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要約

閉経後の骨粗鬆症は、世界的な公衆衛生問題となっています。この研究の目的は、この状態に対する伝統的な漢方薬 Xiaoyao 錠剤の治療効果と関連メカニズムを調査することです。

要約

骨粗鬆症は、高齢者や閉経後の女性によく見られる代謝性疾患で、初期段階では明らかな症状はありません。この状態の後期では、患者は骨折しやすく、これは彼らの健康と生活の質に深刻な影響を与える可能性があります。平均寿命の世界的な増加により、骨粗鬆症は世界的な懸念事項となっています。Xiaoyaoの丸薬は以前、
うつ病の治療に使用されます。さらに、この薬剤はエストロゲン様活性を有すると考えられ、初期の骨芽細胞特異的マーカーであるALPと骨細胞外マトリックスの主成分であるCOL-1の発現に影響を与えました。Xiaoyaoピルは、マウスの閉経後骨粗鬆症(PMOM)への影響について評価されました。.Xiaoyao錠剤の各ハーブ成分のターゲット情報は、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)データベースを通じてアクセスされました。GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBankなどのウェブサイトからの情報を使用して、CytoscapeおよびStringネットワークを通じてハーブ複合体の制御ネットワークを構築し、タンパク質相互作用を評価しました。マウスを卵巣摘出し、高用量と低用量のXiaoyao錠剤で治療し、これらを対照と比較しました。彼らの症状は、骨組織の免疫細胞化学によって評価されました。その結果、Xiaoyaoピルは、IL-17シグナル伝達経路を通じて卵巣摘出マウスのPMOMの症状を緩和する能力があることが示唆されました。この薬剤は、骨粗鬆症の治療のための新しい治療薬になる可能性を秘めています。

概要

世界保健機関(WHO)は、骨粗鬆症(OP)を骨量の減少と骨組織の微細構造の悪化を特徴とする疾患と定義しており、骨の脆性が増大し、骨折リスクが増加します1。骨粗鬆症の臨床的意義は、骨折を引き起こす可能性があることであり、これは高い死亡率、罹患率、および経済的コストに関連しています2。閉経後骨粗鬆症(PMOP)は、閉経後の女性のエストロゲンレベルの低下によって引き起こされ、破骨細胞の活性が増加し、骨量の減少と骨の微細構造の破壊をもたらします。これはしばしば骨粗鬆症を引き起こし、健康に深刻な影響を及ぼします3。PMOP の現在の治療法には、エストロゲン補充療法、ビスフォスフォネート、副甲状腺ホルモンなどがありますが、さまざまな程度の副作用、不十分な長期コンプライアンス、および高コストが発生する可能性があります4。したがって、手頃な価格の漢方薬は、人口の大部分にとって実行可能な代替手段です。

Xiaoyaoの丸薬は中国の薬局方5に含まれており、これらはChai Hu、 Angelica sinensis、 White paeonia lactiflora、 Atractylodes macrocephala、 Poria cocos、 Menthae Herba、甘草、新鮮な生姜を含む8つのハーブ成分を含んでいます。これらのハーブはすべて、肝臓の解毒と脾臓の強化、血液の栄養補給、月経周期の調節に効果的であることが知られており、この混合物はうつ病の治療にも使用されています6。しかし、骨粗鬆症におけるXiaoyao錠剤の役割は不明です。

初期の研究では、炎症が骨量減少につながることがあり7、このプロセスに関連する骨密度の低下は閉経によって加速される可能性があることが示唆されています。さらに、骨粗鬆症の発症と炎症との間には強い関係があります。炎症因子であるインターロイキン-17(IL-17)は、CD4+ Tリンパ球のサブセットであるTh17細胞によって分泌される炎症誘発性因子です。これらの細胞はいくつかの慢性炎症性疾患と関連しており、関節リウマチ8の骨破壊の進行に重要な役割を果たしています。さらに、IL-17は、破骨細胞形成を調節する核因子-κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)を刺激し、骨形成よりも骨吸収が大きくなります9。IL-17は、TNFα、IL-1、IL-6、IL-8などの他の破骨細胞誘発性サイトカインの発現を刺激します。それは他の炎症性因子と相乗作用する能力を持っているため、重要な炎症性エフェクター10になります。

また、小紗丸薬と炎症との関連性が研究で示されています。Shi et al.11 と Fang et al.12 は最近、Xiaoyao 錠剤がそれぞれ IL-6 と TNF-α のレベルを下げることができることを確認しました。代謝関連脂肪性肝炎の別の研究では、Xiaoyao錠剤がプロピオン酸の発現をアップレギュレートし、それがTNF-αの発現を阻害し、抗炎症効果を発揮することが報告されました13。しかし、現在のところ、XiaoyaoピルがIL-17を介した炎症反応を媒介することによりPMOMの発症を調節できるかどうかは不明です。

この研究では、ネットワーク薬理学とバイオインフォマティクス分析を通じて、Xiaoyao錠剤のターゲットと骨粗鬆症関連遺伝子の交差を予測し、タンパク質相互作用、GO、およびKEGGの交差遺伝子を分析しました。予測された結果に基づいて、IL-17シグナル伝達経路の主要なタンパク質であるAct1およびIL-6の発現を観察することができ14,15、ならびに骨代謝回転マーカーであるアルカリホスファターゼ(ALP)およびI型コラーゲン(COL-1)を観察することができ、PMOMマウスモデルにおけるXiaoyao錠剤の治療効果を観察することができる。

プロトコル

Youjiang Medical University for Nationalitiesの実験動物倫理委員会は、研究プロトコルを承認しました(承認番号:2022101502)。雌のC57BL/6マウス、10-12週齢、SPFクラスおよび体重(22 ± 2)gを、Youjiang Medical University for NationalitiesのSPFクラス動物実験センターに収容しました。実験動物は、温度24〜26°C、相対湿度55〜60%に維持されました。

1. 伝統的な漢方薬システム薬理学データベースと分析プラットフォーム

注:Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)は、TCM成分、ADME関連の特性、標的、および疾患に関する情報を含む漢方薬理学プラットフォームです16,17。

  1. TCMSP Web インターフェイスにアクセスします。ハーブの名前を検索し、漢方薬の名前を入力して、[ 検索]をクリックします。検索結果の 「Latin Name 」をクリックします。パラメータOB≥30%およびDL≥0.18で成分の結果に対してスクリーニングを実行します。
  2. すべての結果をコピーして、漢方薬という名前のTXT形式で保存Name_ingredients.txt。
  3. 「Related Targets」タブの「Targets Information」で、「Mol ID」をフィルタリングします(つまり、ステップ1.2の結果)。
  4. フィルタリングされた結果をコピーし、Chinese Medicine Name_targets.txtという名前のTXT形式で保存します。
    注:上記の手順を通じて、すべての適格な有効成分と伝統的な漢方薬(TCM)の対応する標的情報が得られました。
  5. 上記のingredients.txtファイルとtargets.txtファイルをすべて同じフォルダに配置し、Perlスクリプト(Supplementary Coding File 1)をそのフォルダに配置します。
  6. CMDを開き、cdフォルダのパスを入力して入力し、Perlスクリプトを実行します。新しいテキスト ファイル (allTargets.txt) を取得します。この新しいテキスト ファイル (allTargets.txt) には、ハーブ名、成分名、成分 ID、およびターゲットが含まれています。

2. UniProtデータベース

注:UniProtデータベース(https://www.uniprot.org/)には、機能情報で注釈が付けられたヒトタンパク質配列が含まれており、ターゲットの名前を正式名称に正規化するために使用されます18。

  1. UniProtのWebインターフェースに移動します。 「検索 」タブをクリックし、「 UniProtKB」を選択して「 検索」をクリックします。
  2. 左側のサイドバーでフィルターを選択し、[ステータス]に [レビュー済み(Swiss-Prot)] を選択し、[人気のある生物]に [人間 ]を選択します。 「ダウンロード」をクリックし、「 すべてダウンロード」を選択し、「フォーマット」で 「TSV 」を選択し、「 ダウンロード 」をクリックしてアノテーションファイルをダウンロードします。
  3. ダウンロードしたファイルを現在のフォルダに解凍し、解凍したファイルを開き、コピーしてann.txtという名前のテキストファイルに貼り付けます。

3. 薬剤ターゲットIDの変換

  1. セクション1で取得した薬剤ターゲットファイルallTargets.txt、セクション2で取得したUniProtアノテーションファイルann.txt全てフォルダに入れ、その中にPerlスクリプト(Supplementary Coding File 2)を入れてください。
  2. CMDを開き、cd + space +フォルダパスを入力して入力し、Perlスクリプトを実行して新しいテキストファイル(allTargets.symbol.txt)を取得します。この新しいテキストファイル(allTargets.symbol.txt)には、ハーブ名、成分ID、成分名、および遺伝子IDが含まれています。

4. データベース検索

  1. GeneCards: ヒト遺伝子データベース(GeneCards)データベース
    注:GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)は、ヒト遺伝子の予測およびアノテーション情報を提供します。これは、疾患ターゲット19,20にアクセスするために使用されます。
    1. GeneCardsのウェブインターフェースに移動します。検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力し、[ 検索] をクリックします。
    2. [エクスポート] をクリックし、[Excel にエクスポート] を選択します。
    3. ダウンロードしたファイルを開き、関連性スコアが ≥1 の遺伝子をコピーし、GeneCards.txt という名前のファイルに貼り付けて保存します。
  2. OMIM データベース
    注:OMIMデータベース(https://omim.org)には、ヒトの遺伝子、遺伝病、および形質が含まれています21。
    1. OMIM Web インターフェイスに移動します。 GENE Mapをクリックし、検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力して、[ 検索]をクリックします。
    2. 「 名前を付けてダウンロード 」をクリックし、「 Excel ファイル」を選択します。
    3. ダウンロードしたファイルを開き、Approved Symbol列の遺伝子名をコピーして貼り付け、OMIM.txtという名前のファイルに保存します。
  3. PharmGkbデータベース
    注:薬理ゲノミクスの知識ベースであるPharmGkb(https://www.pharmgkb.org)には、薬物ラベルの注釈、薬物中心の経路、薬理遺伝学的要約、および遺伝子、薬物、および疾患間の関係が含まれています22。
    1. PharmGkb Webサイトのインターフェースに移動します。検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力し、「 検索」をクリックして、左側のサイドバーで 「Gene 」にチェックを入れます。
    2. すべての結果を手動で入力し、PharmGkb.txt というファイルに保存します。
  4. TTD:Therapeutic Target Database(TTD)データベース
    注:TTDデータベース(https://idrblab.org/ttd/)は、タンパク質および核酸標的、標的疾患、経路情報、および各標的23に対応する薬物に関する情報を提供する。
    1. TTDに移動します web インターフェース。検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力し、[ 検索] をクリックします。
    2. 結果の「ターゲット ID」の下の 「ターゲット情報 」をクリックし、「ターゲット名」をコピーして貼り付け、TTD.txtという名前のファイルに保存します。合計33件の結果が得られました。各結果を同じ方法で保存します。
  5. DrugBank Online (DrugBank) データベース
    注:DrugBankデータベース(https://go.drugbank.com)には、薬物および薬物標的、薬物相互作用、薬物メカニズム、および薬物代謝に関する情報が含まれている24。
    1. DrugBank の Web サイトのインターフェースに移動します。検索タブで 適応症 を選択し、検索ボックスに骨粗鬆症と入力して、 検索をクリックします。
    2. 詳細については、結果の 「骨粗鬆症 」の項目をクリックし、「 DRUGS AND TARGETS」 タブをクリックし、表の「TARGET」列の 「適切なリンク 」をクリックしてください。
    3. 「Protein」の「Details」をクリックし、「Gene Name」をコピーして貼り付け、「DrugBank.txt」という名前のファイルに保存します。各結果を同じ方法で保存します。

5. ベン図

    6. TCMコンパウンドのレギュレーションネットワークの構築

    1. セクション3で取得したallTargets.symbol.txtファイルを、Disease.txtファイルおよび対応するPerlスクリプト(Supplementary Coding File 3)と同じフォルダに配置します。
    2. CMDを開き、cdファイルのパスを入力してEnterキーを押し、Perlスクリプトを実行します。4 つの新しい txt ファイル(net.geneLists.txt、net.molLists.txt、net.network.txt、net.type.txt)を取得します。network.txtファイルには、TCM成分ID、ターゲット遺伝子、ターゲット関係、および成分名が含まれています。net.type.txt ノード名、属性、および所属が含まれています。net.geneLists.txtは遺伝子のリスト、net.molLists.txtは成分のリストです。
    3. 新しく取得したテキストファイルを同じ新しいフォルダにコピーします。
    4. Cytoscape 3.9.1 ソフトウェアを開き、[ ファイル]、[ インポート]、[ ネットワーク フォーム ファイル] の順にクリックします。 「net.network.txt」を選択し、「Component ID」の最初の列を「Source Node」として、「Genes」の2番目の列を「Target Node」として、「Targeting Relationship」の3番目の列を「Interaction Type」として入力し、「 OK」をクリックします。
    5. 「ノード・テーブル」ウィンドウからnet.type.txtをインポートします。 「選択」タブをクリックし、「 ノード」を選択し、「 ID リスト・ファイルから」を選択し、「 net.geneLists.txt」を選択して 、「開く」をクリックします。
    6. [レイアウト] タブをクリックし、[次数で並べ替えられた円のレイアウト] を選択し、[選択したノードのみ] を選択します。ノードの高さと幅の両方を 70 に調整します。
    7. [高さ] の 2 番目のボックスをクリックし、[列] で degree.layout を選択し、[マッピングの種類] で [連続マッピング] を選択し、[現在のマッピング] の右側にある [高さ調整ウィンドウ] をダブルクリックして、高さの上限と下限を適切な範囲に調整します。
    8. [幅] オプションで操作を繰り返します。
    9. [レイアウト] タブをもう一度クリックし、[レイアウト ツール] をクリックして [レイアウト ツール] をクリックし>ノードが重ならないようにスケールを調整します。
    10. ソフトウェアの 右上のウィンドウ をクリックしてノードネットワークのチェックを外し、[ 選択 ]タブをクリックして[ ノード]を選択し、[ IDリストから]ファイルを選択し、[ net.molLists.txt]を選択して、[ 開く]をクリックします。
    11. 「レイアウト」タブをクリックし、「グループ属性レイアウト」を選択し、「選択したノードのみ」を選択して、「タイプ」をクリックします。
    12. 左の列で 「ラベルのフォントサイズ 」をクリックし、「デフォルト値」を12に設定します。左の列にある[画像/グラフ1の デフォルト値 ]をクリックします。
    13. ポップアップウィンドウで [チャート ]を選択し、[ 円グラフ]をクリックして、[使用可能な列]列で学位を除く アイテム を選択します。選択した列列にレイアウトし、[ 適用] をクリックします。
    14. 左側の列にある [Border Paint ]をクリックし、[Default Value]を #003EF8 に設定します。左側のサイドバーの下部にある [エッジ ]タブをクリックし、[幅]を0.8に設定します。
    15. 上部のツールバーの「ファイル」をクリックし、「 エクスポート」を選択してから、「 ネットワークからイメージへ」を選択します。
    16. ポップアップウィンドウで、[ フォーマット]に[PNG形式]を選択し、 保存ディレクトリを選択して画像ネットワークに名前を付け、[ズームイン画像サイズ]を最大500%に調整し、[ 透明な背景]を選択し、[ OK ]をクリックして画像の保存を終了します。

    7. タンパク質間相互作用ネットワーク(PPI)コンストラクト

    1. STRING Web サイト (https://string-db.org/) を開き、[Multiple Protein] をクリックし、[Upload a file] で [Browse ] をクリックし、手順 5.2.3 で取得した Drug_Disease.txt ファイル を選択し、[ Homo sapiens in Organisms] を選択します。 「検索 」をクリックし、「 続行」をクリックします。
    2. [設定] をクリックし、必要最小限のインタラクション スコアを最も高い信頼度 (0.900) に設定し、ネットワーク表示オプションで [ネットワーク内の切断されたノードを非表示にする] をオンにします。「更新」をクリックします。
    3. ネットワーク図内のノードを調整して、オーバーラップやオクルージョンが発生しないようにします。
    4. 「エクスポート」をクリックし、「高解像度ビットマップとしてダウンロード」をクリックして、PNG形式のタンパク質インターワーキングネットワークマップを取得します。また、TSVファイルを短い表形式のテキスト出力としてダウンロードします。両方のファイルを統合フォルダに保存します。TSVファイルには、遺伝子名、STRING内部ID、およびさまざまな属性のスコアが含まれています。

    8. PPIネットワークコアの構築

    1. セクション 7 で取得した TSV ファイルと必要な Perl スクリプトを新しいフォルダに配置します。
    2. Cytoscape 3.9.1ソフトウェアを開き、[ ファイル]をクリックし、[ インポート]を選択し、[ ファイルからネットワーク]をクリックし、[ 上記のTSVファイル]を選択し、最初の列node1をソースノードとして、2番目の列node2をターゲットノードとして配置し、[ OK]をクリックします。
    3. 左側のサイドバーで [スタイル ] をクリックし、[幅] の [デフォルト値 ] をクリックして 60 に設定します。ノードをドラッグアンドドロップして、ネットワークにオーバーラップやオクルージョンがないようにします。
    4. 上部のツールバーの [APPs ]をクリックし、[ CytoNCA]をクリックして、[ Open]をクリックします。
    5. 左側の列で、[媒介]、[近接]、[次数]、[固有ベクトル]、[局所平均接続性ベースの方法]、および[ネットワーク]で [重みなし ]を選択し、[ 分析]をクリックします。
    6. 分析が完了したら、右下のウィンドウで [Node Table ]をクリックし、[ Export]をクリックしてフォルダに保存し、スコア1という名前を付けます。
      注:CytoNCAプラグインは、Cytoscapeソフトウェアにインストールする必要があります。これを行うには、上部のツールバーの [アプリ ]をクリックし、[ APPマネージャー ]をクリックして、検索ボックスに「CytoNCA」と入力し、返された結果の中央列にある [CytoNCA ]をオンにして、[ インストール]をクリックします。
    7. score1 を開き、name 列を最初の列に調整し、テーブル内の情報をコピーして新しいテキスト ファイルに貼り付け、score1.txt という名前を付けて保存します。
    8. Rコードを開き、score1.txtファイルがあるパスをコピーして、Rコードでsetwdがある行に貼り付けます。
    9. Rソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、score2.txtとscore2.gene.txtの2つの新しいファイルを取得します。score2.txtファイルには、すべてのプログラムスコアが中央値よりも大きかった遺伝子と、各プログラムの特定のスコアが含まれています。score2.gene.txtには、すべての項目で中央値よりも高いスコアを獲得した遺伝子が含まれています。
    10. Cytoscape で続行するには、右下のウィンドウで [AnalysisPanel 1 ] をクリックし、ウィンドウの左側にある [ ファイルからアップロード ] をクリックして score2.gene.txtを選択し、[ 開く] をクリックし、ポップアップウィンドウで [OK ] をタップします。
    11. 下部にある 「ノードの選択」 をクリックし、ポップアップ・ウィンドウで 「OK 」をクリックします。
    12. 上部のツールバーの [ファイル ]をクリックし、[ エクスポート]を選択し、[ ネットワークから画像]をクリックし、[画像サイズ]の[ズーム（%]を最大500%に調整したり、[ 透明な背景]をオンにしたり、ファイルを同じフォルダに保存して、network1という名前を付けます。
    13. 下部ウィンドウの右側のサイドバーにある [サブネットワークの作成 ]をクリックしてサブネットワークを作成し、サブネットワークを解析し、上部のツールバーの [APPs ]をクリックし、[ CytoNCA ]をクリックして [Open]をクリックします。
    14. 左側のサイドバーで、[媒介]、[近接]、[次数]、[固有ベクトル]、[ローカル平均接続性ベースの方法]、および[ネットワーク]で [重みなし ]を選択し、[ 分析]をクリックします。
    15. 解析が完了したら、右下のウィンドウで 「ノードテーブル 」をクリックし、「 エクスポート」をクリックして、score2 という名前の新しいフォルダに保存します。
    16. score2 を開き、name 列を最初の列に調整し、テーブル内の情報をコピーして新しいテキスト ファイルに貼り付け、score2.txt という名前を付けて保存します。
    17. Rコードを開き、score2.txtファイルがあるパスをコピーして、Rコードでsetwdがある行に貼り付けます。
    18. R ソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、score3.txt と score3.gene.txt の 2 つの新しいファイルを取得します。score3.txtファイルには、すべての項目の中央値よりもスコアが高かった遺伝子と、各項目の特定のスコアが含まれています。score3.gene.txtには、すべての項目で中央値よりもスコアが高かった遺伝子が含まれています。
    19. Cytoscape で続行するには、右下のウィンドウで [AnalysisPanel 1 ] をクリックし、ウィンドウの左側にある [ Upload From File ] をクリックして score3.gene.txtを選択し、[ 開く] をクリックし、ポップアップウィンドウで [OK ] をタップします。
    20. 下部にある 「ノードの選択」 をクリックし、ポップアップ・ウィンドウで 「OK 」をクリックします。
    21. 上部のツールバーの [ファイル ]をクリックし、[ エクスポート]を選択し、[ ネットワークから画像]をクリックし、[画像サイズのズーム（%]を500%に調整したり、[ 透明な背景]をオンにしたり、この手順で使用したフォルダと同じフォルダにファイルを保存して、network2という名前を付けます。
    22. 下のウィンドウの右サイドバーにある「 サブネットワークを作成 」をクリックして、サブネットワークを作成します。
    23. 上部のツールバーの [ファイル ]をクリックし、[ エクスポート]を選択し、[ ネットワークから画像]をクリックし、[画像サイズのズーム(%)]を最大500%に調整し、[ 透明な背景]をオンにして、この手順で使用したのと同じフォルダにファイルを保存し、ネットワーク3という名前を付けます。

    9. 遺伝子ID変換

      10. GOエンリッチメント分析

      1. 前の手順でid.txtしたファイルを、GO エンリッチメント分析コードと同じフォルダーに配置します。
      2. Rコード(Supplementary Coding File 5)を開き、作業ディレクトリをid.txtに設定し、GOコードが格納されているパスを設定します。
      3. R ソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、clusterProfiler、org.Hs.eg.db、プロット、ggplot2 プロット、GO エンリッチメント分析ヒストグラム、およびバブル プロットをエンリッチします。実行の完了後に、GO.txt、barplot.pdf、bubble.pdf の 3 つの新しいファイルを取得します。
        注:GO.txtは、濃縮分類(BP、CC、MF)、GO ID、GO名、遺伝子比率、バックグラウンド比率、濃縮意義p値、補正p値(p.adjust、value)、遺伝子ID(名前)、および各GOで濃縮された遺伝子の数を含む濃縮結果ファイルです。barplot.pdfはヒストグラム、バブルです。PDFはバブルプロットです。

      11. KEGG濃縮分析

      1. id.txtファイルをKEGGエンリッチメント解析コードと同じフォルダに配置します。
      2. Rコード(Supplementary Coding File 6)を開き、作業ディレクトリをid.txtとKEGGコードが格納されているパスに設定します。
      3. R ソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、clusterProfiler org を使用します。Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2 GO エンリッチメント分析ヒストグラム、バブル プロット、およびパスウェイ プロットをプロットするパッケージ。実行は、KEGG.txt、barplot.pdf、bubble.pdf の 3 つの新しいファイルの生成で完了します。
        注:KEGG.txtファイルは、パスウェイID、パスウェイの説明、遺伝子比率、バックグラウンド比率、濃縮意義p値、補正p値(p.adjust、qvalue)、遺伝子ID(名前)、および各パスウェイで濃縮された遺伝子の数を含む濃縮結果ファイルです。barplot.pdfは棒グラフ、bubble.pdfはバブルチャートです。
      4. KEGG.txtファイルでIL-17を検索します。結果は、経路が1つしかないことを示しています。パスウェイIDをコピーします。
      5. R コードを開き、IL-17 パスウェイ ID を KEGGID に貼り付け、pathview パッケージを使用してパスウェイマップにラベルを付けます。変更した R コードを実行すると、hsa04657.pathview.png と hsa04657.png の 2 つの新しいファイルが表示されます。
        注:hsa04657.pngファイルはパスウェイマップ、hsa04657.pathview.pngはラベル付きパスウェイマップ、赤でラベル付けされたものはインタラクションネットワークに存在する遺伝子です。

      12. Xiaoyao丸薬の準備

      注:使用した調製方法については、中国薬局方5を参照してください。

      1. チャイフー100g、 アンジェリカシネンシス100g、シ ロシャクヤク100g、ア トラクティロデスマクロセファラ炒め100g、 ポリアココス100g、 プレパラディックスグリチルリザエプレパラ 80g、 メンタエハーブ20gを取ります。
      2. 石臼または粉末化機を使用して、ハーブを微粉末に粉砕します。いくつかのハーブを上記の割合で組み合わせ、微粉末に粉砕して自然に混ぜ合わせます。内径180μm±7.6μmの80メッシュの薬剤ふるいを使用し、粉砕した粉末をふるいにかけます。よく混ぜます。
      3. 生姜100gを取り、水を加え、毎回2回20分間沸騰させます。濾して脇に置きます。
      4. 薬用プラークを取り、小さなほうきを生姜水に浸し、プラークにブラシをかけ、上記の粉末を取り、生姜水に振りかけ、プラークを回してすべての粉末が濡れてボール状に成形できるようにします。
        注:薬用プラークの形成は、TCMピルの調製中に不可欠なステップです。孟宗竹のほとんどは短冊状に分割され、スケルトンに織り込まれます。竹の皮、またはテンピが表面に織り込まれ、丸みを帯びます。プラークの表面は桐油で薄くコーティングし、次にニスの層でブラッシングする必要があります。これを乾燥させて水密にします。このようにして作られた丸薬は丸くて滑らかになります。
      5. 生姜水を再度ブラッシングし、粉末を振りかけ、薬剤が徐々に丸みを帯びて拡大するようにプラークを回転させます。涼しい場所に置いて乾燥させます。

      13. 動物モデルの構築

      1. 7日間の順応後、実験マウスを無作為に4つのグループ、すなわち偽手術グループ(偽、卵巣の周りの脂肪のみが除去されたグループ)とモデルグループ(OVX)からなる卵巣摘出マウスの3つのグループ、および低濃度および高濃度のXiaoyao錠剤投与グループ。
      2. 腹腔内に注射された3%ペントバルビタールナトリウム(40 mg / kg)でマウスを麻酔します。.マウスが全身の筋弛緩、深くゆっくりとした呼吸、ゆっくりとした動きを観察して、マウスが麻酔状態に入ることを確認します。手術前にマウスの目に眼軟膏を塗布します。
      3. 動物を腹臥位に置き、動物のシェーバーで背中の腎臓領域を剃ります。75%エタノールで局所消毒を行います。
      4. 腎臓の背側領域に近い両側に約1cmの縦切開を行い、筋膜を切開して筋肉と腹膜を分離します。
      5. 結紮のために子宮角の上部と卵管を見つけます。探索のために切開部に鉗子を挿入し、脂肪組織によって真っ赤なカリフラワーパターンで包まれた卵巣を見つけ、卵巣の下にらせん状に配置された卵管で卵巣を子宮角に接続します25。手術用ハサミと縫合糸で卵巣を摘出します。
      6. 偽手術群のコントロールとして卵巣近くの少量の脂肪組織を切除します。動物が意識を取り戻すまで観察してください。術後動物を完全に回復するまで別々のケージに入れます。
      7. 感染を防ぐために、術後3日間マウスにゲンタマイシンを投与します。手術後は、マウスの実際の状態に応じて、通常の食事と良好な成長環境を確保してください。創傷感染や食欲不振などの異常がある場合は、すぐに実験動物センターの指導員に相談してください。

      14. 薬の投与

      注:薬理学実験方法論26によると、使用されたヒトと動物の投与量の変換は、70 kgの成人に対して9 gのXiaoyao錠剤であり、これは1回の投与量(1回の投与の投与量)に相当します。.

      1. 低用量群と高用量群では、8匹の動物群に対してそれぞれ0.683 g/kgと2.73 g/kgを使用します。左手を使ってマウスを固定し、マウスの口が食道と一直線になるようにします。強制針を右手に持ち、マウスの口角から咽頭の後壁に沿って食道にそっと挿入します。
      2. この時点で、強制針の方向をわずかに変更して、誘発された嚥下作用を刺激してもよい。薬を注射します。これを12週間、毎日1回行います。
      3. 偽のグループとモデルグループでは、動物の体重によって決定される量で生理食塩水を1日1回、12週間投与します。
      4. マウスを頸部脱臼で安楽死させ、後肢をクリップします。手足の皮を剥いで、筋肉を大腿骨から分離します。マウスの大腿骨をEDTA脱灰液で1ヶ月間治療し、毎日新しい溶液と交換します。

      15. ヘマトキシリン-エオシン染色(HE)染色

      1. 大腿骨組織を8分間脱ワックスし、次に3分間グラジエントエタノールに入れます。流水で1分間すすいでください。
      2. ヘマトキシリン染色液を切片に滴下して組織を完全に覆い、5分間染色し、水道水で洗浄します
      3. スライド上の組織に塩酸分化溶液を加え、組織を完全に覆うようにします。組織の変色が観察されたら停止します。水道水ですすいでください。
      4. エオシン色素溶液を滴下し、組織を完全に覆い、30秒から2分間作用させます。余分な染料を流水ですすいでください。
      5. 75%無水エタノールで5分間グラジエントエタノール脱水を行い、続いて無水エタノールで5分間、脱ロウ溶液で3分間透明にします。
      6. 組織のサイズに応じて適量の中性ガムをスライドに落とし、気泡を避けてカバースリップを慎重に下げます。

      16. マイクロCTおよび免疫組織化学解析

      1. 異なるマウス群の大腿骨標本の周囲の余分な筋肉と靭帯を取り除き、サンプル組織を4%パラホルムアルデヒドに24時間固定します。
      2. 骨組織を空気乾燥させ、骨組織スキャンによるマイクロCTを行うことで、立体的なマイクロCTデータを取得します。
      3. 保存したマウスワックスブロックから、厚さ6μmの連続切片に切断し、スライスを70°C〜72°Cで30〜60分間焼きます。
      4. 8分間脱ろうし、続いて75%無水エタノール処理を5分間、無水エタノールを5分間、PBSリンスを5分間3回行います。
      5. EDTA高圧修復を15分間行い、続いてPBS洗浄を5分間3回行います。
      6. 3%の過酸化水素を組織に滴下し、室温で10分間インキュベートし、PBSで5分間3回洗浄します。
      7. 免疫組織化学ペンを使用して円を描きます。PBSウォッシュで3分間3回洗浄します。
      8. 一次抗体(抗ALPウサギpAb(1:200)、抗COL-1ウサギpAb(1:200)、抗IL-17ウサギpAb(1:275)、抗Act1(1:500)、抗IL-6ウサギpAb(1:500))を一晩染色した後、PBSバッファーを5分間3回すすぎます。
      9. 二次抗体(HRP標識Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000))を滴下し、室温で60分間インキュベートします。PBSバッファーで3分間3回洗浄します。
      10. すぐに使用できるDABで3〜5分間インキュベートし、PBSですすいでください。
      11. ヘマトキシリンを3分間再染色した後、PBSリンスを行います。
      12. 分化液を約10秒間使用し、続いてPBSリンスします。
      13. リターンブルー溶液を10秒間加え、続いてPBSリンスを加えます。
      14. 75%無水エタノール処理を5分間、無水エタノールを5分間、透明化して3分間行う。スライドのシールには中性樹脂を使用してください。

      結果

      Xiaoyaoの丸薬の有効成分と作用のターゲット
      TCMSPデータベースを検索し、経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%、薬物様特性(DL)≥0.18の基準に従ってスクリーニングを行ったところ、Xiaoyaoの錠剤に125の有効成分が存在することがわかりました。その中で、成分6、4、9、13、2、6、83、および2は、それぞれWhite Paeonia lactiflora、 Atractylodes macrocephala、 Menthae herba、Chai...

      ディスカッション

      統計によると、骨粗鬆症は米国で毎年150万件の骨折を引き起こし、その大部分は閉経後の女性に発生します27。高齢化の進展に伴い、世界の将来の大腿骨股関節骨折の大半はアジアで発生し、2050年には全世界で820万人に達すると予測されています28。骨折を予防する費用は、骨折を治療する費用とほぼ同じであり、薬の使用には必然的に何らかの副作用が?...

      開示事項

      著者は、利益相反がないことを宣言します。

      謝辞

      百瀬市科学研究技術開発プログラム(20224128)は、この作業を支援しました。著者は、原稿の編集に当たっていただいたインペリアル・カレッジ・ロンドンとYMUNのDev Sooranna博士に感謝します。YYXとZYWは、この研究に等しく貢献しました。

      資料

      NameCompanyCatalog NumberComments
      1ml SamplerGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001For anesthesia in mice
      4%polyformaldehydeBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.P1110For tissue fixation
      6-0 absorbable suture (angled needle)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06For postoperative suturing
      Absorbent cotton ballWinnerMIANQIU-500gFor sterilization and hemostasis
      Adhesive slidesJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105For tissue sectioning
      AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLFor anesthesia in mice
      Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1866Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
      C57BL/6 miceBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)For use in animal experiments
      Carbon steel surgical bladesPremier Medical Equipment Co.SP239For mouse surgery
      CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAbBIOSS ANTIBODIESbs-6202RBinds to Act1 in tissues
      Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1140For staining paraffin sections
      Collagen Type I Polyclonal antibodyproteintech14695-1-APBinds to COL-1 in tissues
      DAB Substrate kit,20xBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.DA1010For tissue color development
      Disposable surgical sheet 50*60CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777For mouse surgery
      EDTA decalcification solution (pH 7.2)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.E1171-500mlFor tissue decalcification
      Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching BufferBeyotime BiotechnologyP0100BSequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
      Environmentally friendly dewaxing clear liquidServicebioG1128-1LFor dewaxing paraffin sections
      Ethyl AlcoholCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)For dehydration of paraffin sections
      General Purpose Antibody DiluentEpizyme BiotechPS119LFor antibody dilution
      Hematoxylin Differentiation SolutionServicebioG1039-500MLFor differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
      Hematoxylin Eosin (HE) Staining KitBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1120-3*100mlFor tissue staining
      High quality stainless steel surgical knife handlePremier Medical Equipment Co.SP0088For mouse surgery
      HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-2Binds to primary antibody and amplifies signal
      IL-17A Polyclonal antibodyproteintech13082-1-APBinds to IL-17 in tissues
      IL-6 Polyclonal antibodyproteintech21865-1-APBinds to IL-6 in tissues
      Immunohistochemistry penBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)For drawing circles in immunohistochemistry
      Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2For postoperative suturing
      Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4For postoperative suturing
      Neutral BalsamBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G8590As a slice sealer
      PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Buffer for slide washing and partial solution dilution
      Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)Epizyme BiotechPS108PAvoiding non-specific binding of proteins
      Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibodyBIOSS ANTIBODIESbs-6292RBinds to alkaline phosphatase in tissues
      SalineAffiliated Hospital Youjiang Medical University For NationalitiesLHN500For animals by gavage
      Shaving/Electric clippersHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002For shaving mice
      Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse NeedlePremier Medical Equipment Co.SP784For mouse surgery
      Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)ZhuoyouyueYKNWW-10.5For mouse surgery
      Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight TipPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJFor mouse surgery
      Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm ElbowGWJ-12-55WFor use in mice by gavage
      Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)proteintechPR30002For antigen repair of paraffin sections
      Wooden dissecting board 25*16cmJP16*24For mouse surgery
      Xiaoyao pillsJiuzhitang Co.,Ltd.YPG-041For animal drug delivery
      Others
      R 4.3.1Data processing
      Cytoscape3.9.1National Resource for Network BiologyBuilding a regulatory network for traditional Chinese medicine
      ImageJ 1.54fNational Institutes of HealthImage processing for immunohistochemistry results
      Adobe Photoshop 24.0.0AdobeFor image combination
      GraphpadPrism 9.5GraphPad SoftwareStatistical analysis of data
      cellsens DimensionOLYMPUSFor slicing and photographing
      OLYMPUS BX53OLYMPUSFor HE staining and immunohistochemical section photography

      参考文献

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