Sie jedes Ergebnis auf die gleiche Weise.

5. Venn-Diagramm

1. Krankheitsassoziierte Genverschmelzung und Venn-Kartierung
   1. Legen Sie die gespeicherten txt-Dateien sowie das Skript im selben Ordner ab.
   2. Öffnen Sie den R-Code (Merge Disease-Related Genes), kopieren Sie den Pfad, in dem die obige txt-Datei gespeichert ist, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
   3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code aus, und speichern Sie. Legen Sie das Gen fest, benennen Sie die Datei Disease.txt.
   4. Öffnen Sie die Website Draw Venn Diagram; Kopieren Sie im Eingabebereich den in den Abschnitten 4 bis 8 gespeicherten Textinhalt nacheinander in die Liste, benennen Sie ihn mit der entsprechenden Datenbank und klicken Sie auf Senden.
   5. Klicken Sie unter dem Bild auf Bild als PNG speichern und speichern Sie das Textergebnis im selben Ordner.
2. Schnittmenge von Wirkstoffzielen und krankheitsassoziierten Genen
   1. Legen Sie die allTargets.symbol.txt Datei aus Abschnitt 3 und die Disease.txt Datei aus Schritt 5.1.3 im selben Ordner ab.
   2. Öffnen Sie den R-Code (drug target and disease-related gene take intersection), kopieren Sie den Pfad, in dem die obige txt-Datei gespeichert ist, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich der setwd im R-Code befindet.
   3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code aus, und speichern Sie. Legen Sie das Gen fest, benennen Sie die Datei Drug_Disease.txt.
   4. Öffnen Sie die Website Draw Venn Diagram. Kopieren Sie im Eingabebereich allTargets.symbol.txt und fügen Sie Disease.txt in die Liste ein und benennen Sie sie nach den entsprechenden Dateien.
   5. Klicken Sie unter dem Bild auf Bild als PNG speichern und speichern Sie die Textergebnisse im selben Ordner.

6. Aufbau des regulatorischen Netzwerks der TCM-Compoundierung

1. Legen Sie die allTargets.symbol.txt Datei, die Sie in Abschnitt 3 erhalten haben, im selben Ordner wie die Disease.txt Datei und das entsprechende Perl-Skript (Supplementary Coding File 3) ab.
2. Öffnen Sie CMD, geben Sie den Pfad der CD-Datei ein, drücken Sie die Eingabetaste und führen Sie das Perl-Skript aus. Holen Sie sich vier neue TXT-Dateien: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt und net.type.txt. Die network.txt Datei enthält die TCM-Inhaltsstoff-ID, das Zielgen, die Zielbeziehung und den Namen des Inhaltsstoffs. net.type.txt enthält den Knotennamen, die Attribute und die Zugehörigkeit. net.geneLists.txt ist die Liste der Gene und net.molLists.txt ist die Liste der Inhaltsstoffe.
3. Kopieren Sie die neu erhaltenen Textdateien in denselben neuen Ordner.
4. Öffnen Sie die Cytoscape 3.9.1-Software, klicken Sie auf Datei, klicken Sie auf Importieren und wählen Sie Netzwerkformulardatei. Wählen Sie net.network.txt aus, geben Sie die erste Spalte der Komponenten-ID als Quellknoten, die zweite Spalte der Gene als Zielknoten und die dritte Spalte der Zielbeziehung als Interaktionstyp aus und klicken Sie auf OK.
5. Importieren Sie net.type.txt aus dem Fenster Knotentabelle. Klicken Sie auf die Registerkarte Auswählen, wählen Sie Knoten aus, wählen Sie Aus ID-Listendatei, wählen Sie net.geneLists.txt aus, und klicken Sie auf Öffnen.
6. Klicken Sie auf die Registerkarte Layout, wählen Sie Gradsortiertes Kreislayout und dann Nur ausgewählte Knoten aus. Passen Sie sowohl die Höhe als auch die Breite der Knoten auf 70 an.
7. Klicken Sie auf das zweite Feld in der Höhe, wählen Sie degree.layout in der Spalte aus, wählen Sie Kontinuierliches Mapping unter Mapping-Typ aus und doppelklicken Sie auf das Fenster zur Höhenanpassung auf der rechten Seite von Current Mapping, um die oberen und unteren Grenzen der Höhe auf einen geeigneten Bereich einzustellen.
8. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Option Breite.
9. Klicken Sie erneut auf die Registerkarte Layout und dann auf Layout-Tools > Passen Sie die Skalierung so an , dass sich die Knoten nicht überlappen.
10. Klicken Sie auf das obere rechte Fenster der Software, um das Knotennetzwerk zu deaktivieren, klicken Sie auf die Registerkarte Auswählen , wählen Sie Knoten aus, wählen Sie Aus ID-Listendatei, wählen Sie net.molLists.txt und klicken Sie auf Öffnen.
11. Klicken Sie auf die Registerkarte Layout, wählen Sie Layout für Gruppenattribute aus, wählen Sie Nur ausgewählte Knoten aus, und klicken Sie auf Typ.
12. Klicken Sie in der linken Spalte auf Schriftgröße beschriften und legen Sie den Standardwert auf 12 fest. Klicken Sie in der linken Spalte auf Standardwert in Bild/Diagramm 1.
13. Wählen Sie im Popup-Fenster Diagramme aus, klicken Sie auf Kreisdiagramm, und wählen Sie in der Spalte Verfügbare Spalten mit Ausnahme des Grads die Elemente aus. Layout in der Spalte "Ausgewählte Spalten" und klicken Sie auf "Übernehmen".
14. Klicken Sie in der linken Spalte auf Border Paint und setzen Sie den Standardwert auf #003EF8. Klicken Sie auf die Registerkarte Kante am unteren Rand der linken Seitenleiste und stellen Sie die Breite auf 0,8 ein.
15. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf Datei, wählen Sie Exportieren und dann Netzwerk in Bild aus.
16. Wählen Sie im Popup-Fenster das PNG-Format als Format aus, wählen Sie das Speicherverzeichnis und benennen Sie das Bildnetzwerk, stellen Sie die Bildgröße auf maximal 500 % ein, wählen Sie Transparenter Hintergrund und klicken Sie auf OK , um das Speichern des Bildes abzuschließen.

7. Konstrukte von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI)

1. Öffnen Sie die STRING-Website (https://string-db.org/), klicken Sie auf Mehrere Proteine, klicken Sie auf Durchsuchen in Datei hochladen, wählen Sie die Drug_Disease.txt Datei aus, die Sie in Schritt 5.2.3 erhalten haben, und wählen Sie Homo sapiens in Organismen aus. Klicken Sie auf Suchen und dann auf Weiter.
2. Klicken Sie auf Einstellungen, legen Sie den minimal erforderlichen Interaktionswert auf die höchste Zuverlässigkeit (0,900) fest, und aktivieren Sie in den Anzeigeoptionen des Netzwerks die Option Getrennte Knoten im Netzwerk ausblenden. Klicken Sie auf Aktualisieren.
3. Nehmen Sie Anpassungen an den Knoten im Netzwerkdiagramm vor, sodass es keine Überlappung oder Okklusion gibt.
4. Klicken Sie auf Exports und dann auf Als hochauflösende Bitmap herunterladen, um die Protein-Interworking-Network-Map im PNG-Format zu erhalten. Laden Sie die TSV-Datei auch als kurze tabellarische Textausgabe herunter. Speichern Sie beide Dateien in einem einheitlichen Ordner. Die TSV-Datei enthält den Gennamen, die interne STRING-ID und die Bewertungen für verschiedene Attribute.

8. Aufbau des PPI-Netzwerkkerns

1. Legen Sie die in Abschnitt 7 erhaltene TSV-Datei und die erforderlichen Perl-Skripte in einem neuen Ordner ab.
2. Öffnen Sie die Cytoscape 3.9.1 Software, klicken Sie auf Datei, wählen Sie Importieren, klicken Sie auf Netzwerk aus Datei, wählen Sie die obige TSV-Datei aus, setzen Sie die erste Spalte node1 als Quellknoten und die zweite Spalte node2 als Zielknoten und klicken Sie auf OK.
4. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf APPs , klicken Sie auf CytoNCA und dann auf Öffnen.
5. Wählen Sie in der linken Spalte unter Zwischenräume, Nähe, Grad, Eigenvektor, Lokale durchschnittliche Konnektivitätsmethode und Netzwerk die Option Ohne Gewichtung aus, und klicken Sie auf Analysieren.
6. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf Knotentabelle , klicken Sie auf Exportieren, speichern Sie sie im Ordner und nennen Sie sie Punktzahl 1.
   HINWEIS: Das CytoNCA-Plugin muss in der Cytoscape-Software installiert sein. Klicken Sie dazu in der oberen Symbolleiste auf Apps , klicken Sie auf APP-Manager, geben Sie CytoNCA in das Suchfeld ein, aktivieren Sie CytoNCA in der mittleren Spalte der zurückgegebenen Ergebnisse und klicken Sie auf Installieren.
7. Öffnen Sie score1, passen Sie die Namensspalte an die erste Spalte an, kopieren Sie die Informationen in der Tabelle, fügen Sie sie in eine neue Textdatei ein, nennen Sie sie score1.txt, und speichern Sie sie.
8. Öffnen Sie den R-Code, kopieren Sie den Pfad, in dem sich die score1.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
9. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten Code aus, um zwei neue Dateien score2.txt und score2.gene.txt abzurufen. Die score2.txt Datei enthält die Gene, für die alle Programmwerte größer als der Median waren, und die spezifischen Punktzahlen für jedes Programm. score2.gene.txt enthält die Gene, die bei allen Elementen besser als der Median bewertet wurden.
10. Um in Cytoscape fortzufahren, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf AnalysisPanel 1 , klicken Sie auf der linken Seite des Fensters auf Aus Datei hochladen , wählen Sie das score2.gene.txt aus, klicken Sie auf Öffnen und tippen Sie im Popup-Fenster auf OK .
11. Klicken Sie unten auf Knoten auswählen und dann im Popup-Fenster auf OK .
12. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf Datei , wählen Sie Exportieren aus, klicken Sie auf Netzwerk in Bild, stellen Sie den Zoom (%) in der Bildgröße auf maximal 500 % ein, aktivieren Sie Transparenter Hintergrund und speichern Sie die Datei im selben Ordner, nennen Sie ihn network1.
13. Klicken Sie in der rechten Seitenleiste des unteren Fensters auf Subnetzwerk erstellen , um ein Subnetzwerk zu erstellen, analysieren Sie das Subnetzwerk, klicken Sie in der Symbolleiste oben auf APPs , klicken Sie auf CytoNCA und klicken Sie auf Öffnen.
14. Wählen Sie in der linken Seitenleiste unter "Zwischen", "Nähe", "Grad", "Eigenvektor", "Lokale durchschnittliche Konnektivitätsmethode" und "Netzwerk" die Option "Ohne Gewichtung " aus und klicken Sie auf "Analysieren".
15. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf Knotentabelle , klicken Sie auf Exportieren und speichern Sie sie in einem neuen Ordner mit dem Namen score2.
16. Öffnen Sie score2, passen Sie die Namensspalte an die erste Spalte an, kopieren Sie die Informationen in der Tabelle, fügen Sie sie in eine neue Textdatei ein, nennen Sie sie score2.txt und speichern Sie sie.
17. Öffnen Sie den R-Code, kopieren Sie den Pfad, in dem sich die score2.txt-Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
18. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten Code aus, um zwei neue Dateien abzurufen: score3.txt und score3.gene.txt. Die score3.txt Datei enthält die Gene, die für alle Elemente besser als der Median bewertet wurden, sowie die spezifischen Punktzahlen für jedes Element. score3.gene.txt enthält die Gene, die für alle Elemente besser als der Median bewertet wurden.
19. Um in Cytoscape fortzufahren, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf AnalysisPanel 1 , klicken Sie auf der linken Seite des Fensters auf Aus Datei hochladen , wählen Sie das score3.gene.txt aus, klicken Sie auf Öffnen und tippen Sie im Popup-Fenster auf OK .
20. Klicken Sie unten auf Knoten auswählen und dann im Popup-Fenster auf OK .
21. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf Datei , wählen Sie Exportieren aus, klicken Sie auf Netzwerk in Bild, passen Sie den Zoom (%) in der Bildgröße auf 500 % an, aktivieren Sie Transparenter Hintergrund, und speichern Sie die Datei im selben Ordner wie in diesem Schritt, und nennen Sie ihn network2.
22. Klicken Sie in der rechten Seitenleiste des Fensters unten auf Subnetzwerk erstellen , um ein Subnetzwerk zu erstellen.
23. Klicken Sie in der Symbolleiste oben auf Datei , wählen Sie Exportieren aus, klicken Sie auf Netzwerk in Bild, passen Sie den Zoom (%) in der Bildgröße auf maximal 500 % an, aktivieren Sie Transparenter Hintergrund, und speichern Sie die Datei im selben Ordner wie in diesem Schritt und nennen Sie ihn network3.

9. Umwandlung der Gen-ID

1. Platzieren Sie die Drug_Disease.txt Datei im selben neuen Ordner wie die erforderliche Codedatei.
2. Öffnen Sie den R-Code (Supplementary Coding File 4), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die Drug_Disease.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
3. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten Code mit der Organisation aus. Hs.eg.db Paket, um die Gen-ID zu konvertieren, und führen Sie es nach Fertigstellung einer neuen Datei id.txt aus. Die id.txt enthält das Symbol des Gens und die entsprechende ID.

10. GO-Anreicherungsanalyse

1. Platzieren Sie die id.txt Datei aus dem vorherigen Schritt im selben Ordner wie den Code für die GO-Anreicherungsanalyse.
2. Öffnen Sie den R-Code (Supplementary Coding File 5) und setzen Sie das Arbeitsverzeichnis auf id.txt und den Pfad, in dem der GO-Code gespeichert ist.
3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten Code aus, und verwenden Sie clusterProfiler, org. Hs.eg.db, das Diagramm anreichern, ggplot2-Diagramm, die Histogramme der GO-Anreicherungsanalyse und Blasendiagramme. Rufen Sie drei neue Dateien (GO.txt, barplot.pdf und bubble.pdf ab, nachdem die Ausführung abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Bei der GO.txt handelt es sich um die Anreicherungsergebnisdatei, die die Anreicherungsklassifizierung (BP, CC, MF), GO-ID, GO-Name, Genanteil, Hintergrundanteil, p-Wert für die Anreicherungsbedeutung, den korrigierten p-Wert (p.adjust, Wert), die Gen-ID (Name) und die Anzahl der Gene enthält, die auf jedem GO angereichert wurden. barplot.pdf ist das Histogramm, Blase. PDF ist ein Blasendiagramm.

11. Analyse der KEGG-Anreicherung

1. Legen Sie die id.txt Datei im selben Ordner wie den KEGG-Anreicherungsanalysecode ab.
2. Öffnen Sie den R-Code (Supplementary Coding File 6) und setzen Sie das Arbeitsverzeichnis auf den Pfad, in dem id.txt und der KEGG-Code gespeichert sind.
3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten Code aus, und verwenden Sie clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 Paket zum Plotten von GO-Anreicherungsanalyse-Histogrammen, Blasendiagrammen und Pfaddiagrammen. Der Lauf wird mit der Produktion von drei neuen Dateien abgeschlossen: KEGG.txt, barplot.pdf und bubble.pdf.
   HINWEIS: Bei der KEGG.txt-Datei handelt es sich um eine Anreicherungsergebnisdatei, die die Pfad-ID, die Beschreibung des Signalwegs, den Genanteil, den Hintergrundanteil, den p-Wert der Anreicherungsbedeutung, den korrigierten p-Wert (p.adjust, qvalue), die Gen-ID (Name) und die Anzahl der Gene enthält, die in jedem Signalweg angereichert sind. barplot.pdf handelt sich um ein Balkendiagramm und bubble.pdf um ein Blasendiagramm.
4. Suchen Sie IL-17 in der Datei KEGG.txt; Das Ergebnis zeigt, dass es nur einen Weg gibt; Kopieren Sie die Pfad-ID.
5. Öffnen Sie den R-Code, fügen Sie die IL-17-Pfad-ID in KEGGID ein, und verwenden Sie das pathview-Paket, um die Pfadkarte zu beschriften. Führen Sie den geänderten R-Code aus, und rufen Sie zwei neue Dateien ab, hsa04657.pathview.png und hsa04657.png.
   HINWEIS: Die hsa04657.png Datei ist die Signalwegkarte, hsa04657.pathview.png ist die beschriftete Signalwegkarte, und die rot beschrifteten sind die Gene, die im Interaktionsnetzwerk vorhanden sind.

12. Zubereitung von Xiaoyao Pillen

HINWEIS: Für die verwendete Zubereitungsmethode siehe Chinesisches Arzneibuch⁵.

1. Nehmen Sie 100 g Chai Hu, 100 g Angelica sinensis, 100 g White Paeonia lactiflora, 100 g gebratene Atractylodes macrocephala, 100 g Poria cocos, 80 g Radix glycyrrhizae preparate und 20 g Menthae herba.
2. Mit einer Steinmühle oder einer Pudermaschine die Kräuter zu einem feinen Pulver zerkleinern; Mehrere Kräuter werden in den oben genannten Anteilen kombiniert und zu einem feinen Pulver pulverisiert, um sich auf natürliche Weise miteinander zu vermischen. Verwenden Sie ein 80-Mesh-Medikamentensieb mit einem Innendurchmesser von 180 μm ± 7,6 μm und sieben Sie das pulverisierte Pulver. Gründlich mischen.
3. Nimm 100 g Ingwer, füge Wasser hinzu und koche es jedes Mal 2x für 20 Minuten. Abseihen und beiseite stellen.
4. Nehmen Sie eine medizinische Plaque, tauchen Sie einen kleinen Besen in Ingwerwasser, streichen Sie damit auf die Plaque, nehmen Sie das obige Pulver, streuen Sie es auf das Ingwerwasser und drehen Sie die Plaque so, dass das gesamte Pulver nass ist und sie in eine Kugelform geformt werden kann.
   HINWEIS: Die Bildung der medizinischen Plaque ist ein wesentlicher Schritt bei der Herstellung von TCM-Pillen. Der größte Teil des Moso-Bambus wird in Streifen gespalten und zu einem Skelett verwoben. Die Bambushaut oder Tengpi wird in die Oberfläche eingewebt und wird abgerundet. Die Oberfläche der Plaque sollte dünn mit Tungöl überzogen und anschließend mit einer Schicht Lack bestrichen werden. Dieser wird getrocknet, um wasserdicht zu werden. Die auf diese Weise hergestellten Pillen sind rund und glatt.
5. Bürsten Sie das Ingwerwasser erneut auf, streuen Sie das Pulver und drehen Sie die Plaque, so dass das Medikament allmählich abgerundet und vergrößert wird. Zum Trocknen an einen kühlen Ort stellen.

13. Etablierung des Tiermodells

1. Nach 7 Tagen Akklimatisierung teilen Sie die Versuchsmäuse nach dem Zufallsprinzip in 4 Gruppen ein, nämlich die Scheinoperationsgruppe (Sham, bei der nur das Fett um die Eierstöcke entfernt wurde) und drei Gruppen von ovariektomierten Mäusen, bestehend aus einer Modellgruppe (OVX) sowie Verabreichungsgruppen mit niedrig- und hochkonzentrierten Xiaoyao-Pillen.
2. Betäuben Sie die Mäuse mit 3% Natrium-Pentobarbital (40 mg/kg), das intraperitoneal injiziert wird. Überprüfen Sie, ob die Mäuse in den Narkosezustand eintreten, indem Sie eine generalisierte Muskelentspannung, eine tiefe und langsame Atmung und eine verlangsamte Bewegung beobachten. Tragen Sie vor der Operation Augensalbe auf die Augen der Mäuse auf.
3. Legen Sie die Tiere in Bauchlage und rasieren Sie die Nierenregion des Rückens mit einem Tierrasierer. Führen Sie eine lokale Desinfektion mit 75% Ethanol durch.
4. Machen Sie einen beidseitigen Längsschnitt von ca. 1 cm in der Nähe des dorsalen Bereichs der Niere und schneiden Sie die Faszie ein, um die Muskeln und das Bauchfell zu trennen.
5. Lokalisieren Sie den oberen Teil des Gebärmutterhorns und die Eileiter für die Ligatur. Führen Sie eine Pinzette zur Erkundung in den Schnitt ein und lokalisieren Sie den Eierstock, der von Fettgewebe in einem leuchtend roten Blumenkohlmuster umhüllt ist, mit spiralförmig angeordneten Eileitern unterhalb des Eierstocks, die den Eierstock mit dem Gebärmutterhorn verbinden²⁵. Entfernen Sie die Eierstöcke mit einer chirurgischen Schere und Naht.
6. Entnahme einer kleinen Menge Fettgewebe in der Nähe des Eierstocks als Kontrolle in der Scheinoperationsgruppe. Beobachte Tiere, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen. Setzen Sie postoperative Tiere bis zur vollständigen Genesung in getrennte Käfige.
7. Um eine Infektion zu verhindern, versorgen Sie Mäuse 3 Tage postoperativ mit Gentamicin. Achten Sie nach der Operation auf eine normale Ernährung und ein gutes Wachstumsklima entsprechend dem tatsächlichen Zustand der Mäuse. Bei Auffälligkeiten, wie z.B. Wundinfektionen oder Appetitlosigkeit, wenden Sie sich sofort an den Ausbilder des Versuchstierzentrums.

14. Verabreichung von Medikamenten

HINWEIS: Gemäß der pharmakologischen experimentellen Methodik²⁶ betrug die Umrechnung der verwendeten Dosierungen für Mensch und Tier 9 g Xiaoyao-Pillen für einen 70 kg schweren Erwachsenen, was einer Dosis (Dosierung für eine einmalige Verabreichung) entspricht.

1. Für die Gruppen mit niedriger und hoher Dosis ist 0,683 g/kg bzw. 2,73 g/kg für eine Gruppe von 8 Tieren zu verwenden. Verwenden Sie die linke Hand, um die Maus ruhig zu stellen, so dass sich der Mund der Maus in einer geraden Linie mit der Speiseröhre befindet. Halten Sie die Sondennadel in der rechten Hand und führen Sie sie vorsichtig entlang der hinteren Wand des Rachens vom Mundwinkel der Maus in die Speiseröhre ein.
2. Zu diesem Zeitpunkt kann die Richtung der Sondennadel leicht verändert werden, um eine induzierte Schluckwirkung zu stimulieren. Injizieren Sie das Medikament. Führen Sie dies 12 Wochen lang einmal täglich durch.
3. Für die scheinoperierte Gruppe und die Modellgruppe ist 12 Wochen lang einmal täglich Kochsalzlösung in einer Menge zu verabreichen, die durch das Gewicht des Tieres bestimmt wird.
4. Euthanasieren Sie Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und schneiden Sie ihre Hintergliedmaßen. Häuten Sie die Gliedmaßen, um den Muskel vom Oberschenkelknochen zu trennen. Behandeln Sie Oberschenkelknochen von Mäusen 1 Monat lang mit EDTA-Entkalkungslösung und ersetzen Sie sie täglich durch frische Lösung.

15. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE)

1. Entwachsen Sie das Femurgewebe für 8 Minuten und legen Sie es dann für 3 Minuten in Gradientenethanol; 1 Min. unter fließendem Wasser abspülen.
2. Geben Sie Hämatoxylin-Färbelösung tropfenweise auf die Abschnitte, um das Gewebe vollständig zu bedecken, färben Sie es 5 Minuten lang und waschen Sie es mit Leitungswasser
3. Geben Sie die Salzsäure-Differenzierungslösung in das Gewebe auf dem Objektträger und stellen Sie sicher, dass sie das Gewebe vollständig bedeckt. Stoppen Sie, wenn eine Verfärbung des Gewebes beobachtet wird. Mit Leitungswasser abspülen.
4. Geben Sie die Eosin-Farbstofflösung tropfenweise hinzu und lassen Sie das Gewebe vollständig einwirken, wobei Sie 30 s bis 2 min einwirken. Spülen Sie den überschüssigen Farbstoff mit fließendem Wasser ab.
5. Führen Sie eine Gradienten-Ethanol-Dehydratisierung mit 75 % wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten durch, gefolgt von wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten und klären Sie es 3 Minuten lang mit Entparaffinierungslösung.
6. Tropfen Sie eine angemessene Menge neutralen Kaugummis auf den Objektträger, je nach Größe des Gewebes, und senken Sie das Deckglas vorsichtig ab, um Luftblasen zu vermeiden.

16. Mikro-CT und immunhistochemische Analyse

1. Entfernen Sie überschüssige Muskeln und Bänder um die Oberschenkelproben von verschiedenen Gruppen von Mäusen und fixieren Sie das Probengewebe für 24 Stunden in 4% Paraformaldehyd.
2. Trocknen Sie das Knochengewebe an der Luft und führen Sie eine Mikro-CT durch Knochengewebe-Scan durch, um dreidimensionale Mikro-CT-Daten zu erhalten.
3. Aus den konservierten Mauswachsblöcken diese in 6 μm dicke durchgehende Abschnitte schneiden und die Scheiben bei 70 °C -72 °C 30-60 min backen.
4. Entwachsung für 8 Minuten, gefolgt von einer 75%igen Behandlung mit wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten, wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten und PBS-Spülung für 5 Minuten für 3x.
5. Führen Sie eine EDTA-Hochdruckreparatur für 15 Minuten durch, gefolgt von einer PBS-Wäsche für 5 Minuten für 3x.
6. Geben Sie 3% Wasserstoffperoxid tropfenweise in das Gewebe, inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie es 3x lang 5 Minuten lang mit PBS.
7. Zeichnen Sie mit einem immunhistochemischen Stift einen Kreis. Mit PBS-Wäsche 3 min für 3x waschen.
8. Färben Sie den Primärantikörper (Anti-ALP Kaninchen-pAb (1:200), Anti-COL-1 Kaninchen-pAb (1:200), Anti-IL-17 Kaninchen-pAb (1:275), Anti-Act1 (1:500), Anti-IL-6 Kaninchen-pAb (1:500)) über Nacht, gefolgt von einer PBS-Pufferspülung für 5 Minuten für 3x.
9. Den Sekundärantikörper (HRP-konjugiertes Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000)) tropfenweise zugeben und 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mit PBS-Puffer 3x 3 min lang waschen.
10. In DAB gebrauchsfertig 3-5 Minuten inkubieren, dann mit PBS spülen.
11. Führen Sie eine erneute Hämatoxylin-Färbung für 3 Minuten durch, gefolgt von einer PBS-Spülung.
12. Verwenden Sie die Differenzierungslösung für ca. 10 s, gefolgt von einer PBS-Spülung.
13. Geben Sie 10 s lang die blaue Rücklauflösung hinzu, gefolgt von einer PBS-Spülung.
14. Führen Sie eine Behandlung mit 75 % wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten, wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten und klarem Ethanol für 3 Minuten durch. Verwenden Sie neutrales Harz zum Versiegeln von Objektträgern.

Ergebnisse

Wirkstoffe und Wirkungsziele der Xiaoyao-Pillen
Durch die Suche in der TCMSP-Datenbank und das Screening nach den Kriterien der oralen Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30% und der arzneimittelähnlichen Eigenschaften (DL) ≥ 0,18 wurden 125 Wirkstoffe in Xiaoyao-Pillen gefunden. Die Zutaten 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 und 2 stammten von White Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, Süßholz und Ingwer. Ein...

Diskussion

Laut Statistik verursacht Osteoporose in den Vereinigten Staaten jedes Jahr 1,5 Millionen Frakturen, und die überwiegende Mehrheit davon tritt bei postmenopausalen Frauen auf²⁷. Mit der Zunahme der alternden Bevölkerung wird prognostiziert, dass die Mehrheit der zukünftigen Hüftfrakturen weltweit in Asien auftreten wird und dass bis 2050 die Gesamtzahl dieser Frakturen weltweit 8,2 Millionen erreichen wird²⁸. Die Kosten für die Vorbeugung von Frakturen sind fast gleich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography