Études sur l’effet anti-inflammatoire des pilules Xiaoyao dans le traitement de l’ostéoporose post-ménopausique chez la souris

Résumé

L’ostéoporose postménopausique est devenue un problème de santé publique mondial. Le but de cette étude est d’explorer les effets thérapeutiques et les mécanismes associés des pilules de médecine traditionnelle chinoise Xiaoyao sur cette maladie.

Résumé

L’ostéoporose est une maladie métabolique courante chez les femmes âgées et ménopausées, sans symptômes évidents à ses débuts. Dans les derniers stades de cette maladie, les patients sont sujets aux fractures, ce qui peut gravement affecter leur santé et leur qualité de vie. L’augmentation mondiale de l’espérance de vie a fait de l’ostéoporose une préoccupation mondiale. Les pilules Xiaoyao étaient auparavant
Utilisé dans le traitement de la dépression. De plus, le médicament semblait avoir une activité semblable à celle des œstrogènes, ce qui a affecté l’expression de l’ALP, un marqueur précoce spécifique des ostéoblastes, et du COL-1, un composant majeur de la matrice extracellulaire osseuse. Les pilules Xiaoyao ont été évaluées pour leurs effets sur l’ostéoporose post-ménopausique (PMOM) chez la souris. Les informations cibles de chaque composant à base de plantes des pilules Xiaoyao ont été consultées à partir de la base de données de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP). Les informations provenant de GeneCards, d’OMIM, de PharmGkb, de TTD, de DrugBank et d’autres sites Web ont été utilisées pour construire le réseau de régulation du complexe à base de plantes par le biais de Cytoscape et du réseau String afin d’évaluer les interactions protéiques. Des souris ont été ovariectomisées et traitées avec des doses élevées et faibles de pilules Xiaoyao, et celles-ci ont été comparées à des témoins. Leurs symptômes ont été évalués par immunocytochimie des tissus osseux. Les résultats ont suggéré que les pilules Xiaoyao avaient la capacité de soulager les symptômes de la PMOM chez les souris ovariectomisées par la voie de signalisation IL-17. Ce médicament a le potentiel de devenir un nouvel agent thérapeutique pour le traitement de l’ostéoporose.

Introduction

L’Organisation mondiale de la santé (OMS) définit l’ostéoporose (OP) comme une maladie caractérisée par une diminution de la masse osseuse et une détérioration de la microarchitecture du tissu osseux, entraînant une augmentation de la fragilité osseuse et, par conséquent, un risque accru de fracture¹. L’importance clinique de l’ostéoporose est qu’elle peut entraîner des fractures, qui sont associées à une mortalité, une morbidité et des coûts économiques élevés². L’ostéoporose postménopausique (PMOP) est causée par une diminution des niveaux d’œstrogènes chez les femmes après la ménopause, ce qui entraîne une augmentation de l’activité des ostéoclastes, entraînant une perte osseuse et une destruction de la microstructure osseuse. Cela provoque souvent l’ostéoporose avec un impact sérieux sur la santé³. Les traitements actuels pour la PMOP comprennent l’œstrogénothérapie substitutive, les bisphosphonates et l’hormone parathyroïdienne, mais ils peuvent avoir des effets indésirables à des degrés divers, une observance insuffisante à long terme et des coûts élevés⁴. Par conséquent, la phytothérapie abordable est une alternative viable pour une grande partie de la population.

Les pilules Xiaoyao sont incluses dans la pharmacopée chinoise⁵, et celles-ci contiennent huit composants à base de plantes, dont le Chai Hu, l’Angelica sinensis, le Paeonia lactiflora blanc, l’Atractylodes macrocephala, le Poria cocos, le Menthae Herba, la réglisse et le gingembre frais. Toutes ces herbes sont connues pour être efficaces pour détoxifier le foie et renforcer la rate, nourrir le sang et réguler le cycle menstruel, et le mélange a également été utilisé pour traiter la dépression⁶. Cependant, le rôle des pilules Xiaoyao dans l’ostéoporose n’est pas clair.

Les premières études ont suggéré que l’inflammation peut entraîner une perte osseuse⁷ et que le déclin de la densité osseuse associé à ce processus peut être accéléré par la ménopause. De plus, il existe une forte relation entre le développement de l’ostéoporose et de l’inflammation. Le facteur inflammatoire, l’interleukine-17 (IL-17), est un facteur pro-inflammatoire sécrété par les cellules Th17, un sous-ensemble des lymphocytes T CD4+. Ces cellules sont associées à plusieurs maladies inflammatoires chroniques et jouent un rôle important dans le développement de la destruction osseuse dans la polyarthrite rhumatoïde⁸. De plus, l’IL-17 stimule l’activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire-κ B (RANKL), qui régule l’ostéoclastogenèse, conduisant à une plus grande résorption osseuse que la formation osseuse⁹. L’IL-17 stimule l’expression d’autres cytokines ostéoclastogènes telles que le TNFα, l’IL-1, l’IL-6 et l’IL-8. Il a la capacité d’entrer en synergie avec d’autres facteurs inflammatoires, ce qui en fait un effecteur inflammatoire important¹⁰.

Des études ont également montré un lien entre les pilules Xiaoyao et l’inflammation. Shi et ^al.11 et Fang et ^al.12 ont récemment confirmé que les pilules Xiaoyao peuvent réduire les niveaux d’IL-6 et de TNF-α, respectivement. Dans une autre étude sur la stéatohépatite associée au métabolisme, il a été rapporté que les pilules Xiaoyao pouvaient réguler à la hausse l’expression de l’acide propionique, qui à son tour inhibe l’expression du TNF-α et exerce un effet anti-inflammatoire¹³. Cependant, à l’heure actuelle, on ne sait pas si les pilules Xiaoyao peuvent réguler le développement du PMOM en médiant une réponse inflammatoire par l’IL-17, ce qui était le but de cette étude.

Cette étude a prédit l’intersection des cibles des pilules Xiaoyao et des gènes liés à l’ostéoporose grâce à la pharmacologie du réseau et à l’analyse bio-informatique et a analysé les gènes qui se croisent pour les interactions protéiques, GO et KEGG. Sur la base des résultats prédits, l’expression d’Act1 et d’IL-6, qui sont des protéines clés dans la voie de signalisation de l’IL-17, peut être observée^14,15, ainsi que les marqueurs de renouvellement osseux de la phosphatase alcaline (ALP) et du collagène de type I (COL-1), pour observer l’efficacité thérapeutique des pilules Xiaoyao dans le modèle de souris PMOM.

Protocole

Le Comité d’éthique des animaux de laboratoire de l’Université de médecine de Youjiang pour les nationalités a approuvé le protocole d’étude (numéro d’approbation : 2022101502). Des souris femelles C57BL/6, âgées de 10 à 12 semaines, de classe SPF et de poids corporel (22 ± 2) g, ont été hébergées au Centre d’expérimentation animale de classe SPF de l’Université médicale de Youjiang pour les nationalités. Les animaux de laboratoire ont été maintenus à une température de 24-26 °C et à une humidité relative de 55 % à 60 %.

1. Base de données et plateforme d’analyse pharmacologique des systèmes de médecine traditionnelle chinoise

REMARQUE : La base de données et la plateforme d’analyse de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP ; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) sont des plateformes de pharmacologie de médecine chinoise qui contiennent des informations sur les ingrédients de la MTC, les propriétés liées à l’ADME, les cibles et les maladies^16,17.

1. Accédez à l’interface Web TCMSP. Recherchez le nom de Herb, entrez le nom de la médecine chinoise et cliquez sur Rechercher. Cliquez sur Nom latin dans les résultats de la recherche. Effectuer un dépistage sur les résultats des ingrédients avec les paramètres OB ≥ 30% et DL ≥ 0,18.
2. Copiez tous les résultats et enregistrez-les au format TXT, nommé Chinese Medicine Name_ingredients.txt.
3. Sous Informations sur les cibles dans l’onglet Cibles associées, filtrez l’ID Mol (c’est-à-dire le résultat à l’étape 1.2).
4. Copiez les résultats filtrés et enregistrez-les au format TXT nommé Chinese Medicine Name_targets.txt.
   REMARQUE : Grâce aux étapes ci-dessus, tous les ingrédients actifs éligibles et les informations cibles correspondantes de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) ont été obtenus.
5. Placez tous les fichiers ingredients.txt et fichiers targets.txt ci-dessus dans le même dossier et placez les scripts Perl (Supplementary Coding File 1) dans ce dossier.
6. Ouvrez CMD, tapez le chemin du dossier cd, entrez-le et exécutez le script Perl. Récupérez un nouveau fichier texte (allTargets.txt). Ce nouveau fichier texte (allTargets.txt) contient le nom de la plante médicinale, le nom de l’ingrédient et l’ID de l’ingrédient cible.

2. Base de données UniProt

REMARQUE : La base de données UniProt (https://www.uniprot.org/) contient des séquences de protéines humaines annotées avec des informations fonctionnelles, et elle est utilisée pour normaliser les noms des cibles à leurs noms officiels¹⁸.

1. Accédez à l’interface Web d’UniProt. Cliquez sur l’onglet Rechercher , sélectionnez UniProtKB, puis cliquez sur Rechercher.
2. Filtrez dans la barre latérale gauche, sélectionnez Examiné (Swiss-Prot) pour Status et Human pour Popular organisms. Cliquez sur Télécharger, sélectionnez Tout télécharger, sélectionnez TSV pour Format, puis cliquez sur Télécharger pour télécharger le fichier d’annotation.
3. Décompressez le fichier téléchargé dans le dossier actuel, ouvrez le fichier décompressé, puis copiez-le et collez-le dans un fichier texte nommé ann.txt.

3. Conversion de l’ID de la cible du médicament

1. Mettez tous les fichiers cibles de médicaments allTargets.txt obtenus dans la section 1 et le fichier d’annotation UniProt ann.txt obtenu dans la section 2 dans un dossier et mettez-y les scripts Perl (Supplementary Coding File 2).
2. Ouvrez CMD, tapez cd + espace + chemin d’accès au dossier, entrez-le et exécutez le script Perl pour obtenir un nouveau fichier texte (allTargets.symbol.txt). Ce nouveau fichier texte (allTargets.symbol.txt) contient le nom de la plante médicinale, l’ID de l’ingrédient, le nom de l’ingrédient et l’ID du gène.

4. Recherche dans la base de données

1. GeneCards : base de données de gènes humains (GeneCards)
   REMARQUE : La base de données GeneCards (https://www.genecards.org/) fournit des informations de prédiction et d’annotation pour les gènes humains. Il est utilisé pour accéder aux cibles de la maladie^19,20.
   1. Rendez-vous sur l’interface web de GeneCards. Tapez ostéoporose dans la boîte de recherche et cliquez sur Rechercher.
   2. Cliquez sur Exporter et sélectionnez Exporter vers Excel.
   3. Ouvrez le fichier téléchargé, copiez les gènes avec un score de pertinence ≥ 1, collez-les et enregistrez-les dans un fichier nommé GeneCards.txt.
2. Base de données OMIM
   REMARQUE : La base de données OMIM (https://omim.org) contient des gènes, des maladies génétiques et des traits^{humains 21}.
   1. Rendez-vous sur l’interface web d’OMIM. Cliquez sur GENE Map, tapez osteoporose dans le champ de recherche, puis cliquez sur Rechercher.
   2. Cliquez sur Télécharger en tant que et sélectionnez Fichier Excel.
   3. Ouvrez le fichier téléchargé, copiez le nom du gène dans la colonne Symbole approuvé, collez-le et enregistrez-le dans un fichier nommé OMIM.txt.
3. Base de données PharmGkb
   REMARQUE : PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), la base de connaissances en pharmacogénomique, contient des annotations sur les étiquettes des médicaments, des voies centrées sur les médicaments, des résumés pharmacogénétiques et des relations entre les gènes, les médicaments et les maladies²².
   1. Rendez-vous sur l’interface du site PharmGkb. Entrez ostéoporose dans le champ de recherche, cliquez sur Rechercher, puis cochez Gène dans la barre latérale gauche.
   2. Entrez tous les résultats manuellement et enregistrez-les dans un fichier appelé PharmGkb.txt.
4. TTD : Base de données de cibles thérapeutiques (TTD)
   REMARQUE : La base de données TTD (https://idrblab.org/ttd/) fournit des informations sur les cibles de protéines et d’acides nucléiques, les maladies ciblées, les voies et les médicaments correspondants pour chaque cible²³.
   1. Rendez-vous sur l’interface web de TTD. Tapez ostéoporose dans la boîte de recherche et cliquez sur Rechercher.
   2. Cliquez sur Informations sur la cible sous ID de la cible dans le résultat, copiez le nom de la cible, collez-le et enregistrez-le dans un fichier nommé TTD.txt. Au total, 33 résultats ont été obtenus. Enregistrez chaque résultat de la même manière.
5. Base de données DrugBank Online (DrugBank)
   REMARQUE : La base de données DrugBank (https://go.drugbank.com) contient des informations sur les médicaments et les cibles médicamenteuses, les interactions médicamenteuses, les mécanismes médicamenteux et le métabolisme des médicaments²⁴.
   1. Rendez-vous sur l’interface du site DrugBank. Sélectionnez Indications dans l’onglet de recherche, tapez ostéoporose dans la zone de recherche, puis cliquez sur Rechercher.
   2. Cliquez sur l’entrée Ostéoporose dans les résultats pour plus d’informations, cliquez sur l’onglet MÉDICAMENTS ET CIBLES , et cliquez sur le lien approprié dans la colonne CIBLE du tableau.
   3. Cliquez sur Détails dans Protéine, copiez le nom du gène, collez-le et enregistrez-le dans un fichier nommé DrugBank.txt. Enregistrez chaque résultat de la même manière.

5. Diagramme de Venn

1. Fusion de gènes associés à la maladie et cartographie de Venn
   1. Mettez les fichiers txt enregistrés ainsi que le script dans le même dossier.
   2. Ouvrez le code R (Fusionner les gènes liés à la maladie), copiez et collez le chemin où le fichier txt ci-dessus est stocké dans la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
   3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code R modifié et enregistrez. Définissez le gène, nommez le fichier Disease.txt.
   4. Ouvrez le site Web Draw Venn Diagram ; dans la section de saisie, copiez et collez un par un le contenu textuel enregistré dans les sections 4 à 8 dans la liste, en le nommant avec la base de données correspondante et en cliquant sur Soumettre.
   5. Cliquez sur Enregistrer l’image au format PNG sous l’image et enregistrez le résultat du texte dans le même dossier.
2. Intersection de cibles médicamenteuses et de gènes associés à la maladie
   1. Placez le fichier allTargets.symbol.txt obtenu au chapitre 3 et le fichier Disease.txt obtenu à l’étape 5.1.3 dans le même dossier.
   2. Ouvrez le code R (cible du médicament et intersection de la prise de gène liée à la maladie), copiez et collez le chemin où le fichier txt ci-dessus est stocké sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
   3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code R modifié et enregistrez. Définissez le gène, nommez le fichier Drug_Disease.txt.
   4. Ouvrez le site Web Draw Venn Diagram. Dans la section de saisie, copiez et collez allTargets.symbol.txt et Disease.txt dans la liste et nommez-les d’après leurs fichiers respectifs.
   5. Cliquez sur Enregistrer l’image au format PNG sous l’image et enregistrez les résultats du texte dans le même dossier.

6. Construction du réseau réglementaire du compoundage TCM

1. Placez le fichier allTargets.symbol.txt obtenu au chapitre 3 dans le même dossier que le fichier Disease.txt et le script Perl correspondant (Supplementary Coding File 3).
2. Ouvrez CMD, tapez le chemin du fichier cd, appuyez sur Entrée et exécutez le script Perl. Obtenez quatre nouveaux fichiers txt : net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt et net.type.txt. Le fichier network.txt contient l’ID de l’ingrédient TCM, le gène cible, la relation cible et le nom de l’ingrédient. net.type.txt contient le nom du nœud, les attributs et l’affiliation. net.geneLists.txt est la liste des gènes, et net.molLists.txt est la liste des ingrédients.
3. Copiez les fichiers texte nouvellement obtenus dans le même nouveau dossier.
4. Ouvrez le logiciel Cytoscape 3.9.1, cliquez sur Fichier, cliquez sur Importer, puis sélectionnez Fichier de formulaire réseau. Sélectionnez net.network.txt, placez la première colonne de l’ID du composant en tant que nœud source, la deuxième colonne des gènes en tant que nœud cible et la troisième colonne de la relation de ciblage en tant que type d’interaction, puis cliquez sur OK.
5. Importez net.type.txt à partir de la fenêtre Table des nœuds. Cliquez sur l’onglet Sélectionner, sélectionnez Noeuds, À partir du fichier de liste d’ID, sélectionnez net.geneLists.txt, puis cliquez sur Ouvrir.
6. Cliquez sur l’onglet Disposition, sélectionnez Disposition de cercle trié par degrés, puis sélectionnez Nœuds sélectionnés uniquement. Ajustez la hauteur et la largeur des nœuds à 70.
7. Cliquez sur la deuxième zone dans Hauteur, sélectionnez degree.layout dans Colonne, sélectionnez Mappage continu dans Type de mappage, puis double-cliquez sur la fenêtre de réglage de la hauteur sur le côté droit de Mappage actuel pour ajuster les limites supérieure et inférieure de la hauteur à une plage appropriée.
8. Répétez l’opération avec l’option Largeur.
9. Cliquez à nouveau sur l’onglet Disposition , puis sur Outils de mise en page > Ajuster l’échelle afin que les nœuds ne se chevauchent pas.
10. Cliquez sur la fenêtre supérieure droite du logiciel pour désactiver le réseau de nœuds, cliquez sur l’onglet Sélectionner , sélectionnez Nœuds, sélectionnez À partir du fichier de liste d’ID, sélectionnez net.molLists.txt, puis cliquez sur Ouvrir.
11. Cliquez sur l’onglet Disposition, sélectionnez Disposition des attributs de groupe, sélectionnez Nœuds sélectionnés uniquement, puis cliquez sur Type.
12. Cliquez sur Taille de police de l’étiquette dans la colonne de gauche et définissez Valeur par défaut sur 12. Cliquez sur Valeur par défaut dans l’image/le graphique 1 dans la colonne de gauche.
13. Sélectionnez Graphiques dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Graphique à secteurs, puis sélectionnez les éléments dans la colonne Colonnes disponibles, à l’exception du degré. Layout dans la colonne des colonnes sélectionnées et cliquez sur Appliquer.
14. Cliquez sur Border Paint dans la colonne de gauche et définissez la valeur par défaut sur #003EF8. Cliquez sur l’onglet Bord en bas de la barre latérale gauche et définissez Largeur sur 0,8.
15. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils supérieure, sélectionnez Exporter, puis Réseau vers image.
16. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le format PNG pour Format, sélectionnez le répertoire de sauvegarde et nommez le réseau d’images, ajustez le zoom avant sur la taille de l’image à 500 % maximum, sélectionnez Arrière-plan transparent et cliquez sur OK pour terminer l’enregistrement de l’image.

7. Constructions des réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP)

1. Ouvrez le site Web STRING (https://string-db.org/), cliquez sur Protéines multiples, cliquez sur Parcourir dans Télécharger un fichier, sélectionnez le fichier Drug_Disease.txt obtenu à l’étape 5.2.3 et sélectionnez Homo sapiens dans Organismes. Cliquez sur Rechercher , puis sur Continuer.
2. Cliquez sur Paramètres, définissez le score d’interaction minimum requis sur le niveau de confiance le plus élevé (0,900) et cochez Masquer les nœuds déconnectés dans le réseau dans les options d’affichage du réseau. Cliquez sur Mettre à jour.
3. Ajustez les nœuds dans le diagramme de réseau afin qu’il n’y ait pas de chevauchement ou d’occlusion.
4. Cliquez sur Exportations (Exports), puis sur Download (Télécharger) en tant que bitmap haute résolution pour obtenir la carte du réseau d’interfonctionnement des protéines au format PNG. Téléchargez également le fichier TSV sous forme de court texte tabulaire. Enregistrez les deux fichiers dans un dossier unifié. Le fichier TSV contient le nom du gène, l’ID interne STRING et les scores de différents attributs.

8. Construction du cœur du réseau PPI

1. Placez le fichier TSV obtenu dans la section 7 et les scripts Perl requis dans un nouveau dossier.
2. Ouvrez le logiciel Cytoscape 3.9.1, cliquez sur Fichier, sélectionnez Importer, cliquez sur Réseau à partir du fichier, sélectionnez le fichier TSV ci-dessus, placez le premier nœud de colonne1 comme Nœud source et le deuxième nœud de colonne 2 comme Nœud cible, puis cliquez sur OK.
3. Cliquez sur Style dans la barre latérale gauche, cliquez sur Valeur par défaut en largeur et définissez-la sur 60. Faites glisser et déposez les nœuds afin qu’il n’y ait pas de chevauchement ni d’occlusion dans le réseau.
4. Cliquez sur APP dans la barre d’outils supérieure, sur CytoNCA, puis sur Ouvrir.
5. Dans la colonne de gauche, sélectionnez Sans pondération sous Intermédiarité, Proximité, Degré, Vecteur propre, Méthode basée sur la connectivité moyenne locale et Réseau, puis cliquez sur Analyser.
6. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur Table des nœuds dans la fenêtre en bas à droite, cliquez sur Exporter, enregistrez-la dans le dossier et nommez-la score 1.
   REMARQUE : Le plug-in CytoNCA doit être installé dans le logiciel Cytoscape. Pour ce faire, cliquez sur Applications dans la barre d’outils supérieure, cliquez sur APP Manager, entrez CytoNCA dans la zone de recherche, cochez CytoNCA dans la colonne du milieu des résultats renvoyés, puis cliquez sur Installer.
7. Ouvrez score1, ajustez la colonne du nom à la première colonne, copiez les informations dans le tableau, collez-les dans un nouveau fichier texte, nommez-le score1.txt et enregistrez-le.
8. Ouvrez le code R et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier score1.txt sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
9. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code modifié pour obtenir deux nouveaux fichiers, score2.txt et score2.gene.txt. Le fichier score2.txt contient les gènes pour lesquels tous les scores du programme étaient supérieurs à la médiane et les scores spécifiques pour chaque programme. score2.gene.txt contient les gènes qui ont obtenu un score supérieur à la médiane pour tous les éléments.
10. Pour continuer dans Cytoscape, cliquez sur AnalysisPanel 1 dans la fenêtre inférieure droite, cliquez sur Télécharger à partir d’un fichier sur le côté gauche de la fenêtre, sélectionnez le score2.gene.txt, cliquez sur Ouvrir et appuyez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
11. Cliquez sur Sélectionner des nœuds en bas et cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
12. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils supérieure, sélectionnez Exporter, cliquez sur Réseau vers l’image, ajustez le zoom (%) de la taille de l’image au maximum 500 %, cochez Arrière-plan transparent et enregistrez le fichier dans le même dossier, nommez-le network1.
13. Cliquez sur Créer un sous-réseau dans la barre latérale droite de la fenêtre inférieure pour créer un sous-réseau, analyser le sous-réseau, cliquer sur APP dans la barre d’outils en haut, cliquer sur CytoNCA et cliquer sur Ouvrir.
14. Dans la barre latérale gauche, sélectionnez Sans poids sous Intermédiarité, Proximité, Degré, Vecteur propre, Méthode basée sur la connectivité moyenne locale et Réseau, puis cliquez sur Analyser.
15. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur Table de nœuds dans la fenêtre inférieure droite, cliquez sur Exporter et enregistrez-la dans un nouveau dossier nommé score2.
16. Ouvrez score2, ajustez la colonne de nom à la première colonne, copiez les informations dans le tableau, collez-les dans un nouveau fichier texte, nommez-le score2.txt et enregistrez-le.
17. Ouvrez le code R et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier score2.txt sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
18. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code modifié pour obtenir deux nouveaux fichiers : score3.txt et score3.gene.txt. Le fichier score3.txt contient les gènes qui ont obtenu un score supérieur à la médiane pour tous les éléments et les scores spécifiques pour chaque élément. score3.gene.txt contient les gènes qui ont obtenu un score supérieur à la médiane pour tous les éléments.
19. Pour continuer dans Cytoscape, cliquez sur AnalysisPanel 1 dans la fenêtre inférieure droite, cliquez sur Télécharger à partir d’un fichier sur le côté gauche de la fenêtre, sélectionnez le score3.gene.txt, cliquez sur Ouvrir et appuyez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
20. Cliquez sur Sélectionner des nœuds en bas et cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
21. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils supérieure, sélectionnez Exporter, cliquez sur Réseau vers l’image, ajustez le zoom (%) de la taille de l’image à 500 %, cochez Arrière-plan transparent et enregistrez le fichier dans le même dossier que celui utilisé dans cette étape, en le nommant network2.
22. Cliquez sur Créer un sous-réseau dans la barre latérale droite de la fenêtre ci-dessous pour créer un sous-réseau.
23. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils en haut, sélectionnez Exporter, cliquez sur Réseau vers l’image, ajustez le zoom (%) de la taille de l’image au maximum de 500 %, cochez Arrière-plan transparent et enregistrez le fichier dans le même dossier que celui utilisé dans cette étape et nommez-le network3.

9. Conversion de l’ID génétique

1. Placez le fichier Drug_Disease.txt dans le même nouveau dossier que le fichier de code requis.
2. Ouvrez le code R (Supplementary Coding File 4) et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier Drug_Disease.txt sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code modifié à l’aide de l’organisation. Hs.eg.db paquet pour convertir l’ID du gène et l’exécuter après la fin d’un nouveau fichier id.txt. Le id.txt contient le symbole du gène et l’ID correspondant.

10. Analyse de l’enrichissement GO

1. Placez le fichier id.txt de l’étape précédente dans le même dossier que le code d’analyse d’enrichissement GO.
2. Ouvrez le code R (Supplementary Coding File 5) et définissez le répertoire de travail sur id.txt et le chemin d’accès où le code GO est stocké.
3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code modifié et utilisez clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichissez le graphique, le graphique ggplot2, les histogrammes d’analyse d’enrichissement GO et les graphiques à bulles. Une fois l’exécution terminée, obtenez trois nouveaux fichiers, GO.txt, barplot.pdf et bubble.pdf.
   REMARQUE : Le GO.txt est le fichier de résultats d’enrichissement contenant la classification d’enrichissement (BP, CC, MF), L’ID GO, le nom GO, la proportion de gènes, la proportion de fond, la valeur p significative de l’enrichissement, la valeur p corrigée (p.adjust, value), l’ID du gène (nom) et le nombre de gènes enrichis sur chaque GO. barplot.pdf est l’histogramme, bulle. PDF est un graphique à bulles.

11. Analyse de l’enrichissement de KEGG

1. Placez le fichier id.txt dans le même dossier que le code d’analyse d’enrichissement KEGG.
2. Ouvrez le code R (Supplementary Coding File 6) et définissez le répertoire de travail sur le chemin d’accès où id.txt et le code KEGG sont stockés.
3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code modifié et utilisez clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 pour tracer des histogrammes d’analyse d’enrichissement GO, des diagrammes à bulles et des tracés de chemin. La série se termine par la production de trois nouveaux fichiers, KEGG.txt, barplot.pdf et bubble.pdf.
   REMARQUE : Le fichier KEGG.txt est un fichier de résultats d’enrichissement contenant l’ID de la voie, la description de la voie, la proportion de gènes, la proportion de gènes, la proportion de fond, la valeur p de signification de l’enrichissement, la valeur p corrigée (p.adjust, qvalue), l’ID de gène (nom) et le nombre de gènes enrichis dans chaque voie. barplot.pdf est un graphique à barres et bubble.pdf est un graphique à bulles.
4. Rechercher IL-17 dans le dossier KEGG.txt ; Le résultat montre qu’il n’y a qu’une seule voie ; copiez l’ID du chemin.
5. Ouvrez le code R, collez l’ID de chemin IL-17 sur KEGGID et utilisez le package pathview pour étiqueter la carte du chemin. Exécutez le code R modifié et obtenez deux nouveaux fichiers, hsa04657.pathview.png et hsa04657.png.
   REMARQUE : Le fichier hsa04657.png est la carte du chemin, hsa04657.pathview.png est la carte du chemin étiqueté, et ceux étiquetés en rouge sont les gènes présents dans le réseau d’interactions.

12. Préparation des pilules Xiaoyao

REMARQUE : Pour la méthode de préparation utilisée, reportez-vous à la Pharmacopée Chinoise⁵.

1. Prenez 100 g de Chai Hu, 100 g d’Angelica sinensis, 100 g de Paeonia lactiflora blanc, 100 g d’Atractylodes macrocephala sauté, 100 g de Poria cocos, 80 g de Radix glycyrrhizae preparate et 20 g de Menthae herba.
2. À l’aide d’un moulin à pierre ou d’une machine à poudrer, écrasez les herbes en une poudre fine ; Plusieurs herbes sont combinées dans les proportions ci-dessus et pulvérisées en une poudre fine pour se mélanger naturellement. Utilisez un tamis à drogue de 80 mailles d’un diamètre intérieur de 180 μm ± 7,6 μm et tamisez la poudre pulvérisée. Mélanger.
3. Prenez 100 g de gingembre, ajoutez de l’eau et faites-le bouillir 2 fois pendant 20 minutes à chaque fois. Filtrer et réserver.
4. Prenez une plaque médicinale, trempez un petit balai dans de l’eau de gingembre, badigeonnez-le sur la plaque, prenez la poudre ci-dessus, saupoudrez-la sur l’eau de gingembre et retournez la plaque de sorte que toute la poudre soit humide et qu’elle puisse être moulée en forme de boule.
   REMARQUE : La formation de la plaque médicinale est une étape essentielle lors de la préparation des pilules de MTC. La plupart du bambou moso sera divisé en bandes et tissé en un squelette. La peau de bambou, ou tengpi, est tissée dans la surface et s’arrondit. La surface de la plaque doit être recouverte d’huile d’abrasin mince, puis brossée d’une couche de vernis. Celui-ci est séché pour devenir étanche. Les pilules fabriquées de cette manière seront rondes et lisses.
5. Badigeonnez à nouveau l’eau de gingembre, saupoudrez la poudre et tournez la plaque de sorte que le médicament s’arrondisse et s’agrandit progressivement. Placer dans un endroit frais pour le séchage.

13. Etablissement du modèle animal

1. Après 7 jours d’acclimatation, divisez au hasard les souris expérimentales en 4 groupes, à savoir, le groupe d’opération simulée (Sham, où seule la graisse autour des ovaires a été retirée) et trois groupes de souris ovariectomisées composées d’un groupe modèle (OVX) ainsi que des groupes d’administration de pilules Xiaoyao à faible et haute concentration.
2. Anesthésier les souris avec du pentobarbital sodique à 3 % (40 mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale. Vérifiez que les souris entrent dans l’état d’anesthésie en observant une relaxation musculaire généralisée, une respiration profonde et lente et un mouvement ralenti. Appliquez une pommade oculaire sur les yeux des souris avant la chirurgie.
3. Placez les animaux en position couchée et rasez la région rénale du dos avec un rasoir pour animaux. Effectuer une désinfection locale avec de l’éthanol à 75 %.
4. Faites une incision longitudinale d’environ 1 cm bilatéralement, près de la région dorsale du rein, et incisez le fascia pour séparer les muscles et le péritoine.
5. Localisez la partie supérieure de la corne utérine et les trompes de Fallope pour la ligature. Insérez une pince dans l’incision pour l’exploration et localisez l’ovaire, enveloppé de tissu adipeux dans un motif de chou-fleur rouge vif, avec des trompes de Fallope disposées en spirale sous l’ovaire, reliant l’ovaire à la corne utérine²⁵. Retirez les ovaires avec des ciseaux chirurgicaux et des sutures.
6. Prélever une petite quantité de tissu adipeux près de l’ovaire comme témoin dans le groupe d’opération simulée. Observez les animaux jusqu’à ce qu’ils reprennent conscience. Placez les animaux postopératoires dans des cages séparées jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement.
7. Pour prévenir l’infection, fournissez de la gentamicine aux souris pendant 3 jours postopératoires. Après l’opération, assurez-vous d’une alimentation normale et d’un bon environnement de croissance en fonction de l’état réel des souris. S’il y a des anomalies, telles qu’une infection de la plaie ou une perte d’appétit, consultez immédiatement l’instructeur du Centre des animaux de laboratoire.

14. Administration des médicaments

REMARQUE : Selon la méthodologie expérimentale de pharmacologie²⁶, la conversion des doses humaines et animales utilisées était de 9 g de pilules Xiaoyao pour un adulte de 70 kg, ce qui équivaut à une dose (dose pour une seule administration).

1. Pour les groupes à faible dose et à dose élevée, utiliser 0,683 g/kg et 2,73 g/kg, respectivement, pour un groupe de 8 animaux. Utilisez la main gauche pour immobiliser la souris de sorte que la bouche de la souris soit en ligne droite avec l’œsophage. En tenant l’aiguille de gavage dans la main droite, insérez-la doucement dans l’œsophage le long de la paroi postérieure du pharynx à partir du coin de la bouche de la souris.
2. À ce stade, la direction de l’aiguille du gavage peut être légèrement modifiée pour stimuler une action de déglutition induite. Injectez le médicament. Effectuez cette opération une fois par jour pendant 12 semaines.
3. Pour les groupes simulés et modèles, administrer une solution saline une fois par jour pendant 12 semaines en une quantité déterminée par le poids de l’animal.
4. Euthanasier les souris par luxation cervicale et couper leurs membres postérieurs. Écorchez les membres pour séparer le muscle du fémur. Traitez les fémurs de souris avec une solution de décalcification EDTA pendant 1 mois et remplacez-les quotidiennement par une solution fraîche.

15. Coloration à l’hématoxyline-éosine (HE)

1. Décirer les tissus fémoraux pendant 8 min, puis les placer dans de l’éthanol dégradé pendant 3 min ; Rincer à l’eau courante pendant 1 min.
2. Ajouter la solution de coloration à l’hématoxyline goutte à goutte sur les sections pour couvrir complètement le tissu, colorer pendant 5 min et laver à l’eau du robinet
3. Ajoutez la solution de différenciation de l’acide chlorhydrique au tissu sur la lame, en vous assurant qu’elle recouvre complètement le tissu. Arrêt lorsque la décoloration du tissu est observée. Rincer à l’eau du robinet.
4. Ajouter la solution de colorant Eosin goutte à goutte et laisser couvrir complètement le tissu, en agissant pendant 30 s à 2 min. Rincez l’excédent de colorant à l’eau courante.
5. Effectuez une déshydratation à l’éthanol en gradient avec de l’éthanol anhydre à 75 % pendant 5 min, suivie d’un éthanol anhydre pendant 5 min, et éclaircissez à l’aide d’une solution de déparaffinage pendant 3 min.
6. Déposez une quantité appropriée de gomme neutre sur la lame en fonction de la taille du tissu, et abaissez soigneusement la lamelle, en évitant les bulles d’air.

16. Analyse micro-CT et immunohistochimie

1. Retirez les muscles et les ligaments en excès autour du fémur de différents groupes de souris et fixez les tissus de l’échantillon dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h.
2. Séchez les tissus osseux à l’air libre et effectuez une micro-TDM par balayage des tissus osseux afin d’obtenir des données micro-CT tridimensionnelles.
3. À partir des blocs de cire de souris conservés, coupez-les en sections continues de 6 μm d’épaisseur et faites cuire les tranches à 70 °C -72 °C pendant 30 à 60 min.
4. Déparaffinage pendant 8 min, suivi d’un traitement à l’éthanol anhydre à 75 % pendant 5 min, à l’éthanol anhydre pendant 5 min et au rinçage PBS pendant 5 min pendant 3 fois.
5. Effectuez une réparation à haute pression EDTA pendant 15 minutes, suivie d’un lavage PBS pendant 5 minutes pendant 3 fois.
6. Ajoutez 3 % de peroxyde d’hydrogène goutte à goutte sur le tissu, incubez à température ambiante pendant 10 minutes et lavez avec du PBS pendant 5 minutes pendant 3 fois.
7. Utilisez un stylo d’immunohistochimie pour dessiner un cercle. Laver avec PBS wash pendant 3 min pour 3x.
8. Colorer l’anticorps primaire (anticorps anti-ALP chez le lapin (1:200), anticorps anti-COL-1 chez le lapin (1:200), anticorps anti-IL-17 chez le lapin (1:275), anti-Act1 (1:500), anticorps anti-IL-6 chez le lapin (1:500)) pendant la nuit, suivi d’un rinçage du tampon PBS pendant 5 minutes pendant 3 fois.
9. Ajouter l’anticorps secondaire (Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L ; 1:2000) conjugué à HRP et incuber à température ambiante pendant 60 min. Laver avec un tampon PBS pendant 3 min pour 3x.
10. Incuber dans du DAB prêt à l’emploi pendant 3 à 5 min, puis rincer au PBS.
11. Effectuez une nouvelle coloration à l’hématoxyline pendant 3 min, suivie d’un rinçage PBS.
12. Utilisez la solution de différenciation pendant environ 10 secondes, suivie d’un rinçage PBS.
13. Ajouter la solution bleue de retour pendant 10 s, suivie d’un rinçage PBS.
14. Effectuer un traitement à l’éthanol anhydre à 75 % pendant 5 min, à l’éthanol anhydre pendant 5 min et à l’éthanol clair pendant 3 min. Utilisez de la résine neutre pour sceller les diapositives.

Résultats

Principes actifs et cibles d’action des pilules Xiaoyao
En effectuant une recherche dans la base de données TCMSP et en effectuant un dépistage selon les critères de biodisponibilité orale (OB) ≥ 30 % et de propriétés similaires au médicament (DL) ≥ 0,18, 125 ingrédients actifs ont été trouvés dans les pilules Xiaoyao. Parmi eux, les ingrédients 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 et 2 provenaient respectivement de Paeonia lactiflora blanc, Atractylodes macrocephala, Menthae ...

Discussion

Selon les statistiques, l’ostéoporose est à l’origine de 1,5 million de fractures chaque année aux États-Unis, et la grande majorité d’entre elles surviennent chez les femmes ménopausées^. Avec l’augmentation du vieillissement de la population, on prévoit que la majorité des fractures de la hanche dans le monde se produiront en Asie et que d’ici 2050, le nombre total de fractures de la hanche dans le monde atteindra 8,2 millions²⁸. Le coût de la préventi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography